DNA甲基化分析方法
二代测序检测甲基化的方法
二代测序检测甲基化的方法二代测序是一种高通量测序技术，可以快速、精准地分析DNA序列。
甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，可以对基因表达和细胞功能产生重要影响。
因此，通过二代测序检测甲基化状态成为了研究人员关注的焦点。
本文将介绍基于二代测序的甲基化检测方法。
一、甲基化的检测原理甲基化是指在DNA分子中加入甲基基团，可以影响DNA的结构和功能。
为了检测DNA中的甲基化状态，研究人员通常采用亚硫酸氢盐处理和二代测序相结合的方法。
亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶不受影响。
通过测序分析DNA中的U和C的比例，就可以确定DNA中的甲基化状态。
二、甲基化检测的实验流程1. DNA提取：从待检测的细胞或组织中提取DNA样本，保证样本的纯度和完整性。
2. 亚硫酸氢盐处理：将DNA样本与亚硫酸氢盐溶液反应，将未甲基化的C转化为U。
3. 文库构建：将经过亚硫酸氢盐处理的DNA样本进行文库构建，包括DNA片段的断裂、连接、文库扩增等步骤。
4. 二代测序：使用二代测序技术对DNA文库进行高通量测序，获得原始测序数据。
5. 数据分析：对原始测序数据进行质控、去除低质量序列和接头序列，然后将剩余的序列与参考基因组进行比对。
6. 甲基化位点鉴定：根据比对结果，统计序列中U和C的比例，确定甲基化位点的甲基化水平。
三、甲基化检测的数据分析甲基化检测的数据分析是整个过程中最关键的一步。
主要包括质控、比对、甲基化位点鉴定和甲基化水平分析等。
1. 质控：对原始测序数据进行质量控制，去除低质量的序列以及接头序列。
这一步骤可以保证后续分析的准确性和可靠性。
2. 比对：将质控后的序列与参考基因组进行比对。
通过比对可以确定序列的位置信息，为后续的甲基化位点鉴定提供基础。
3. 甲基化位点鉴定：根据比对结果，统计序列中U和C的比例。
如果某个位点的U和C比例明显偏差，即可判定该位点存在甲基化。
4. 甲基化水平分析：根据甲基化位点的甲基化水平，可以分析不同位点的甲基化状态。
DNA甲基化数据分析的基本方法与工具推荐
DNA甲基化数据分析的基本方法与工具推荐DNA甲基化是指DNA分子上的甲基基团（CH3）与DNA碱基（尤其是胞嘧啶）之间的化学键结合。
DNA甲基化是真核生物中一种重要的表观遗传修饰方式，对基因组稳定性和正常生理功能发挥至关重要的作用。
DNA甲基化水平的异常变化与许多疾病的发生发展密切相关，包括癌症、心血管疾病、精神疾病等。
因此，对DNA甲基化数据进行分析是理解这些疾病的发生机制和探索潜在治疗策略的关键步骤。
本文将介绍DNA甲基化数据分析的基本方法与一些常用的工具推荐。
首先，DNA甲基化数据分析的基本方法涵盖了数据预处理、甲基化位点鉴定和差异分析三个方面。
数据预处理是DNA甲基化数据分析的必要步骤之一，它的主要目的是将原始数据进行质量控制和归一化处理，去除实验误差和技术偏差。
常见的数据预处理方法包括：首先，质量控制，即将低质量的碱基读数过滤掉，以提高数据的准确性；其次，归一化处理，即将不同样本之间的技术偏差进行校正，以便后续的统计分析。
甲基化位点鉴定是DNA甲基化数据分析的关键步骤，它的主要目的是确定每一个DNA碱基上甲基化的程度。
常见的甲基化位点鉴定方法包括：首先，基于BS-seq（全基因组甲基化测序）的方法，通过测定甲基化位点与非甲基化位点的比值来鉴定甲基化位点；其次，基于甲基化特定酶切及高通量测序的方法，利用甲基化特定酶切割非甲基化DNA，然后通过高通量测序鉴定甲基化位点。
差异分析是DNA甲基化数据分析的核心步骤，它的主要目的是比较不同样本之间的甲基化差异。
常见的差异分析方法包括：首先，基于碱基的比对方法，通过比较不同样本的DNA序列，确定不同样本之间的甲基化差异；其次，基于甲基化位点的比较方法，通过比较甲基化位点的甲基化水平，确定不同样本之间的甲基化差异。
除了基本方法之外，还有一些常用的DNA甲基化数据分析工具推荐，这些工具可以帮助研究人员更高效地完成DNA甲基化数据分析工作。
首先，Bismark是一个常用的DNA甲基化分析工具，它可以识别全基因组的甲基化位点，并提供可视化和统计性的差异分析结果。
酶转化法 dna甲基化测序
酶转化法（Enzymatic Conversion）在DNA甲基化测序中是一种常用的技术，用于将DNA样本中的甲基化胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）转变为可检测的标记。
这是因为自然状态下的甲基化胞嘧啶在进行测序时很难直接检测到。
通过酶转化法，可以使得甲基化的胞嘧啶转变为一种可以被测序机器识别的标记，从而进行分析。
这个过程通常涉及以下几个步骤：
1. DNA提取：首先从细胞或组织中提取DNA。
2. 酶处理：使用特定的酶（如bisulfite 酶）处理DNA。
