CFSE标记细胞及测定细胞增殖
CFSE染色方法
CFSE染色方法CFSE（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）染色方法是一种常用的荧光染色技术，通过这种方法可以追踪和分析细胞的增殖、分裂和活性等生理过程。
该方法利用CFSE荧光染料的特点，通过与细胞内的酯酶作用而形成的CFSE标记，来实现细胞的可见光荧光示踪。
1.准备CFSE染料溶液。
通常使用的浓度为5-10μM的CFSE染料溶液。
可以将CFSE染料溶于合适的溶剂中，如无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）或DMSO（二甲基亚砜）等。
2.处理待染细胞。
将需要染色的细胞分离出来，通常采用离心法获取细胞沉淀物。
接下来，将细胞悬浮液转移到培养基中。
3.CFSE染料标记。
将CFSE染料溶液与待染细胞混合，使其浓度达到适当的标记浓度。
染色时间一般为10-30分钟，但是时间过长或过短都有可能影响染料的有效标记。
染色完毕后，可以通过加入等体积的培养基来停止反应。
4.清洗和处理标记细胞。
将染色细胞通过离心去除无效的染料溶液，然后用新鲜的培养基洗涤细胞，去除未结合的染料。
5.扩增和培养标记细胞。
将清洗干净的细胞转移到含有适当培养基、生长因子和补充物的培养皿中，进行培养和扩增。
6.荧光显微观察。
通过荧光显微镜观察染色细胞，使用合适的荧光滤镜来观察CFSE荧光的发射。
CFSE染色方法的优势是可以追踪不同细胞的活动和增殖过程，如细胞分裂、生长速度等。
此外，该方法简单、可靠、重复性好，并适用于各种类型的细胞。
通过CFSE染色可以实现对细胞的定量和定性分析，对研究细胞增殖、分化、迁移等生命过程有重要意义。
总之，CFSE染色方法可以通过荧光示踪技术追踪和分析细胞的增殖和分裂过程。
通过上述实验步骤，可以成功地进行CFSE染色实验，并通过荧光显微镜观察和分析染色细胞的活动状态。
这项技术在生物学、生物医学和药物研发等领域有着广泛的应用前景。
CFSE标记结合流式细胞术检测单核细胞Siglec-1刺激CD4 +／CD8 +T细胞增殖
文献标识码 ： Ａ
文 章 编 号 ：６ ３４ ３ （０ ］ １ ００ ｌ ７ １０ ２ １） １７ ３ ５ ６
Ｃｏ ｂ ｎｅ ｐｐｌｃ ｉ ｎ ｏ ｍ ｉ ｄａ ｉ ａｔｏ ｆ ＣＦＳ ｌ ｂｅ ｉ ｇ ａ ｌ ｗ ｙ ｏ ｅ ｒ ｎ ｈ ｔ ｃ ｉ ｎ ｏ ｈｅ Ｅ ａ ｌ ｎ ｎｄ ｆｏ ｃ ｔ ｍ ｔ ｙ ｏ ｔ ｅ ｄｅ ｅ ｔｏ ｆ ｔ
ｐ ｏｉ ｒ ｔ ｎ ｏ ｒｌ ｅａ ｉ ｆＣＤ４ ＣＤ８。Ｔ ｃ ｌ ． ｅｈ ｄ ＣＤ１ ｍｏ ｏ ｙ ｅ ｎ ｐ ｒ ｈ ｒｌｂｏ ｄ ｏ ａｉｎ ｓｗｉｈ ａ ｕ ｅｃ ｒｎ ｒ ｙ ｄ ｏ ｅ ｆ ｏ ／ 。 ｅｌ Ｍ ｔ ｏ ｓ ｓ ４ ｎ ｃ ｔｓ ｉ ｅ ｉ ｅａ ｌｏ ｆｐ ｔ ｔ ｔ ｃ ｔ ｏ ｏ ａ ｙ ｓ ｎ ｒｍ ｐ ｅ
患者 Ｃ ４ Ｄ１ 单 核 细 胞 具 有 比健 康 人 单核 细 胞 更 强 的 刺 激 Ｃ ４ Ｃ ８ Ｔ 淋 巴 细胞 增 殖 能 力 ； 用 干扰 素 一 （ＮＦ ａ 刺 激 增 强 正 常 Ｄ ／ Ｄ 当 ａ Ｉ ） 单 核 细 胞 Ｓｇ ｅ 表 达 后 ， 刺 激 Ｔ 细 胞 增 殖 能 力 增 强 ； ｉｌｃ１ 其 用单 抗 阻 断 单 核 细 胞 Ｓｇｅ 后 ， 刺 激 Ｔ 细 胞 增 殖 能 力 减 弱 。 结 论 ｉｌ １ ｃ 其
（ＡＣＳ） ａ ｅ ｌｈｙ ｃ ｎｔｏｌ ｅ ｅ ｉｏａｔ ｄ ｂｙ ｍ ａ ｎｄ ｈ ａ ｔ ｏ ｒ ｓｗ ｒ ｓ ｌ ｅ ｇｎｅ ｉ— ｃ ｉａｔｄ ｃ ｌ ｓ ｒ ｉ （ Ａ ＣＳ） ＣＤ４ ａ ｔｃ ａ ｔｖ ｅ ｅｌ ｏ ｔｎｇ Ｍ ． ｎｄ ＣＤ８ Ｔ ｅｌ ｒ ｍ ｅ ｈｈｙ ｈ）ｄ ｃ ｌｓ ｆｏ ｈ ａ ｂ ｏ
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基于CFSE染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立
本文受国家973计划(2005CB523202)资助作者简介:赵和平(1983年-),男,硕士,主要从事动物病毒疫苗效力评价研究;通讯作者及指导教师:仇华吉(1967年-),男,博士,研究员,主要从事分子病毒学与免疫学研究,E mail:huajiqiu@ 。
免疫学技术与方法基于CFSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法的建立赵和平 孙 元 袁 远 仇华吉(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室,哈尔滨150001)中国图书分类号 S852 文献标识码 A 文章编号 1000 484X(2009)02 0159 05[摘 要] 目的:建立一种方便可靠的评价猪只细胞免疫水平的试验方法。
方法:用终浓度分别为3、6、9和12 g/ml 的刀豆素A(Con A)刺激经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(C FSE)染色的猪外周血单个核细胞(PBMC)3、5和7天,然后用荧光标记的单克隆抗体对CD4+和CD8+细胞进行标记,最后利用流式细胞术分析。
结果:不同浓度ConA 刺激后,猪PB MC 增殖能力不同,Con A 浓度为6 g/ml 时CD4+和CD8+细胞的细胞分裂指数最大,用MTT 试验也获得相似结果。
对PB MC 刺激5天后进行分析相对较好。
结论:建立了一种基于活细胞染料C FSE 染色的猪淋巴细胞增殖试验方法,该方法可以在单个细胞水平上有效地分析刺激后CD4+和CD8+细胞亚群的增殖水平,进而评价细胞免疫水平。
[关键词] 猪淋巴细胞;细胞免疫;C FSE 染色;淋巴细胞增殖试验A method for detecting porcine lymphocyte proliferation based on CFSE stainingZ HAO He Ping ,SU N Yuan ,YU AN Yuan,QIUHua Ji.Division o f Swine Infectious Diseases,Harbin Veterinary Research Institute,The Chinese Academy o f Agricultural Sciences,Harbin 150001,China[Abstract] Objective:To develop a method to assess porci ne cell mediated immunity (CMI).Methods:PBMCs from pigs were stained wi th intracellular fluorescen t dye,CFSE,and stimulated wi th varied amounts of ConA (0,3,6,9,and 12 g/mL),and plated in 3replicate cul tures for 3,5,or 7days.Then CD4+cell and CD8+cells