发光免疫分析技术
化学发光免疫标记分析技术基本原理
化学发光免疫标记分析技术基本原理化学发光免疫标记分析技术主要包括两个步骤：标记物制备和检测过程。
在标记物制备阶段，通常使用特定的荧光染料或荧光标记物来与待检测物质进行反应，并形成稳定的标记物-待检测物质复合物。
而在检测过程中，通过光学系统激发和采集标记物产生的化学发光信号，从而获得待检测物质的信息。
1.标记物制备：在化学发光免疫标记分析技术中，常用的标记物包括酶标记物和荧光标记物。
酶标记物的原理是将特定酶与待检测物质结合，并通过酶反应产生化学发光信号。
例如，常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
而荧光标记物的原理则是将特定荧光染料或荧光物质与待检测物质发生物理或化学反应，从而产生荧光信号。
荧光标记物具有高灵敏度、高分辨率和多颜色检测等优点。
2.检测过程：在化学发光免疫标记分析技术中，通常采用放射性同位素或者化学合成的光感受物质作为化学发光底物。
这些光感受物质在一定条件下与酶标记物或荧光标记物发生反应，产生化学发光信号。
这种化学发光反应通常是一种酶催化反应，通过酶的催化作用将底物转化为高能态的中间产物，进而使中间产物与发光底物反应产生化学发光。
1.样品制备：将待检测的样品进行适当处理和净化，以去除干扰物并保留待测物质。
2.标记物制备：选择适当的酶标记物或荧光标记物，并将其与待检测物质结合，形成稳定的复合物。
3.反应过程：将标记物与样品中的待测物质进行反应，形成标记物-待检测物质复合物。
4.分离与清洁：根据实验需求，通过特定的分离技术分离出标记物-待检测物质复合物，并清洁除去未结合的杂质。
5.光学系统激发和采集信号：将分离出的标记物-待检测物质复合物放置于化学发光仪或荧光显微镜等设备中，通过特定的光源激发标记物产生的化学发光或荧光信号，并通过相应的光学系统采集和记录信号。
6.数据分析和结果解读：通过对采集得到的化学发光或荧光信号进行数据处理和分析，根据标定曲线或标准样品，计算出待检测物质的含量或其它相关信息，并根据实验目的对结果进行解读。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
优化技术操作流程，降低对专业人员的依赖，提高检测的便捷性和 普及性。
开发新型标记物
研究开发更多种类的化学发光标记物，拓展该技术的应用范围，满足 更多不同检测需求。
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放射免疫标记技术
利用放射性核素标记抗体或抗原，通 过放射性信号检测，常用的有放射免 疫分析法。
化学发光免疫标记技术
利用化学发光物质标记抗体或抗原， 通过化学发光信号检测，常用的有化 学发光免疫分析法。
免疫标记技术的原理
抗原-抗体反应
信号放大
免疫标记技术的基本原理是抗原 和抗体之间的特异性结合反应。 标记物（抗体或抗原）与待测样 本中的目标抗原或抗体结合，形 成标记的抗原-抗体复合物。
02
化学发光反应原理
化学发光反应的分类
偶合反应
01
通过两个化学反应的偶合，将化学能转变为光能。
氧化还原反应
02
通过电子的得失，将化学能转变为光能。
化学发光复合反应
03
通过化学反应将能量传递给另一物质，使其激发并发出光子。
化学发光反应的机制
激发态的形成
反应物吸收能量后跃迁至激发态。
能量传递与光子的发射
抗体标记
抗体选择
选择与目标抗原特异性结合的抗体，确保抗 体的纯度和特异性。
抗体标记技术
采用荧光染料、酶、同位素等标记抗体，以 便后续检测和信号放大。
标记效率与质量控制
对标记后的抗体进行质量评估和控制，确保 标记效率和稳定性。
免疫反应
1 2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加样
将待测样本、标记抗体和抗原加入反应体系中， 进行免疫反应。
激发态的反应物将能量传递给另一物质，使其跃迁至激发态并释放 光子。
化学发光免疫分析技术在临床诊断中的应用
化学发光免疫分析技术在临床诊断中的应用化学发光免疫分析技术是一种基于特定抗体和荧光标记物的检测方法，通过测量样品中的荧光强度，可对特定生物分子（如蛋白质、激素、抗体等）进行定量检测。
这种技术广泛应用于医学领域，特别是在临床诊断和药物研发方面，发挥着重要的作用。
一、化学发光免疫分析技术的原理与优势化学发光免疫分析技术是基于光致化学反应的原理，当样品中存在特定生物分子与荧光标记物结合时，激发荧光标记物时产生能量，并在光致化学反应的过程中释放荧光。
通过检测荧光信号的强度，可以测量样品中特定生物分子的含量。
与传统的ELISA（酶联免疫吸附测定法）相比，化学发光免疫分析技术具有很多优势。
首先，其检测灵敏度高，可以检测到非常低浓度的生物分子，能够提高疾病诊断的准确性。
其次，化学发光免疫分析技术具有高度的特异性，可以仅检测到特定的生物分子，而不受其他交叉反应的影响。
此外，该技术快速、可靠，自动化程度高，具有批量分析的能力，大大提高了分析效率和精度。
二、化学发光免疫分析技术在临床诊断中的应用非常广泛，例如：1. 甲状腺功能检测甲状腺功能检测是临床常用的一项检查，常用T3、T4、TSH等指标来确定甲状腺功能的异常。
化学发光免疫分析技术可以用来准确测量这些指标的含量，从而确定甲状腺功能异常的类型和严重程度。
2. 肝功能检测肝功能检测可通过检测ALT、AST、ALP、GGT等多种指标来确定肝功能异常。
使用化学发光免疫分析技术，可以快速、准确地测量这些指标的含量，以及检测血清中的乙型肝炎病毒等。