这种酶能够将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶（uracil），而甲基化的胞嘧啶则保持不变。
3. PCR扩增：对处理后的DNA进行PCR（聚合酶链反应）扩增，以便进行分析。
4. 测序：扩增后的DNA可以进行高通量测序，此时，甲基化的胞嘧啶会显示出特定的标记，如胞嘧啶转变为尿嘧啶。
5. 数据分析：通过生物信息学工具分析测序数据，确定DNA的甲基化模式。
酶转化法是DNA甲基化研究中的一个关键步骤，它使得研究者能够更好地理解基因表达调控和表观遗传学中的甲基化机制。
这些信息对于研究各种生物学过程，如发育、疾病发生和细胞分化等，都具有重要意义。
dna甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法引言DNA甲基化是一种常见的基因表达调控方式，可以影响基因的转录和表达，以及细胞分化和发育等生物学过程。
因此，对DNA甲基化状态的准确检测和分析对于理解疾病发生发展机制以及预防和治疗疾病具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对它们的原理和应用进行详细描述。
1. 甲基化特异性PCR（MSP）甲基化特异性PCR（Methylation Specific PCR，MSP）是一种经典的DNA甲基化检测方法。
该方法通过特殊的PCR反应体系和引物设计，可以区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
具体步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•甲基化处理：对DNA进行化学甲基化处理，使甲基化的嵌合基对应DNA序列得以保留，非甲基化的嵌合基对应DNA序列则被转化为不同的碱基。
•PCR反应：使用特异性引物对甲基化和非甲基化的DNA片段进行扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据PCR产物的大小和形态进行甲基化状态的判断。
MSP方法具有操作简便、快速、经济等优点，已广泛应用于DNA甲基化的研究和临床诊断中。
2. 甲基化敏感限制性内切酶PCR（MSRE-PCR）甲基化敏感限制性内切酶PCR（Methylation Sensitive Restriction Enzyme-PCR，MSRE-PCR）是一种基于限制性内切酶的DNA甲基化检测方法。
该方法利用甲基化敏感的限制性内切酶和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，然后通过PCR扩增来检测DNA甲基化状态。
步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•限制性内切酶切割：使用甲基化敏感和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，甲基化酶切割后产生线性DNA片段，非甲基化酶切割后产生环状DNA片段。
•PCR反应：对内切酶切割后的DNA片段进行PCR扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据不同大小的PCR产物来判断DNA的甲基化状态。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。
大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。
下面大家介绍一些常用的方法。
特异位点的甲基化检测甲基化特异性PCR(MS-PCR)这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。
在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。
在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。
若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。
这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。
不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。
另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。
亚硫酸氢盐处理+测序这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。
它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。
这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。
扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。
若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。
这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。
这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。
dna甲基化检测方法
dna甲基化检测方法
DNA甲基化检测是研究基因组表观遗传调控的重要方法之一，常用于癌症、神经系统疾病、发育障碍等研究。
常见的DNA甲基化检测方法包括：
1. 甲基化特异性限制酶消化（Methylation-Specific Restriction Enzyme Digestion）：通过使用甲基化特异性限制酶，可以选择性地切割未甲基化或甲基化的DNA片段，从而区分甲基化和未甲基化的DNA区域。
2. 亲和富集（Methyl-CpG binding domn-based Pull-down Assay）：通过亲和层析方法，利用DNA结合域能够结合甲基化的CpG位点的蛋白质，将甲基化的DNA片段富集出来，再通过测序或PCR等方法进行分析。
3. 甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）：通过使用甲基化特异性引物，在Bisulfite处理后的DNA上进行PCR，从而区分甲基化和未甲基化的DNA 片段。
4. 甲基化敏感限制酶消化和PCR（Methylation-Sensitive Restriction Enzyme Digestion and PCR）：通过使用甲基化敏感限制酶和甲基化特异性引物，在Bisulfite处理后的DNA上进行PCR，可以区分不同的甲基化状态。
5. 甲基化芯片技术（Methylation Array）：采用芯片技术，可以同时检测大量的DNA甲基化位点，进行全基因组水平的甲基化分析。
以上方法各有优缺点，研究人员可以根据具体实验目的和
需求选择合适的方法进行DNA甲基化检测。
DNA甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰方式，通过甲基化在DNA分子上的加合，可以调节基因表达和遗传信息传递。
因此，DNA甲基化检测在遗传学研究、疾病诊断和治疗中具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对其原理、优缺点进行详细讨论。
1.甲基化特异性PCR法（MSP）甲基化特异性PCR法是一种利用特异性甲基化酶、限制性内切酶或碱性处理剂以及增强法进行检测的方法。
该方法的原理是通过甲基化特异性的酶对DNA进行酶切，使得未甲基化的DNA片段与经PCR增强的片段长度不同，从而通过凝胶电泳进行检测和分析。
优点是简单、快速且成本低廉，但缺点是需要设计和合成特异性甲基化酶。
2.基于测序的甲基化特异性分析基于测序的甲基化特异性分析方法主要有甲基化抑制PCR法（MIP）和甲基化敏感限制性内切酶测序法（MSRE-Seq）等。
甲基化抑制PCR法是通过特殊的多聚合酶在特定温度下对未甲基化的DNA完成增长，而甲基化DNA则无法进行扩增，从而区分甲基化和未甲基化的位点。
甲基化敏感限制性内切酶测序法则是首先使用甲基敏感限制性内切酶对DNA进行切割，然后进行测序分析。
这两种方法具有较高的精确性和灵敏性，但测序成本较高。
3. 甲基化特异性酶切测序法（MRE-Seq）甲基化特异性酶切测序法是一种通过甲基化特异性酶切和测序进行检测的方法。
该方法首先使用甲基敏感限制性内切酶将DNA切割成小片段，并在切割位点的两端加入特异性的测序引物，然后进行PCR增强和高通量测序。
通过测序得到的序列和甲基化位点的分布情况可以对DNA甲基化进行精确的定量和定位分析。
甲基化特异性酶切测序法具有高通量、高灵敏度和高分辨率等优点，但仍存在PCR偏差等问题。
4.甲基化微阵列甲基化微阵列是一种通过DNA的甲基化特异性杂交来检测和定量DNA 甲基化水平的方法。
该方法利用DNA片段与微阵列芯片上的探针发生特异性杂交，然后通过荧光信号检测和分析。
单细胞DNA甲基化测序数据处理流程与分析方法
单细胞DNA甲基化测序数据处理流程与分析方法1. 内容简述单细胞DNA甲基化测序是一种高分辨率的基因表达和表观遗传学研究方法，它允许研究者检测单个细胞的DNA甲基化状态。
这种技术为理解细胞异质性、基因调控机制以及疾病发展中的表观遗传变化提供了有力工具。
样本制备：首先，从生物体中提取单细胞，然后利用亚硫酸盐转化技术将DNA中的甲基化修饰转换为羟基化修饰，以供后续测序。
文库构建：转化后的DNA被随机打断成小片段，并加上特定的接头序列，以便进行PCR扩增和测序。
测序：构建好的文库被加载到测序芯片上，通过高通量测序技术进行测序。
