组培苗的褐化

组培苗的褐化很多种类的植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类物质氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，并会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结果是严重影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。

影响褐变的因素很多，植物的种类褐基因型、外植体的来源和生理状况以及培养基的成分都会不同程度的影响褐变的程度。

一般木本植物的外植体比较容易产生褐变现象，在成年树尤其严重。

培养基中含酚过高会导致褐变，含过高浓度的无机盐和肌醇也会加剧外植体的褐变。

6-苄氨基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）也有诱导褐化的作用。

强光和高温同样会促进褐化现象。

为了防止外植体的褐变，需要选取酚类化合物含量较低的实验材料，选择无机盐含量较低，不加肌醇的培养基，并在较弱的光线或黑暗的条件中进行培养。

在培养基中加入抗氧化剂是防止褐变的有效措施。

常用的抗氧化剂有抗坏血酸（VC）、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。

可用抗氧化剂溶液预先处理外植体，或者在抗氧化剂溶液中切割和剥离外植体。

必要时还可以将几种抗氧化剂结合使用。

也可以将抗氧化剂加入到培养基中。

另一种方法是在培养基中加入0.5～1％的活性炭，吸附对生长有抑制作用的褐色醌类物质。

应当注意的是：活性炭也能吸附培养基中的激素类物质，影响茎尖的分化和生长，因此在使用活性炭的场合，需要适当提高培养基中激素的浓度。

还有一种办法是不断地（每隔1～2d）将培养物转移到新鲜的培养基上，以摆脱老培养基中褐色物质的不利影响。

在使用液体培养基的情况下，这种方法相当有效。

1.在培养基中添加活性碳可以防止植物组织自身的酚类物质排泌和变褐老化。

对形态发生和器官形成有良好作用。

一般认为，活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子，可以减少一些有害物质的影响，但是具体吸附的选择性很差，温度低时吸附力增强，温度高是吸附力减弱，甚至会解吸附。

通常使用浓度为0.5-10g/L。

加入活性炭后使培养基变黑，对一些植物诱导生根有利。

大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加些琼脂。

很细的活性炭容易沉淀，因此通常在琼脂将要凝固时，需轻轻摇动培养瓶。

2.植物外植体组织在接种时的切割面会溢泌一些酚类物质，在接触空气中的氧气后其会氧化为相应的醌类物质，产生可见的茶色、褐色或黑色，此即谓“酚污染”。

在木本植物，尤其是热带木本植物及少量草本植物中，此现象较为严重。

常用的防治措施如下：A.试用抗酚类氧化的药剂（半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。

该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。

用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间）B.适当降低培养基温度。

C.接种后先进行一定时间的暗培养。

D.及时转接入新鲜培养基。

E.选择切取外植体部位等。

经验之谈：1、易发生褐化的作物在进行组织培养时，先进行预培养（即培养在基础培养基中）2~3天（如果分泌物多，如利用花魔芋的球茎进行组织培养时，适当延长预培养时间并多次更换培养基），再培养到添加了激素的培养基上。

一）、什么叫组织培养植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的一项技术。

这项技术已在科学研究和生产上开辟了令人振奋的多个新领域，成为举世瞩目的生物技术之一。

植物组织培养，即植物无菌培养技术，是分离植物体的一部分（根、茎、叶、茎尖、花果、幼胚等），在无菌的适当条件（一定的营养、激素、温度、光照等）下培养，使其产生完整植株。

经过各国科学家80多年的辛勤探索，现在可心说几科所有的植物，其器官、组织或细胞都能离体培养成功。

大多数还能从细胞的一部分，甚至没有细胞壁的裸露的原生质体中，再生出无数的小植株。

植物组织培养技术是近代生物科学发展起来的一门新技术，是生物技术(即生物工程)的主要组成部分，是在超净的组培室中快繁脱毒即工厂化的栽培室中进行的规模生产。

自哈布兰特(G.Haberlandt) 1902年提出植物细胞的全能性，即每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，因此在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。

这个概念虽然在上世纪初已经提出，但在当时的技术条件下，在实践上并没做到。

经过80多年来无数科学家的努力，组织培养技术得到不断改进，技术趋于完善、成熟，目前细胞的全能性不但在理论上完全被证实，而且为组织培养在实践上的应用奠定了基础。

植物组织培养已遍地开花，在世界各地进展很快。

培养的材料有茎尖、根尖、花粉、花药、叶原基、愈伤组织、细胞等，已经培养成功的植物有近千种。

近40年来，植物组织培养技术得到了迅速发展，已渗透到植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等各个研究领域，成为生物学科中的重要研究技术和手段之一，并广泛应用于农业、林业、工业、医药业等多种行业，产生了巨大的经济效益和社会效益，已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。

对农业、林业、蔬菜、果树、花卉以及药用植物新品种培育、品种脱毒、提纯复壮、快速无性繁殖、扩大种苗生产等方面均产生了划时代影响。

植物组织培养在生产上利用时应注意的问题植物组织培养技术已广泛地应用于农业科研和生产，尤其是离体微繁技术和脱毒技术在很多农作物的生产中发挥了巨大的优势和作用，实现了种苗的产业化，取得了巨大的经济效益和社会效益。