3. 细胞因子水平检测细胞因子是调节免疫反应的重要分子，其水平的异常会导致许多免疫性疾病的发生。
化学发光免疫分析技术可以用来检测细胞因子的含量，从而确定免疫反应的程度和类型。
4. 肿瘤标志物检测肿瘤标志物检测是诊断肿瘤的重要手段之一，常用于癌症的早期筛查和治疗效果监测。
化学发光免疫分析技术可以用来检测血液或尿液中特定肿瘤标志物的含量，从而提高癌症的检测准确率和治疗效果监测的精度。
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术
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化学发光免疫分析技术
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是当前世界公认先进标识免疫测定技术，化学发光免
疫分析技术含有高度准确性和特异性，成为检验方法中最 为主要技术之一。化学发光免疫分析技术作为疾病诊疗主 要伎俩已被广泛用于机体免疫功效、传染性疾病、内分泌 功效、肿瘤标志物、性激素、甲状腺功效等方面体外诊疗 分析技术
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• 分析方法简便快速
• 结果稳定、误差小
• 样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免去了各种可能原因（光源稳定性、光 散射、光波选择器等）给分析带来影响，使分析结果灵敏稳定可靠。
• 安全性好及使用期长
• 免去了使用放射性物质。到当前为止，还未发觉其危害性；试剂稳定，保留期可达一 年。
T3降低： ⑴仅于较重甲状腺功效减退病人，T3和T4均下降，轻型甲减T3 不一定下降； ⑵重症全身性疾病状态或慢性病变可造成T3下降，多见 于慢性肾功效不全、慢性心功效不全、糖尿病、心梗等疾病患者。
化学发光免疫分析技术
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游离甲状腺素（FT4）游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）
• FT3和FT4分别为T3和T4在血清中未与蛋白结合部分，其不 受血清中TBG影响，直接反应甲状腺功效状态，其敏感性 和特异性均高于T3和T4
化学发光免疫分析技术
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㈠ 辣根过氧化物酶标识化学发光免疫分析
该分析系统采取辣根过氧化物酶（HRP）标 识抗体(或抗原)，在与反应体系中待测标本 和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被 抗体-待测抗原-酶（HRP）标识抗体复合物， 这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增 强剂使产生化学发光。
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法荧光和化学发光免疫分析方法是一种常用的生物分析技术，广泛应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍荧光和化学发光免疫分析方法的原理、应用以及优缺点等方面。
首先，荧光免疫分析方法利用标记有荧光物质的抗体或抗原与待检测物相互作用，通过检测荧光信号来定量分析目标物。
其原理是当荧光标记物被激发后，会发射出特定波长的荧光信号，利用荧光光谱仪测量荧光强度来确定目标物的浓度。
荧光免疫分析方法具有高灵敏度、高选择性和多样性的优点，可用于检测蛋白质、核酸、细胞等生物分子。
化学发光免疫分析方法则是利用特定的化学反应产生荧光信号来检测目标物。
常用的化学发光免疫分析方法有酶免疫分析和化学发光免疫分析。
在酶免疫分析中，酶标记的抗体或抗原与待检测物相互作用后，加入底物，酶催化底物发生化学反应产生荧光信号。
而化学发光免疫分析则是通过特定的化学反应产生激发态分子，激发态分子发生无辐射跃迁产生荧光信号。
化学发光免疫分析方法具有高灵敏度、快速、稳定性好的特点，常用于临床诊断和药物研发等领域。
荧光和化学发光免疫分析方法在生命科学研究中有广泛的应用。
例如，在蛋白质研究中，可以利用荧光免疫分析方法检测蛋白质的表达水平、相互作用以及酶活性等。
在细胞研究中，荧光免疫分析方法可以用于检测细胞的分子分布、内源性蛋白质的表达和细胞信号传导等。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以用于检测病原体、药物残留和环境污染物等。
荧光和化学发光免疫分析方法具有许多优点。
首先，这些方法具有高灵敏度，可以检测到非常低浓度的目标物。
其次，这些方法具有高选择性，能够在复杂的样品中准确地检测目标物。
此外，荧光和化学发光免疫分析方法还可以实现高通量分析，节省时间和成本。
然而，荧光和化学发光免疫分析方法也存在一些缺点。
首先，荧光信号受到背景干扰的影响，可能导致误差的产生。
其次，荧光标记物的稳定性较差，容易受到光照和温度等因素的影响。
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析是一种常用的生物分析技术，其原理是利用化学发光反应检测目标分析物。
该技术主要应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