数据分析：获得的原始数据需要经过一系列清洗、比对、标准化等处理步骤，以获得高质量的甲基化数据集。
甲基化状态分析：识别每个细胞中的甲基化位点，并比较不同细胞之间的甲基化差异。
差异甲基化分析：识别在不同实验条件下（如疾病状态、环境压力等）甲基化模式的差异。
生物信息学分析：使用统计软件和算法对数据进行深度挖掘，发现与特定生物学过程或疾病相关的甲基化模式。
通过对这些数据的综合分析，研究者可以揭示细胞功能的动态变化、基因表达的调控机制以及表观遗传学在疾病发生中的作用。
1.1 单细胞DNA甲基化测序技术简介简称SCDBS)是一种高通量、高分辨率的分析方法，用于研究单个细胞中基因组水平的DNA甲基化状态。
该技术通过测序和分析单细胞中的甲基化位点序列，揭示了基因表达差异、发育过程、疾病发生机制等方面的信息。
随着高通量测序技术的快速发展，SCDBS已经成为生物学研究的重要工具之一。
SCDBS的主要流程包括：样品准备、文库构建、测序、数据处理和分析等步骤。
需要将单细胞样本进行处理，如去除血浆等杂质，保证测序结果的准确性。
通过构建文库来存储待测的DNA片段，通常采用Illumina测序平台进行高通量测序。
对测序数据进行质量控制和过滤，以去除低质量序列和伪迹。
利用生物信息学工具对数据进行处理和分析，包括聚类分析、差异基因表达分析、甲基化模式比较等。
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· 489 ·《生命的化学》２００８年２８卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００８，２８（４）● 技术与方法文章编号： １０００－１３３６（２００８）04－0489-03ＤＮＡ甲基化分析方法肖正中 邬苏晓（韶关学院英东生物工程学院，韶关 ５１２００５）摘要：ＤＮＡ甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一。
甲基化分析的方法多且研究难度大，各种方法都有其一定的优势和不足。
本文综述了基因组ＤＮＡ甲基化和特定ＤＮＡ片段甲基化状态分析方法新进展，为研究者提供参考。
关键词：ＤＮＡ甲基化；ＣｐＧ岛；表观遗传学中图分类号：Ｑ３３４收稿日期：２００８－０４－１２作者简介：肖正中（１９７２－），男，博士，讲师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｚｚｗｓｘ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；邬苏晓（１９７２－），女，硕士，讲师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｘｗａ４０３５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍＤＮＡ甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。
甲基化通常发生在胞嘧啶的Ｃ５位，形成５－甲基胞嘧啶（５ｍＣ），甲基化的胞嘧啶多位于ＣｐＧ岛上。
ＣｐＧ岛是ＣｐＧ二联核苷富集区域，ＣＧ含量大于５０％，长约２００￣５００ ｂｐ。
哺乳动物ＤＮＡ甲基化的模式只有５ｍＣ这一形式，真核生物中大约２％￣７％的胞嘧啶被甲基化修饰。
１． 基因组ＤＮＡ甲基化分析方法早期的基因组ＤＮＡ甲基化分析技术，如ＳｓｓＩ甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等，已不能满足现代表观遗传学研究的需求。
近年来常用的基因组甲基化分析方法有以下两种。
１．１ 甲基化敏感扩增多态性技术 甲基化敏感扩增多态性（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＭＳＡＰ）技术由Ｒｅｙｎａ－ｌóｐｅｚ等报道，并被用于检测双相型真菌的ＤＮＡ甲基化［１］，它 是在扩增片段长度多态性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ， ＡＦＬＰ）技术的基础上建立起来的。
其基本程序是：提取高质量基因组ＤＮＡ，分别用ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩＩ，ＥｃｏＲＩ／ＭｓｐＩ两组酶组合对基因组ＤＮＡ进行双酶切，并连上相应的限制性内切酶的接头，然后以接头序列设计的预扩增引物，进行ＰＣＲ扩增。
扩增产物稀释后，再加入带有选择性碱基的引物，进行第二次ＰＣＲ扩增，扩增产物变性后在６％的序列胶上电泳，最后采用银染或同位素放射自显影方法处理序列胶，统计和分析ＤＮＡ条带。
这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用［２－６］。
