激光共聚焦显微镜的样本
激光扫描共聚焦显微镜
分辨率高
免疫荧光标记技术
• 免疫荧光技术是将抗体（或抗原）标记上荧光素（例如 FITC )，它与细胞或组织内相应抗原（或抗体）结合后， 通过观察、检测特征的荧光，定性、定位及定量地检测样 品中的抗体。免疫荧光技术的优点是其具有免疫反应的特 异性，又结合了荧光检测的敏感性
•注：动态监测过程需要连续采集一个固定视野的图像，因此 在离子测定时要求细胞贴壁牢固，监测期间不发生移位现象， 否则，不易的到好的定量结果。
常见的应用和方法
用激光扫描共聚焦显微镜在细胞原位检测核酸 激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的
分布特征及含量，即实现定位，定性及定量检测 核酸 常用：细胞核定位及形态学观察 染色体观察等 前提：需将核酸用荧光探针标记 常用荧光探针： Hoechst33342 Hoechst33258 DAPI 等
激光扫描 共聚焦显微镜
简介
• 激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起 来的一项具有划时代意义的高科技新产品，它是 在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置， 利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率 提高了30%~40%，使用紫外或可见激光激发荧光 探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光 图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+ 、pH值， 膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态 学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等 领域中新一代强有力的研究工具，是目前生物医 学领域中最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。
• 另一方面，样品也会受到同一焦平面上的 临近区域所激发荧光的干扰，使得图象对 比度降低，这被称为侧向（XY）干扰
激光共聚焦显微镜样品制备方法_二_组织切片样品_边玮
第29卷第4期2010年8月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol.29，No.42010-08文章编号：1000-6281（2010）04-0399-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（二）———组织切片样品边玮（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：应用激光共聚焦显微镜技术对荧光标记的组织切片样品进行三维观察成像是生物学研究的常规手段。
本文主要介绍实验室制备用于激光共聚焦显微镜成像的冷冻组织切片及免疫荧光标记过程。
关键词：冷冻组织切片；免疫荧光；激光共聚焦显微镜成像中图分类号：Q336；TG115.21+5.3文献标识码：A收稿日期：2010-05-07作者简介：边玮（1964－），女（汉族），吉林蛟河人，高级工程师.E-mail ：weibian@.应用于激光共聚焦显微镜的组织切片样品多采用冷冻组织切片，可尽量保持组织样品的抗原活性。
组织采集后，经固定、冷冻包埋、冷冻切片、晾片，进行免疫荧光抗体标记。
1组织的采集、固定和保存不同来源的组织可依据实验条件和实验目的而采用不同的固定和保存方法。
实验室通常采用液氮冷冻法和多聚甲醛（PFA ）固定法。
液氮冷冻法：采取新鲜组织后，即可放入液氮中保存。
多聚甲醛固定法：小鼠、大鼠等实验动物经生理盐水和4%PFA 灌流，采取组织，组织块尽量小于1cm ˑ1cm ˑ1cm ，置于4%PFA 中进行后固定，后固定的时间可根据组织块的大小和致密程度而调整，可以4ħ固定过夜，或室温1 4h 。
之后，用0.01mol /L PBS 缓冲液洗3次，每次10 30min 。
在20%蔗糖中4ħ浸泡1h 以上，待组织块下沉后，即可进行冷冻切片。
组织块可置于4ħ冰箱保存于20%蔗糖（含0.05%NaN 3）中，一个月内完成切片。
表达荧光蛋白的实验动物组织，可遵循以上方法处理样品。
激光共聚焦制样