化学发光免疫分析的步骤如下：
1. 样品处理：将待测样品进行处理，通常包括样品的稀释、蛋白质提取、核酸提取等步骤，以满足后续分析的要求。
2. 特异性结合：将待测样品与特异性抗体结合，这是化学发光免疫分析的关键步骤。
特异性抗体能够与目标分析物结合，形成抗原-抗体复合物。
3. 化学发光：在抗原-抗体复合物形成后，加入一种化学发光底物，底物与复合物发生化学反应，生成激发态分子或产生紫外、可见光等发光物质。
4. 光学检测：利用光学检测系统，测量发光信号的强度或荧光信号的荧光强度。
一般情况下，强度与待测样品中目标分析物的含量成正比。
化学发光免疫分析的优点是灵敏度高、特异性强，且能够同时分析多个目标分析物。
它在临床诊断中广泛应用，例如检测某些疾病标志物、药物浓度和病原微生物等。
此外，化学发光免疫分析还可用于药物研发中的蛋白质相互作用研究、基因表达分析等。
总之，化学发光免疫分析是一种重要的生物分析技术，通过特异性抗体与荧光底物的配对应用，实现对目标分析物的定量检测，具有灵敏度高、特异性强和多重分析的优势。
电化学发光免疫分析的原理
电化学发光免疫分析的原理电化学发光免疫分析（ELISA）是一种流行的抗体检测技术，可以检测和测定抗体或抗原。
ELISA最初由发明者迪卡贝尔（Dica Bell）于1970年发明，以前称为发光免疫分析法或发光免疫比色法。
它可以快速准确地检测抗原或抗体在生物样品中的浓度。
ELISA技术的基本原理是：首先将特定的抗原和发光探针分别固定到水凝胶的微孔平板上，然后将待测样品加入微孔平板，抗原识别抗体或抗原与它结合，抗体和发光探针之间形成免疫复合物。
然后，抗体免疫复合物结合到抗原，使抗体免疫复合物和发光探针之间形成发光免疫复合物。
最后，将产生的发光免疫复合物可以在发光分析仪上读取，从而实现抗原检测目的。
ELISA技术的预处理过程是：首先将特异性抗原固定到微孔平板上，然后将抗原固定物体洗涤干净，洗涤后，将含有实验样品的溶液加入。
抗原和实验抗体在抗原上结合，产生免疫复合物。
接下来，将发光探针加入该免疫复合物，使免疫复合物和发光探针形成发光免疫复合物，以发光的方式检测体外抗原的浓度。
ELISA技术的优点是快速、准确、可重复，可以用来检测各种抗原的抗体，如霍乱抗原、疱疹病毒抗原、轮状病毒、肝炎抗原等。
ELISA 技术也可以用来研究抗体的特异性、可稳定性和稳定性，从而为研究抗原提供重要的理论基础。
ELISA技术也有一些缺点，如测定样品抗体或抗原的反应强度不够准确。
此外，ELISA技术的准确性受到实验参数的影响，如反应温度、反应时间，以及抗原和抗体的浓度和稀释比例等。
ELISA技术具有快速、可靠和可重复性等特性，是当今最常用的免疫学检测方法。
它不仅能用于抗原抗体检测，还经常被用于临床检测，用于诊断疾病，如癌症、HIV等。
ELISA技术对对医学和科学领域都具有重要的意义，它可以准确、快速地检测抗原或抗体，为疾病的早期诊断和治疗提供有效的支持。
总之，电化学发光免疫分析（ELISA）技术是一种常见的抗体检测技术，也是当今最常用的免疫学检测方法，可以根据其特定的技术原理来进行抗原检测。
化学发光免疫分析技术原理及特点对比
化学发光免疫分析技术原理及特点对比一、化学发光免疫分析技术原理自从二十世纪七十年代开创化学发光技术以来，世界各国科学家在这个技术的基础上不断研究发展，以改善此技术在人体医学检验上的应用，通过不懈的努力探索，最终化学发光技术进入临床测试应用，为人类健康检验做出了重要的贡献。
时至今日，化学发光免疫分析作为一种微量物质定量检测技术，已经发展的先进且成熟，在人体疾病筛查和健康检测等方面，有着十分重要的作用。
化学发光免疫分析结合了化学发光反应和免疫学的特点，通过将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，抗原或抗体与待测物质发生特异性结合，随后加入氧化剂、化学发光底物或是电压的激发，通过氧化剂氧化发光物质，酶催化发光底物或是发光物质在电压的激发下形成高能的激发态，由于激发态不稳定，再回到基态过程中会以光的形式释放出能量，同时由于待测物浓度与发光强度在一定条件下呈线性定量关系，因此借助仪器检测发光的强度就可以确定待测物的含量。
以测定人绒毛膜促性腺激素(HCG)为例(图)，待测物HCG首先与酶标记的抗体以及发光标记物标记的抗体反应，形成双抗体夹心复合物，随后再加入与含有与发光标记物结合的磁珠，通过磁铁将复合物聚集，最后加入发光底物产生光信号进行定量。
图-人绒毛膜促性腺激素化学发光测定原理二、不同化学发光免疫分析技术特点对比根据标记物的不同，化学发光可大致分为：利用吖啶酯、鲁米诺等进行标记的直接化学发光免疫分析(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)、利用如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶等标记的酶促化学发光免疫分析(Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)和利用三联吡啶钌等标记的电化学发光免疫分析(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)。
直接化学发光免疫分析发光过程十分快速，在几秒钟之内就可以完成，而酶在一般情况下稳定性较好，如辣根过氧化物酶处于室温下可以在几周内保持稳定，且具有较高的特异性，发光时间较直接化学发光法更长，可以持续几分钟到十几分钟，电化学发光法处于电解池介质中反应因而可以反复使用。
