从酱油生产用菌粉中选诱优良米曲霉菌种的研究

中图分类号：TS201.3；文献标识码：A；文章篇号:1007-2764(2004)01-0005-012从酱油生产用菌粉中选诱优良米曲霉菌种的研究周传云 聂明 万佳蓉（湖南农业大学食品科技学院，长沙410128）摘要：以酱油酿造用菌粉为出发菌（S），经分离、纯化后再经紫外线诱变（15W，20cm，30min）及控温培养处理后，获得1株变异菌株。

结果表明：能在44℃环境中旺盛生长；酶活力可达8158.6u/g（干曲），较出发菌株S酶活力提高了77.84%；遗传稳定性较好；发酵成酱油后经测定，其指标可达“GB18186—2000低盐固态发酵酱油”特级品，明显优于出发菌株酿造的酱油。

关键词：米曲霉；菌种诱变；酱油酿造酱油酿造过程中主要依赖于米曲霉所产生的丰富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系，分解原料中的多种成分，从而形成酱油独特的色、香、味、体[1]。

可见，米曲霉菌种的好坏直接关系到酱油的产量和质量。

优良的菌种往往在生产中因反复接种、传代及保藏不善等，特别是在高温情况下，常会出现污染杂菌、性状退化等而导致其生产性能下降乃至不能生产。

因而，对生产菌种有目的地进行分离筛选、诱变处理，从而筛选出生长速度快、孢子数量多、酶活力高，并且不易被杂菌污染的菌株用于生产，这无疑将会给企业带来巨大的新的活力。

本研究以市购酱油生产用孢子粉为材料，进行分离纯化，获得纯菌株后再经紫外线诱变，筛选获得了一株理想的米曲霉菌株。

1 材料与方法1.1 材料供试菌:上海某酿造厂生产的酱油曲粉，本试验将其分离、纯化后编号为S，作诱变出发菌株。

市购。

主要原材料:麸皮、豆粕、食盐等均市购诱变剂:紫外线:由从市场新购置的15W的紫外灯产生。

分离纯化及菌种保存用培养基:PDA培养基初筛蛋白酶活力用培养基（干酪素平板）:干酪素4g、KH2PO4 0.36g、Na2HPO4 1.07g、ZnCl2 0.014g、收稿日期：2003-10-5周传云，男，1947，2生，副教授，长期从事食品微生物、食品发酵等教学、科研、生产工作。

“湖南派派食品有限公司”技术创始人，主持研制、生产“派派酸牛奶”、“派仔腊八豆”系列产品 NaCl 1.2g、CaCl2 0.002g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4 0.002g、琼脂20g、蒸馏水1000ml、pH6.5～7.0、121℃灭菌30min。

麸皮菌种培养基(同时供复筛用):豆粕9g、麸皮1g、水11ml，装入250ml的三角瓶，121℃灭菌30min。

酿造酱油用原料:豆粕1600g、麸皮400g、水2200ml、121℃灭菌30min。

1.2 主要仪器与设备滴定管、凯氏定氮仪、陶瓷发酵罐及三角瓶、试管、培养皿等常规玻璃器皿。

电子天平、无菌操作台、台式振荡器、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、恒温水浴箱、723型分光光度计、显微镜、血球计数板等。

1.3 方法1.3.1 菌种分离纯化采用常规“稀释平板涂抹法”[2]与“稀释平板划线法”[2]等两种方法同时对供试菌进行分离纯化，挑取生长速度最快、产孢子量最致密，表面颜色最一致个体形态无异的单个纯菌落一个，移入PDA斜面培养好后备用(即为出发株S)。

1.3.2 孢子悬液制备取2环S菌株的孢子于盛有100ml并含有玻璃珠的无菌生理盐水三角瓶中，振荡20min，得单孢子悬液。

用血球计数板计数其孢子含量，并用无菌生理盐水调整孢子悬浮液浓度分别为105个/1ml、104个/1ml、103个/1ml，并置32℃温箱中培养6 h 后置于4℃冰箱备用。