ＭＳＡＰ技术相对其他测定ＤＮＡ甲基化程度的技术有如下优点：（１）不需知道被测ＤＮＡ的序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于ＤＮＡ序列背景知识未知的生物。
（２）操作相对简便，在ＡＦＬＰ技术体系的基础无需改进，即可操作。
（３）可在全基因组范围检测ＣＣＧＧ位点的胞嘧啶甲基化变化。
ＭＳＡＰ技术的局限性在于不能完成非ＣＣＧＧ位点的胞嘧啶甲基化。
１．２ 高效液相层析及相关方法 高效液相层析（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ＨＰＬＣ）能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：先将ＤＮＡ样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算５ｍＣ／（５ｍＣ＋５Ｃ）的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。
Ｆｒａｇａ等［７］运用高效毛细管电泳法（ｈｉｇｈ ｐｅｒ－ｆｏｒｍａｎｃｅ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＨＰＣＥ）处理ＤＮＡ水解产物确定５ｍＣ的水平，相比ＨＰＬＣ，ＨＰＣＥ更简便、快速、经济。
ＨＰＬＣ及ＨＰＣＥ测定基因组整体ＤＮＡ甲基化水平的敏感性均较高。
２． 特定ＤＮＡ片段甲基化检测方法２．１ 亚硫酸氢盐预处理法 （１）甲基化特异性ＰＣＲ。
甲基化特异性ＰＣＲ（ＭＳＰ）是Ｈｅｒｍａｎ等［８］首先提出的一种检测基因组ＤＮＡ甲基化水平的常用方法。
该法是将ＤＮＡ经亚硫酸氢钠处理，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。
在ＰＣＲ反应· 490 ·《生命的化学》２００８年２８卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００８，２８（４）●Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ时，设计两套不同的引物对：一对引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化ＤＮＡ链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化；另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化ＤＮＡ链设计，若用该对引物能扩增出片段，说明该检测位点没有甲基化。
两对引物都具有很高的特异性，与未经处理的ＤＮＡ序列无互补配对。
ＭＳＰ引物覆盖序列中必须含有一个或一个以上的ＣｐＧ岛，以保证引物的特异性，经克隆测序就检测出引物所覆盖序列的甲基化位点，引物覆盖序列中ＣｐＧ岛所占比例越高，甲基化ＤＮＡ检出率越高。
该法不足之处在于：引物的选择和设计非常关键，否则易导致假阳性；如果亚硫酸氢钠对ＤＮＡ处理不完全，也易导致假阳性。
可通过限制性内切酶酶解法检验ＰＣＲ产物作进一步判断。
（２）变性高效液相色谱法。
Ｏｅｆｎｅｒ等［９］提出变性高效液相层析（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＨＰＬＣ， ＤＨＰＬＣ）用于单核苷酸和ＤＮＡ分析。
邓大君等［１０］将该法改进并与ＰＣＲ联用建立了一种检测甲基化程度的分析方法，其原理是将经重亚硫酸氢钠处理的ＤＮＡ产物进行差异性扩增，由于原甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢钠处理被保留，因此在随后的ＰＣＲ扩增时，其变性温度也相应上升，使ＰＣＲ产物在色谱柱中保留的时间明显延长，从而判定出ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序列甲基化状况。
（３）联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法。
联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ， ＣＯＢＲＡ）原理：先对样本ＤＮＡ行亚硫酸氢钠处理后，ＰＣＲ扩增目的片段，随后用限制性内切酶消化，此酶识别序列中需包含ＣＧ序列，如ＢｓｔＵＩ（ＣＧＣＧ）。
若其识别序列中的Ｃ发生完全甲基化（５ｍＣＧ５ｍＣＧ），则ＰＣＲ扩增后保留为ＣＧＣＧ，ＢｓｔＵ Ｉ能够识别并进行切割；若待测序列中，Ｃ未发生甲基化，则ＰＣＲ后转变为ＴＧＴＧ，ＢｓｔＵＩ识别位点丢失，不能进行切割。
这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例［１１］。
Ｂｒｅｎａ等［１２］联用ＣＯＢＲＡ和Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ对酶切产物进行直接分析，使ＣＯＢＲＡ的定量更快速、准确且无放射性污染。