但是，植物组培技术由于其特殊的繁殖方式和较高的技术要求，在生产上应用时仍存在一些不足之处，如植物易发生变异，培养过程中的污染，生产成本较高等问题。

因此，在用于生产时，应高度注意以下几个问题：一、遗传稳定性问题遗传稳定性问题，即保持原良种特性问题。

虽然植物组织培养中可获得大量形态、生理特性不变的植株，但是通过愈伤组织而繁殖出的苗木，有可能出现一些变异，其中少数是有益变异，大多数是不良变异。

诸如观花植物不开花、或花小或花色不正。

果树植物不结果、或结果小或结品质差的果，或抗性下降以及产量降低等问题，给生产造成损失，为此必须给予高度重视。

组织培养中出现变异的频率相当高，且不能逆转，有的变异率高达40%~60%。

组织培养中的变异大多不能遗传，其变异多是后成的。

（一）影响遗传稳定性的因素1.基因型：基因型不同，发生变异的频率也不同。

据报道，在玉簪中，杂色叶培养的变异频率为43%，而绿色叶仅为1.2%。

嵌合体植株通过组培，其嵌合性更大，单倍体和多倍体变异大于二倍体。

2.继代次数：继代培养时间和次数是造成变异的关键因素，一般植物组织培养随着继代时间的延长和继代次数的增加，染色体变异频率增加，植株变异的可能就越大。

3.发生方式：一般从茎尖、茎段、体细胞胚发生的植株不变异或变异率极低，而通过愈伤组织诱导的不定芽和悬浮培养，再生苗变异率较高，应尽量避免用这两种方式大量去繁殖名贵品种和珍稀植物。

（二）提高遗传稳定性，减少变异发生的措施①减少继代次数，缩短继代时间；②定期检查，剔除形态异常和生理异常苗；③使用生长点、胚状体方式扩大繁殖；④减少培养基中诱变因素如一些化学物质；⑤尽量促进再生植株开花结实，以检查其生物学性状和经济性状是否稳定。

二、玻璃化问题玻璃化是植物组织培养中一个严重影响繁殖速度和种苗质量的问题。

它是一种生理病害，引起茎叶半透明、淡绿色、水浸状等现象，出现玻璃化的茎叶，叶表完全无蜡质，而酯和极性化合物较高，导致细胞丧失持水能力，细胞内水分大量外渗，增加了植株水分的散失和蒸腾，极易引起植株死亡，且不能移栽成活。

在石竹、菊花、满天星等的组织培养中常发生。

可采取以下方法解决：①增加琼脂浓度，减少水分吸收；②增加蔗糖含量及加入渗透剂，较低培养基水势，减少水分吸收；③改变培养基中的供氮形态，适当减少铵态氮而提高硝态氮用量；④增强容器通风，降低瓶内湿度及乙烯含量；⑤增强光照，适当降低培养室内温度；⑥在培养基中添加其它物质，。

在培养基中加入间苯三酚或ABA或活性炭等均有助于降低玻璃化的发生。

三、污染问题污染是指在培养过程中由于真菌、细菌或病毒的浸染，而使培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。

在植物组织培养过程中，污染是不可避免的，但可以把污染控制在最低限度内。

污染通常是由于环境不洁、培养基和培养材料消毒不彻底、操作过程不慎、操作人员或工具带菌而引起。

组培污染既影响了繁殖速度，又增加了生产成本，严重时可造成培养材料的丢失，给组培繁殖带来较大的损失。

为了减少损失，提高工作效率，必须在每一个操作环节均注意防止污染的发生。

在组织培养实验室中，污染的病原分为细菌和真菌两大类，根据污染的病原和种类，可采取以下措施来预防：①保持干净整洁的环境；②用洁净的培养容器；③培养基的彻底灭菌；④严格规范且熟练的无菌操作；⑤培养材料（外植体和基础母瓶）的严格筛选和彻底的表面消毒；⑥污染物的正确处理（高压灭菌后再倒弃）能有效防止污染传播蔓延。

四、成本控制问题植物组织培养技术是农业高新技术的重要内容，已从实验室发展到组培苗的商业化生产。

与常规无性繁殖的扦插苗或嫁接苗相比，组培苗虽然在质量、数量上有很大的优越性，但需一定设备，要有一定的专业技术人员和训练有素的操作工人，消耗一定的能源和药品，因此生产成本较高。

事实上，高成本已经成为制约组培快繁技术发展和组培市场开发的限制因素。

在生产实践中，对成本控制问题要予以高度重视，控制成本的有效途径有：①节省水电开资，采样自然光培养，降低能耗；②提高工作效率，节约人工工资；③充分发挥现有设备的生产潜力，减少设备投资，延长使用寿命；④降低玻璃器皿损耗，采用廉价的代用品；⑤降低污染率，减少次品，杜绝废品；⑥提高繁殖系数、生根率和移栽成活率；⑦降低培养基成本，利用简化的培养基，用自来水代替蒸馏水，食用白糖代替蔗糖。

.植物组织培养的前景展望植物组织培养研究与应用是20世纪科技进步的重大成果之一，为研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好的实验材料和有效途径。

植物组织培养方法不断提高的同时，也相应拓宽了其应用范围，现已为人们广泛的应用在各个领域。

由于组织培养在人工控制的条件下进行，容易掌握花芽分化和开花成因；通过胚胎培养，能够得到杂种或自交种；通过分离单倍体细胞，能培育纯合的二倍体优良品系；提高育种多样性的同时缩短了育种时间；通过突变体筛选，提高植物的品质，增强抗逆境胁迫能力，扩大植物的生长范围；将体细胞冷藏在低温下，建立基因库，达到保存物种的目的；获得药用价值高和工业生产所需要的次生产物，加快药物生产的时间并且减少了单纯依靠天然植物的被动性。

植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将日臻完善。

但是长期来，组织培养多数还停留在试验研究上，在应用生产方面还有一定不足因此今后需要有一套可行的措施，将研究成果转化为有经济价值的大规模生产实践。