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发光现象
• 一种物质由电子激发 态回复到基态时，释 放出的能量表现为光 的发射，称为发光 。
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发光类型
光照发光 化学发光 生物发光
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生物发光类型
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化学发光 (chemiluminescence)
• 化学发光酶免疫分析 – chemiluminescence enzyme immunoassay
• (直接)化学发光免疫分析 – chemiluminescence immunoassay
• 电化学发光免疫分析 – electrochemiluminescence immunoassay
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化学发光免疫技术
发光酶免疫分析
化学发光免疫分析 电化学发光免疫分析
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问题一:
发光酶免疫分析
酶免疫分析的发光底物
➢Virus
➢Capture antibody ➢Solid support
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技术类型
发光免疫分析技术
临床免疫学教研室
李会强 教授
发光免疫分析
• 将发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新 的免疫分析技术。方法不仅具有发光分析的高 灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性,而且还具 有分离简便,可以实现自动化分析特点,使之成 为生物学研究领域中一种新的重要分析手段。
2
标记免疫分析
• 发展历史： – 放射免疫分析（60年代） – 酶免疫分析（70年代） – 发光免疫分析（80年代）
• 吖啶酯发光的氧化反应简单快速： • 具备较低背景，确保敏感度； • 吖啶酯容易标记，稳定也保存： • 瞬间发光，持续时间短，对仪器性能要求较高；
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问题三:
电化学发光免疫分析
发光剂
三联吡啶钌作为发光剂
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发光剂
• 三联吡啶钌
– 吡啶（氮杂苯） – 联吡啶 – N羟基琥珀酰亚胺（NSH）修饰 – 三联吡啶钌活性衍生物
• 辣根过氧化物酶 – 鲁米诺及其衍生物 – 对-羟基苯乙酸(HPA)
• 碱性磷酸酶 – 4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1,2-二 氧乙烷(AMPPD) – 4-甲基伞酮磷酸盐(4-MUP)
12
鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）
碱性缓冲液中直接发光
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HPA
激发后发射荧光
450nm
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仪器设备
– 微粒子发光酶免疫分析
• 固相材料
– 700 nm微球
• 德国西门子公司
– Immulite 免疫分析仪
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仪器设备
• 激发后检测
– 4-MUP – 美国雅培公司
• AxSYM免疫发光分析仪
– 发光酶免疫分析（荧光酶免疫） – 荧光偏振免疫分析
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96-T板式酶促发光免疫分析 • 96-T 微孔板 – 优势 • 适合批量操作 – 缺点 • 抗体包被容量 • 固相反应模式
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问题二:
（直接）化学发光免 疫分析
化学发光剂
• 吖啶酯（AE)
碱性条件下含有过 氧化氢溶液中发光
（470nm）
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制备吖啶酯标记物
• 利用N-羟基琥珀酰亚胺，活化抗原或抗体分子 中的羧基，再与吖啶酯中的氨基结合形成酰胺 键。
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微粒子分析模式
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双抗体夹心化学发光免疫分析
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直接化学发光免疫分析
350nm
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AMPPD