该法的优点是：方法相对简单，不需预先知道ＣｐＧ位点及样本序列；可进行甲基化水平的定量研究；需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。
缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品ＤＮＡ中甲基化存在的可能；由于酶和ＰＣＲ的使用，序列分析受到限制。
（４）甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法。
甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）可用于快速判断ＤＮＡ片段中某些具体位点的甲基化状况［１３］。
其原理：样本ＤＮＡ经亚硫酸氢钠修饰，ＰＣＲ扩增目的片段，产物电泳分离后作为Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ模板。
分别针对所检测的ＣｐＧ位点设计上游引物，使３＇－端引物紧邻Ｃ。
然后将模板、引物、Ｔａｑ酶及３２Ｐ标记的ｄＮＴＰ混合，进行单核苷酸延伸反应。
若所检测的ＣｐＧ位点发生甲基化，则３２Ｐ标记的Ｃ掺入到ＰＣＲ产物中；反之，未甲基化掺入的则为Ｔ。
再电泳分离产物，成像。
根据某一ＣｐＧ位点的Ｃ／Ｔ信号强度比，可定量其甲基化程度。
也可不经电泳，ＰＣＲ产物直接转移到尼龙膜上，成像后即可得到所测多个ＣｐＧ位点的平均甲基化程度［１４］。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ可快速定量多个ＣｐＧ位点的甲基化程度，但它不能对较长的序列进行全面的考察，且检测多个ＣｐＧ位点时，需设计较多的引物。
２．２ 联合甲基化敏感的限制性内切酶法 （１）甲基化敏感的限制性内切酶ＰＣＲ。
甲基化敏感的限制性内切酶ＰＣＲ（ＭＳＲＥ－ＰＣＲ）原理为：基因组ＤＮＡ经甲基化敏感内切酶广泛消化后，再设计与所选基因特异性匹配的引物，经多重ＰＣＲ扩增（未被切割的片段不被识别），即可同时、快速检测多基因的ＤＮＡ甲基化状态［１５］。
该法用很小量的ＤＮＡ标本即可检测多基因的甲基化状态，且可用于异质性标本，提示其可被进一步发展成为高通量的临床样本分析方法。
（２） ＣＯＭＰＡＲＥ－ＭＳ。
Ｙｅｇｎａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ等［１６］报道了将ＭＢＤ柱层析法与甲基化敏感的限制性内切酶法（ＭＳ－ＲＥ）联用的ＣＯＭＰＡＲＥ－ＭＳ，能快速、敏感地检测ＤＮＡ甲基化情况，可用于临床标本检测，作为早期诊断和肿瘤分级的方法学工具。
其过程是：用内切酶切取待测片段，再用甲基化敏感的限制性内切酶消化，消化产物经ＭＢＤ柱捕获含有甲基化区的片段，最后通过实时ＰＣＲ扩增进行定量分析。
这种方法联合运用了ＭＢＤ柱层法及ＭＳ－ＲＥ法，避免了单用ＭＢＤ引起的非特异性捕获及单用内切酶时不完全消化所致的假阳性。
此法简便、快速、特异、敏感。
缺点是需要使用限制性内切酶，因此不同程度· 491 ·《生命的化学》２００８年２８卷４期ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００８，２８（４）● 技术与方法地受到内切酶识别位点的限制。
２．３ 探针杂交法 （１）甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法。
甲基化特异性多重连接酶依赖性探针扩增法（ＭＳ－ＭＬＰＡ）法是根据ＭＬＰＡ技术发展起来的。
其原理是：首先，应用ＭＳ－ＭＬＰＡ探针（探针的靶基因识别序列中一定要包含一个甲基化敏感的酶限制位点）和标本ＤＮＡ进行杂交使之结合形成ＤＮＡ－探针复合物，并用连接酶将探针连接，然后，ＤＮＡ－探针复合物与甲基化敏感的限制性内切酶结合并被消化，最后进行ＰＣＲ扩增、电泳。
如果这个ＤＮＡ标本的ＣｐＧ位点被甲基化，一个ＭＬＰＡ产物将会被检测到；如果这个位点没有被甲基化，则这个复合物将被消化而不会产生产物［１７］。
该方法敏感、高效，与目前常用的甲基化检测方法相比具有以下优点：只需要极微量ＤＮＡ标本就可以一次检测多种基因的甲基化水平；简便易行，可进行批量检测；ＭＬＰＡ可以进行定量检测；可用于石蜡包埋标本的检测。
（２） ＤＮＡ微阵列法。
Ｙａｎ等［１８］将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于ＤＮＡ甲基化检测中，极大的提高了检测的效率。
ＤＮＡ微阵列， 又称ＤＮＡ芯片或基因芯片，是基于杂交的寡核苷酸微阵列法产生的，是一种在基因组中寻找新位点的方法，包括用于整个基因组范围内扫描的差异甲基化（ＤＭＨ）杂交和用于检测某个位点的甲基化特异性的微阵列（ＭＳＯ）。
前者类似于ｍＲＮＡ表达谱或ｃＤＮＡ微阵列，是ＣｐＧ岛微阵列；后者类似于寡核苷酸微阵列，是针对ＣｐＧ二核苷酸位点的甲基化特异性寡核苷酸微阵列。