非损伤性导入法：在正常的生理条件下加入Ca2+荧光探针与植物细胞共同孵育, 使探针渗入到细胞内的方法。
在培养液中加人荧光探针和增强膜透性的药物, 如去垢剂digitonin(毛地黄甘)、表面活性剂Pluronic F-127等, 药物使细胞膜通透性增强, 利于荧光探针的导入【1】。
周平等发现：在PH5.6条件下，绿豆、花生、水稻、烟草等细胞原生质体用5~10um ol/L Indo-1-K+或Fura-2-AM共同孵育1.5h,荧光探针可导入部分原生质体【2】。
样品的制备1：样品制备是上机检测前的关键步骤。
样品需经荧光探剂标记( 单标、双标、三标) 。
标本可以是固定的或活的组织, 也可以是固定的或活的贴壁培养, 细胞应培养在Confocal 专用小培养皿或盖玻片上, 悬浮细胞, 甩片或滴片后, 用盖玻片封片。
样品的最大厚度约1~ 2 mm, 使用的盖玻片厚度应小于0117mm, 载玻片厚度应在018~ 112 mm 之间, 而且表面光洁, 厚度均匀, 没有明显的干扰荧光。
固定样品常用封片剂进行封片,常用PH815- 9 的PBS 配制的甘油封片。
样品准备2：样品的最大厚度大约1~2mm(10×/ 0.4 物镜), 它取决于物镜的数值孔径(NA) 、物镜的工作距离、激光的穿透力以及样品的透明度。
一般要求是单层贴壁细胞, 可以是经荧光探针标记(单标、双标、三标)固定的或活的组织; 固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal 专用小培养皿, 盖玻片); 用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。
对于非贴壁细胞的粘贴, 一般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸﹑伴刀豆球蛋白﹑cell- tak﹑vectabond﹑琼脂凝胶等。
选择粘贴剂的标准是: 不影响实验目的, 对标本无损害[1]。
激光扫描共聚焦显微镜的样品制备技术3：3.1 取材组织标本：包括活检标本、手术切除标本、动物模型标本及尸检解剖标本等，应在标本离体后立即冰冻切片或贮存于-70℃冰箱备用，以充分保存组织的抗原性。
激光共聚焦显微镜的原理和应用
激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。
2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。
3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。
利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
根据实验需求，调整扫描速度和分辨率以确 保图像质量。
图像采集
校准
确保显微镜处于校准状态，避 免图像出现畸变或失真。
采集参数设置
设置合适的曝光时间、增益和 数字位数等参数，以确保图像 质量。
多区域采集
如需观察大范围样品，可设置 多个采集区域，并确保各区域 间无缝拼接。
实时预览
在采集过程中实时预览图像， 确保图像质量满足要求。
特点
高分辨率、高对比度、高灵敏度 、无损检测、能够观察活细胞等 。
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上，形成光斑 ；
02
光斑通过扫描器在样品 表面进行扫描，同时收 集反射光或荧光；
03
反射光或荧光通过共聚 焦系统汇聚到光电倍增 管上，转换成电信号；
04
电信号经过处理后形成 图像，显示在计算机屏 幕上。
根据实验需求设置采集参数，如曝光 时间、增益等，以获取高质量的图像 。
CHAPTER 04
激光扫描共聚焦显微镜实验 案例
细胞膜流动性研究
总结词
通过观察细胞膜荧光标记物的扩散和 分布，了解细胞膜的流动性。
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜，在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化，通过分析荧光强度和分布的变 化，可以了解细胞膜的流动性。
高速成像
研发更快的扫描速度和数据处理能力，实现实时动态观察 ，缩短实验时间，提高实验效率。
多维成像
拓展激光扫描共聚焦显微镜的成像维度，从二维平面扩展 到三维立体成像，甚至包括时间序列的四维成像，以更全 面地揭示细胞活动和分子交互过程。