were labeled with fluorescent antibodies.Data were acquired using flow cytometry (FC M )and analyzed using CellQuest software.Results:Cell division indices of porci ne CD4+and CD8+cells were different when porcine PB MCs were sti mulated with different doses of ConA.The results were similar to those obtained by MTT method.Op timal results were obtained when porcine lymphocytes were s timulated for 5days.C onclusion:The CFSE based method developed in this study can be used to analyze the proliferation of di fferent cell subsets si multaneonsly.[Key w ords] Porcine lymphocytes;Cell mediated immunity;CFSE staining;Lymphocyte proliferation目前对我国养猪业危害最大的主要是一些病毒性疾病,这些疫病主要通过疫苗接种手段来控制。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。
用同位素3H 标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。
CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA 合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。
FlowJo分析细胞增殖
注册 |登录构建全球华人科学博客圈返回首页 RSS 订阅 帮助 FlowJo 分析细胞增殖已有 521 次阅读 2012-8-21 14:20 |个人分类:FlowJo 使用|系统分类:科研笔记|关键词:细胞增殖，数据分析，FlowJo ，CFSE ，博文FlowJo 分析细胞增殖CFSE 法检测细胞增殖的原理：CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
演示数据：Proliferation tutorial ：实验中所用的荧光染料为eFluor ® 670 Proliferation Tutorial Data.rarFlowJo 分析细胞增殖的步骤：1. 确定要分析的目标细胞群（下图为演示数据中的样本Sample 1）2. 打开增殖分析平台：到“工具”菜单栏中选择“细胞增殖”，打开增殖分析平台，将参数轴中的参数更换为本实验中所采用的APC_A::670Dye ，如下图所示：张千君加为好友 给我留言 打个招呼发送消息FlowJo 中文技术博客分享/u/FlowJo流式细胞技术相关资源分享，流式细胞数据分析，流式技术支持及培训博客首页动态记录博文相册主题分享好友留言板个人资料左边为拟合结果图，右边为各个统计数据，其中：RMS: root mean square error的缩写，反映的是拟合结果与实际数据的吻合程度，RMS数值越小，说明拟合结果越好。
3.打开增殖分析平台左下角的“Options”选项选项中各个参数的介绍：#Peaks：增殖峰的数目，默认的最大数目为8个。
随着细胞的分裂，子代细胞所含的CFSE荧光染料的量以2倍的比例递减，分裂到第七代的时候，第七代细胞的CFSE荧光强度只有原代细胞的1/128，可能低于细胞的自发荧光。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。
用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。
CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法之邯郸勺丸创作二、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基, 也是DNA合成的必需物质.用同位素3H标识表记标帜TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程, 通过测定细胞的放射性强度, 可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况.可是具有放射性.2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料, 具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团, 使CFSE成为一种良好的细胞标识表记标帜物.CFSE进入细胞后可以不成逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞卵白质上.当细胞分裂时, CFsE标识表记标帜荧光可平均分配至两个子代细胞中, 因此其荧光强度是亲代细胞的一半.这样, 在一个增殖的细胞群中, 各连续代细胞的荧光强度呈对递加, 利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析.3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷, 为胸腺嘧啶的衍生物, 可取代胸腺嘧啶在DNA合成期（S期）, 活体注射或细胞培养加入, 而后利用抗Brdu单克隆抗体, ICC染色, 显示增殖细胞.同时结合其它细胞标识表记标帜物, 双重染色, 可判断增殖细胞的种类, 增殖速度, 对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标识表记标帜检测有些抗原只存在于增殖细胞中, 而非增值细胞缺乏这些抗原, 您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测.例如, 在人体细胞中, Ki-67抗体识别同名卵白, 在细胞周期S期、G2期和M 期表达, 而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达.用针对Ki-67卵白的单抗就可以检测细胞的增值情况.由于需要组织切片, 这种方法无法进行高通量分析.不外这一方法颇受癌症研究者们的青睐, 因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖.其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标识表记标帜还包括, 增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组卵白H3.