菌种保藏和复苏-精简版

菌种的保藏与复苏一、菌种保藏（一）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。

菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。

（二）菌种保藏的原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。

其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。

在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。

在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。

如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。

与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。

（三）菌种保藏的方法本实验室常用菌种保藏方法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。

平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。

此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。

2.甘油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。

甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。

野生菌甘油浓度最高可以提高到20-30%。

用培养基（培养基应选择需保存菌株生长用的培养基）配制50%（v/v）的甘油，高压蒸汽灭菌后，按200 μl/管分装到EP管中，另少数分装于螺口管。

甘油一次不应分装太多。

重要菌种应该用2 ml的螺口管保存。

因为螺口管密封更严，而且不会在冷冻时崩开。

保菌前，把甘油管做好标记。

标记内容应包括菌名、保存日期、保存人和有效期。

每个样品应至少保存2管。

保菌时，用无菌枪头吸取600 μl（该体积可根据最终甘油浓度而变）的新鲜菌液（应采用性状稳定，生长至对数中期的菌液进行保菌），加入甘油后，缓缓吹打混合均匀。

立刻放入-20°C冰箱中冷冻，开大冰箱时，放入-80°C冰箱保藏。

该方法保藏菌种的有效期规定为6个月。

超过6个月应及时进行复苏传代，此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）。

在构建载体的重要时刻都应该进行菌种保存，还应该保存质粒（TE buffer，-20 °C）质粒导入E.coli DH5α、BL21(DE3)后都应该进行保菌。

建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。

（四）菌种保藏的注意事项1、严格的无菌操作；2、用于保存的微生物在生长前必须处于生长良好的状态；3、保藏过程中要防止退化的发生。

二、菌种的复苏与传代（一）菌种的代菌种的代是指将其接种至新鲜固体培养基上或液体培养基内，每萌发一次即称为一代，——USP。

（二）菌种的衰退原理在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性反而是相对的；退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。

在自然情况下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以通过人工选择法去有意识地筛选出个别的正变体用于生产实践中。

相反，如不自觉、认真地去进行人工选择，大量的自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种的衰退（degeneration）。

如果对菌种工作长期放任自流，不纯化、复壮（rejuve-nation）和育种，则菌种就会对你进行“惩罚”，就会出现持续的低产、不稳产。

菌种的生产性状也是不进则退的。

菌种的衰退的表现有：对产量性状来说，菌种的负变就是衰退；其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退；最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少也是衰退的表现；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降也是衰退；衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。

菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变过程。

开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退。

所以，在开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“衰退”了，但也是不纯的，即其中还有少数尚未衰退的个体存在着。

衰退的特点是大量群体中的自发突变。

经过长期保藏和传代的菌种，由于种种原因易发生衰退、变异或死亡，因此各类菌种在保藏期间必须定期检查，发现变异或衰退，应及时给予恢复。

防止菌落的衰退的方法1.定期检查保藏的菌种应定期检查，一般每年检查1—2次，在有效期内做好鉴定、复苏、传代的工作。

发现染菌变异等现象时，报告老师及时研究处理。

检查项目：菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性等。

2.控制传代次数，超过5代后，需用最初保藏的菌种重新传代。

3.创造适宜的培养条件，在实践中，有人发现如创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退。

如改变培养基成分、改变培养温度等；4减少冻融次数，工作菌种使用时做好记录，使用4-5次需更换一管。

（三）菌种的提纯从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状，继续供科研及生产使用。

一种是只要求达到菌落纯化的水平，即进行复苏活化处理，就是平板划线后，挑取单克隆，培养后，观察性状如何，选取性状稳定的菌，在对数期中期进行保藏。

该方法较为粗放，适用于菌退化不太严重的情况；另一类方法，可达到“细胞纯”的水平，采用单胞分离法，也可以二者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化。

如果是重组菌退化了的话，还可以重新利用质粒进行转化。

（四）菌种的复苏：狭义的复苏仅是一种消极的措施，它指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施；从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。

广义的复苏则应是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。

所以，这实际上是一种利用自发突变（正变）不断从生产中进行选种的工作。

即有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。

操作过程：将保藏的菌种从冰箱中拿出，用灭菌的接种环挑取适量菌种，划线于固体培养基，在适宜的温度培养适宜的时间，提取单克隆，并进行菌种确认，确认后重新保菌。

注意事项：将保存的菌种从-80 °C拿出来后，速度要尽量的快，不要反复冻融，因为会导致菌种退化。

所以，不用等到菌种融化再吸取，可以直接刮两下冰即可。

菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。

并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。

菌种复苏应在超净工作台内操作。

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面。

取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。

（五）菌种确认：微生物传代中的菌种确认是必须的。

对菌种进行纯培养，根据菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性等结果进行菌种确认。

用无菌接种环取上述培养物接种到宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在30～37℃下培养适宜的时间。

培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。

鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。

必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。

若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。

应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。

（六）菌种的管理1. 定期检查，保藏的菌种应定期检查，一般每年检查1—2次，所有菌种的保藏都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。

在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。

对微生物生产菌种来说，保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。

2.在有效期内做好复苏活化、分离、纯化、鉴定再保藏的工作。

发现染菌变异等现象时，报告老师及时研究处理。

3.菌种的来源、复苏、使用和鉴定等均应做好详细记录。

管理记录中还应包括（但不限于）以下内容：从原始菌种传代到工作用菌种的代数；菌种生长的培养基及孵育条件；菌种生存条件。

4.减少冻融次数，要记录菌株使用次数，用上4-5次时应更换一管。

5试验菌种不得任意带出菌种保存实验室。

外单位索取菌种时，应包装严密，妥善保存。

6过期菌种应`及时销毁，销毁时应经121°C，20分钟的生物灭活处理。