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断，通过观察活体组织样 本，为疾病诊断和治疗提供更准
激光共聚焦显微镜的样本
激光共聚焦显微镜的样本激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSM）是一种高分辨率的光学显微镜技术，使用激光束扫描样本而不使用传统的白光光源。
这种显微镜技术常用于生物学、医学和材料科学中。
以下将介绍几个常见的激光共聚焦显微镜样本。
第一个样本是细胞样本。
细胞是生物界最基本的单位，通过激光共聚焦显微镜观察细胞能够提供高分辨率的细胞内部结构信息。
例如，可以观察到细胞核、细胞质、细胞骨架等结构，同时还可以研究细胞内各种生物分子的动态过程，如细胞分裂、细胞凋亡等。
第二个样本是组织样本。
组织是由大量细胞组成的结构，通常包含多种细胞类型和细胞之间的间质。
使用激光共聚焦显微镜观察组织样本可以显示细胞在组织中的分布、空间排列以及细胞与细胞之间的相互作用。
例如，可以研究组织中细胞的分化过程、组织损伤后的修复过程等。
第三个样本是活体样本。
激光共聚焦显微镜可以实时观察活体样本的结构和功能。
通过使用特定的染料，可以观察到活体样本中特定细胞类型或生物分子的分布和活动。
例如，可以观察到神经元在活体大脑中的连接和传导过程，研究神经系统的功能。
此外，还可以观察到血管、淋巴管等在活体组织中的分布和动力学过程，研究血液循环和淋巴系统的功能。
第四个样本是材料样本。
激光共聚焦显微镜可以用于研究材料中的微观结构和表面形貌。
例如，可以观察金属材料、陶瓷材料、高分子材料等的晶体结构、纳米颗粒的分布和形态等。
此外，还可以观察材料的表面形貌，如表面粗糙度、孔隙结构等，为材料科学研究提供重要的信息。
总之，激光共聚焦显微镜可以应用于各种样本的观察和研究，包括细胞样本、组织样本、活体样本和材料样本。
这种高分辨率的显微镜技术为科学研究和工程实践提供了强大的工具。
激光共聚焦使用技巧和注意事项
犹他大学神经生物与解剖学 美国犹他州盐湖城 样品：斑马鱼胚胎视网膜神经轴突 技术：共聚焦显微镜
吉森大学生殖生物学系解剖学与细胞生物学中心 德国吉森 样品：大鼠睾丸冰冻切片 技术：共聚焦显微镜
德国汉堡大学医学中心 德国汉堡 样品：端复胞器 技术：共聚焦显微镜
显微镜常用观察方式：
BF-明场
PH -相差
光谱拆分（Unmixing）
光谱反卷积（deconvolution）
各种荧光蛋品，普遍存在着荧光发射光谱重叠 染料串色（DAPI/FITC… ） 背景自发荧光 （组织FISH、植物标本…）
Spectral Unmixing
YOYO-1 (nuclei) 515-nm emission before unmixing Alexa488 (F-Actin) Colour merged after unmixing
分辨率∝物镜数值孔径（NA） 荧光亮度∝NA4/M2
UPLFLN40XO UAPO40XO PLAPON60XO UPLSAPO60XW UPLSAPO100XO
:NA1.30 :NA1.30 :NA1.42 :NA1.20 :NA1.40
正确使用物镜
低倍至高倍找标本、观察、扫描成像
针孔、激光强度和检测器灵敏度
针孔
一般情况Pinhole处于 Auto状态
实际使用中：
薄标本（活细胞等）：增大针孔，提供图像亮度 ，得到更好反差的图像，有效的保护标本。 厚标本（厚组织切片等）：减小针孔，获取更薄 的图像，更好细节的图像。
针孔大小关系
检测器：PMT
HV推荐值：不高于700
CTRL+H
激光等级:Class 3B
Zeiss激光共聚焦显微镜LSM880withAiryscan
基本功能：大视野拼图
视野的扩展
Tilling & Stitching: 227um x 125um
基本功能：大视野拼图
扩展功能： 光谱扫描，线性拆分
最大程度避免荧光串色的影响
光谱扫描和拆分之前 光谱扫描和拆分之后
发射光谱图谱和曲线
Wavelength
Intensity
光谱拆分
去除自发荧光
果蝇眼 Green: AF488, actin Red: Cy3, Crumbs Blue: autofluorescence
Agenda
1 LSM880 激光共聚焦显微镜的配置及应用范围 2 激光共聚焦显微镜的原理 3 LSM880 激光共聚焦显微镜的光路部件 4 如何获取一张高质量的图像
Carl Zeiss Microscopy
2018/9/12
共聚焦显微镜：广泛应用于 生物、医学 各个领域
Nearly all fields of Science...