1.3.3 诱变程序出发菌→制备孢子悬液→制备含菌平板诱变处理→初筛→复筛→发酵性能测定→生产菌株1.3.4 诱变方法[2]各取备好的孢子悬液10ml，放入6个9cm直径的无菌玻璃培养皿中，在磁力搅拌作用下，用紫外灯（15w，20cm距离）取3个不同时间（10min、20min、30min即不同剂量）分别进行照射处理，然后取处理液各0.1ml，涂布于PDA平板表面，每个剂量用3个含菌平板，并立即用黑牛皮纸包扎好（避光），倒置于32℃恒温培养箱中培养3d，对每个平板的菌落数及致死率进行统计，取致死率在99%以上的单个孤立菌落移入PDA斜面，每个菌落5支，培养，备用。

1.3.5 照射菌株的筛选[2]干酪素平板水解透明圈初筛法：分别从上述照射处理后的PDA斜面上取极少量孢子进行稀释，并用血球计数板测定稀释至1010个孢子/1ml稀释液，取1滴于干酪素平板表面，用玻璃刮铲涂抹均匀，置32℃培养2d，分别测定每皿中透明圈直径和菌落直径（均以每皿中3个菌落的平均数计为该变异株的结果），计算HE值。

HE值=透明圈直径/菌落直径，选择HE值较大的菌株移入PDA斜面，培养3d，备用。

控温培养筛选法：将经过初筛后所得菌株分别取少许孢子按上述方法稀释至1010个孢子/1ml，取0.1ml涂布于干酪素平板表面，每株用平板24个，分别置于34℃、36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃等8个不同温度下均培养3d（每个处理设2个平行样，另设1个出发株平板），观察生长情况及孢子致密状况，并分别测定所生长菌落直径及其透明圈直径，按初筛方法计算出HE值，选择能在最高温度中生长而且HE值较大的菌株移植于PDA斜面，用相应温度培养好后，保存以备进行蛋白酶活力测定复筛。

1.3.6 蛋白酶活力测定：Folin—酚法[2]固态发酵制酶：将经过初筛后所得菌株，分别接种于三角瓶麸皮菌种培养基内，于相应温度恒温箱中培养72h，测定蛋白酶活力。

蛋白酶活力测定：准确称取鲜曲2.00g于内置玻璃珠若干粒的干净三角瓶内，加蒸馏水50ml，振摇三角瓶20min以便将曲充分打散，于40℃水浴中恒温浸提1h，用定性滤纸过滤去渣得酶液。

酶液用pH7.2的0.2mol/L磷酸缓冲液进行适当稀释。

40℃测酶活力，723型分光光度计680nm比色。

同时测定鲜曲水分含量。

蛋白酶活力单位：在40℃，pH7.2条件下，每min水解酪蛋白产生1µg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位（u）。

1.4 酱油的酿造1.4.1 方法：低盐固态法[1]1.4.2 流程原料（豆粕:麸皮=8:2）→粉碎（2～3mm/粒）→混料、润料（料:水=1:1.1）→蒸料（121℃，45min）→摊凉℃(40)→接种（三角瓶种曲）→通风培养（38℃，48～72h）→成曲+盐水（含13%的盐水6300ml）→保温发酵（先用45℃保温发酵7d，后用32℃保温发酵10d）→浸泡、淋油、过滤→取清液装瓶→巴氏杀菌→检测1.4.3 酱油测定按GB18186-2000《酿造酱油》[3]标准要求进行2 结果与分析2.1 紫外线诱变致死结果将S纯菌株经紫外线不同剂量照射处理后，其致死情况见表1（剂量：照射时间min）。