碱性缓冲液中直接发光
15
4-MUP
激发后发射荧光
448nm
360nm
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双抗体夹心化学发光酶免疫分析
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双抗体夹心荧光酶免疫分析
18
仪器设备
• 直接检测
– 鲁米诺（HRP） – VITROS Eci 全自动增强化学发光免疫分析系
统（ABS、发光增强剂） – 金刚烷（AP） – Lumi-Phos 480 （美国lumingen公司）
3
发光免疫分析
• 主要特征： – 发光剂作为标记物 – 纳米微球作为固相载体 – 自动化水平
4
Type of LIA
Luminescence Immunoassay, LIA
1.Fluorescence Immunoassay ,FIA 2. chemiluminescence immunoassay ,CLIA
45
荧光素
46
技术类型
• 固相抗体竞争法
– 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合, 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光 强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。
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技术类型
• 固相抗原竞争法
– 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记 抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测 定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。
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技术类型
• 双抗体夹心法
– 固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形 成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物， 酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发 射613nm荧光。
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技术类型
• 双抗体夹心法
➢E
➢E
u
➢DELFIA labeled detection
uHale Waihona Puke antibody38
问题四:
荧光偏振免疫分析
检测原理
光线通过偏振滤 光片后，形成一 个方向的平面光 称为偏振光。
偏振光(蓝光,485nm) 荧光物质
偏振荧光(绿光,525nm～ 550nm)
40
检测原理
41
检测原理
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检测原理
[荧光偏振]雅培AxSYM 全自动免疫分析
仪
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时间分辨荧光免疫分析
44
荧光素
• 三丙胺（TPA）
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电化学发光原理
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电化学发光原理
TPA失去电子发生氧化成阳离子自由 基后再失去质子成为自由基TPA（强还原剂）
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电化学发光原理
二价三联吡啶钌阳极表面被氧化，形成三价
三联吡啶钌（强氧化剂），被自由基TPA还原
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电化学发光原理
激发后三联吡啶钌不稳定回到基态并发光
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标记物的制备
• 三联吡啶钌[Ru(bpy)32+作为电化学发光分 析的标记物，分子中含有N-羟基琥珀酰胺 （-NHS）可以抗体、抗原分子中的氨基结 合形成稳定化合物。
• 三丙胺（TPA）作为电子供体，参与电极表 面的氧化还原反应。
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电化学发光免疫分析（双抗体夹 心）
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电化学发光免疫分析
罗氏电化学发光仪E170S
镧系元素离子不能直接与抗原或抗体结合，需 应用双功能基团的螯合剂，形成镧系元素离子螯合剂-抗原（或抗体）复合物。
双功能螯合剂： 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）
标记方法： 一步法：先螯合Eu3+，再连接蛋白质 二步法：先连接蛋白质，再螯合Eu3+