理论讲座： 共聚焦显微镜的原理及在生命科学领域的应用 上机操作培训： 1. 硬件部件介绍和激光安全介绍 2. 开关机顺序以及注意事项 3. 二维单通道图像的获取 4. 多通道图像的获取 5. 透射光图像的拍摄 6. 图像的保存和导出 7. Z-stack 图像拍摄及 Maximum intensity projection 图像处理 8. Time series 图像拍摄 9. 大视野拼图 10. Airyscan 图像的拍摄 11. 荧光强度分析 用户上机操作： 用户复习上机操作内容，可自带样品进行拍摄，工程师解答用户使用中遇到的问题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
院内5折，校内8 折
只允许3天后15天内的预约 zhenli@ 多线氩离子激光器(458 nm, 488 nm, 515 nm) 半导体激光器：405 nm, 559 nm, 635 nm 上转换专用激光器：808 nm,980 nm 活细胞CO2培养系统
仪器型号： OLYMPUS IX73 研究级倒置荧光显微镜
显微镜参数
1．主机功能：系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能； 2．透射光光源：外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置； 3．物镜：长工作距离万能平场半复消色差相差（荧光）物镜：4×（
数值孔径N.A.≥0.13）、10×（N.A.≥0.3），20×（N.A.≥0.7）、40×（ N.A.≥0.6），60X×（N.A.≥0.7） 4．物镜转盘：6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜信 息，随物镜转换能够自动校准标尺； 5．载物台：精确定位功能手动载物台；具备XY锁定和复位功能, 可重 现标本位置，游标尺的精度≤100μm； 6．聚光镜：超长工作距离万能聚光镜，孔位数≥5；
荧光显微镜
Fluorescence microscopy
参加过仪器使用培训，通过 网上仪器知识考试，网上提 前预约，管理员审核通过方 可使用。
注意事项： 汞灯使用时尽量减少启动次 数；灯熄灭后要等待冷却才 能重新启动；点燃灯泡后不 可立即关闭，以免水银蒸发 不完全而损坏电极，一般需 要等15min 放置地点 ：401-1312室 管理员：吴安庆老师
显微镜参数
7．荧光照明器：主机反射荧光系统可采用复眼照明技术，平均荧光视
野亮度，便于量化分析； 8. 荧光光源：130W以上长寿命荧光光源, 光导管传输，长度1.5米，符 合RoHS 和WEEE法令要求； 9. 高通透性荧光激发块：紫外， BP340-390, DM410，BA420-IF 蓝色，BP460-495, DM505，BA510-IF 绿色，BP530-550, DM570，BA575-IF； 10．荧光激发块转盘：编码型荧光激发块转盘，≥7孔位设计，便于今 后扩展应用,无需工具即可更换滤色镜组,与软件连接后能够随图片保存 荧光滤色镜组信息； 11．滤色镜：透射用日光平衡滤色片、绿色滤色片，荧光用减光片 ND6/ND25； 12．DIC附件：40X、60X物镜配置微分干涉附件。
开了不能马上关，关了不能马上开。
荧光显微镜的不足:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的 同时采集及共定位。 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.只能在二维环境下观察。
6.样品不能太厚。
线（狭缝）扫描共聚焦显微镜
分辨率低，速度快，噪音高
转盘式扫描共聚焦显微镜
性能介于上述两者之间
激光共聚焦扫描显微镜
OLYMPUS FV1200 研究级倒置荧光显微镜 参加过仪器使用培训，通过网上仪 器知识考试，网上提前预约，管理 员审核通过方可使用。
注意事项：
放置地点：401-1312室 管理员：吴安庆老师 收费：200元/小时
• •
注意事项:
1、为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银蒸发不完 全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。
2、汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气尚未恢复 到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路，导致汞灯爆炸。这 样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢出，将导致工作室污染。故关 闭汞灯之后，不能马上再次打开，必须等待至少30分钟。
基本原理
高 压 汞 灯
滤镜 分光
被荧光 紫外 激发 探针染 蓝 色的生 绿 物样本
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
（一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片） 带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
激光共聚焦扫描显微镜
（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM ）
以激光作为光源，采用光源针孔与检测针 孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以 获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统
共聚焦显微镜的类型
点（慢）扫描共聚焦显微镜
分辨率高，图像清晰，采集图像速度慢
• • • • •
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。 （三）标本 组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜 直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。 （四）封裱剂 封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较 亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等 量混合液作封裱剂。 （五）镜油 一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的 无荧光镜油，也可用上述甘油代替。
1、开机和关机需要管理员来操作 2、换样本的时候需要将物镜降下来， 或点击软件上Escape 3、能用普通荧光显微镜观察拍照的样 本就不要用共聚焦显微镜，节约激光器 寿命。
上转换共聚焦扫描显微镜
OLYMPUS FV1200 放置地点：401-1111 管理员：吴艳 普通共聚焦：400元/小时 上转换共聚焦：1000元/小时
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
阻断滤镜：吸收和阻挡激发光进入目镜；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。
多为长通滤色镜；LP490
标本制作要求
（一）载玻片
•
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面 不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时 需用石英玻璃载玻片。 （二）盖玻片
吴艳 分子影像与核医escence microscopy
荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光 学显微镜，目前主要由光源、滤片系统、光路系统 等组成。
广泛应用在生命科学领域，可对组织和细胞的 结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进行定位、 定性观察及分析。