表1 紫外线诱变致死情况统计表（%）剂量10-3 10-4 10-5存活率致死率存活率致死率存活率致死率0 100 0 100 0 100010 15 85 25 75 20 8020 10 90 5 95 8 9230 1 99 0.6 99.4 0.3 99.7从表1结果看出，照射30min的致死率均在99%以上，为了确保优良菌株不漏选，本研究从致死率达99%以上的处理中各选取3个生长速度快、孢子致密的菌落移入PDA斜面每个菌落2支培养好备用（编号为U1~U9）2.2 紫外线照射菌株干酪素平板初筛结果将诱变后挑选出的菌株涂布于干酪素平板，经培养后，其结果见表2。

表2 诱变株干酪素平板初筛结果编号S U1U2U3U4U5U6U7U8U9HE值1.451.70 1.78 1.69 1.90 2.08 2.18 1.91 1.76 2.36从表2可看出变异株的HE值均高于出发株的HE值，于是从9株变异菌株中挑选出EH最大的3株进行控温培养筛选，即：U5（HE=2.08）、U6（HE=2.18）、U9（HE=2.36）。

2.3 控温培养筛选结果表3 变异菌株在不同温度下培养的HE 值34℃ 36℃ 38℃ 40℃42℃ 44℃ 46℃48℃S 1.35 1.30 0.96 0.6 0.2 0 0 0 U 9 2.35 2.28 2.32 2.30 2.38 2.40 1.800.4U 6 2.08 1.88 1.64 1.50 1.20 0.81 0.400 U 5 2.15 1.92 1.65 1.481.10 0.71 0.30将上述初筛所得3株变异菌株再接种于干酪素平板进行不同温度培养处理，其结果见表3所示:诱变株的耐温性能明显优于出发株，出发株在44℃时便不能生长，而U 9诱变株到48℃时尚能生长，这无疑给酱油生产制曲带来极大好处。

2.4 蛋白酶活力测定结果将诱变株经麸曲固态培养后，测定其蛋白酶活力结果见表4～5。

表4 诱变株蛋白酶活力测定结果 (u/g)菌 株 S U 9U 6U 5酶活(干曲)4587.6 8158.6 6215.8 6173.6从表4可以看出U 9的酶活最高（8158.6），较出发株酶活（4587.6）提高了3571（将近77.84%），这与平板初筛及控温培养结果一致，同时根据控温培养的观察，各参试菌株的生长速度、孢子密度及耐温性等均是：U 9＞U 6＞U 5＞出发株，故确定U 9变异株进行下一步试验。

同时从下面表5的结果还可看出：菌落直径大的HE 值大，酶活也高。

表5 菌株菌落直径和HE 值与产酶能力关系 菌 株 S U 9U 6U 5菌落直径(mm) 13.5 21.2 19.6 18.7 HE 值1.412.28 2.10 1.96 蛋白酶活力(μ/g) 4587.6 8158.6 6215.8 6173.62.5 U9诱变株遗传稳定性试验结果将U 9进行6次试管斜面传代培养，每移代一次同时进行发酵产酶，测其酶活性，结果见表6。

表6 不同传代数发酵产酶结果 u/g（干曲） 代数1 2 3 4 5 6 酶活 8211.78217.0 8198.6 8199.7 8205.6 8091.7从表6看出，经6次传代培养后，U 9的酶活基本没有多大变化，且其菌丝生长速度、孢子的致密度也基本无变化，这说明U 9的遗传性能稳定。

2.6 生产性能测定综上所述结果分析，本研究选定诱变株U 9采用“低盐固态法”酿造酱油，其结果见表7~8。

表7 成曲培养结果杂菌数 (CFU·G-1)孢子数 (个/g)蛋白酶活力 (u/g) 水分含量(%)出发株S 3.9×105 4.8×109 4236.5 34 诱变株U 92.5×102 6.7×1010 7963.727从表7可看出，酿制酱油时，成曲的几项主要指标诱变株U 9均优于出发株S ，这为酿造优质酱油打下了良好的基础。