（2）间接方法：通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力1、MTT检测法MTT检测法主要反映细胞的能量代谢, 是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法, 其原理是在活细胞生长和增殖过程中, 线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成兰紫色的甲（Formazan）, 生成的甲量的几多与细胞的数量和细胞的活力成正比.2、ATP检测细胞内的ATP含量受到了严格调控, 检测ATP也可以获得细胞增殖的信息.死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不含ATP, 在细胞溶解物或提取物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的线性关系.利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素luciferin的ATP检测以生物发光为基础, 能够为您提供非常灵敏的结果.如果有ATP存在荧光素酶就会发光, 而且其发光强度与ATP浓度成正比, 用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方便的进行检测.这种方法非常适用于高通量细胞增殖检测和筛选.三、检测细胞分化的方法1、流式鉴定细胞概况标识表记标帜, 以判断细胞是否分化2、观察细胞形态, 与已分化的细胞进行比较3、分化诱导评估其分化能力四、检测细胞凋亡的方法（1）形态学检测1、光学显微镜和颠倒显微镜染色细胞：凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化, 核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典范的凋亡形态.经常使用染色方法：①苏木精=伊红染色②甲基绿-派诺宁染色：与坏死相比, 细胞凋亡的细胞内常有RNA表达的增强, 用甲基绿特异性染色DNA, 派诺宁对RNA亲和力强, 若胞质呈派诺宁阳性为凋亡, 阴性为坏死.（前提是已经判断细胞处于死亡形态, 通过形态学判断）③吖啶橙染色法：.它与细胞中DNA和RNA结合量存在分歧, 可发出分歧颜色的荧光, 与DNA结合量少发绿色荧光, 与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光.该染料具有膜通透性, 能透过细胞膜, 使核DNA和RNA染色.因此, 在荧光显微镜下观察, 吖啶橙可透过正常细胞膜, 使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；在凋亡细胞中, 因染色质固缩或断裂为年夜小不等的片断, 形成凋亡小体.吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光, 或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失.吖啶橙染液有毒, 把持时要戴手套, 需避光.（凋亡小体）2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改酿成指标来评判细胞凋亡的进展情况.经常使用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342), HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI.三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的, 主要结合在DNA的A-T碱基区.紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光.Hoechst是与DNA特异结合的活性染料, 贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度, 使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml.DAPI 为半通透性, 用于惯例固定细胞的染色.贮存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度, 使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml.结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased), 部份染色质呈现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块, 发生凋亡小体（如图）.3、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小, 细胞质浓缩.凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕, 呈现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(如图)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期, 细胞核裂解为碎块, 发生凋亡小体.（2）检测凋亡标识表记标帜物质1、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧, 但在细胞凋亡的早期, PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的概况, 流露在细胞外环境中(图3).Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合卵白, 能与PS高亲和力特异性结合.将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标识表记标帜, 以标识表记标帜了的Annexin-V作为荧光探针, 利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生.碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料, 它不能透过完整的细胞膜, 但在凋亡中晚期的细胞和死细胞, PI能够透过细胞膜而使细胞核红染.因此将Annexin-V与PI匹配使用, 就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来.2、线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用, 多种细胞凋亡安慰因子均可诱导分歧的细胞发生凋亡, 而线粒体跨膜电位的下降, 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件, 它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)呈现之前, 一旦线粒体DYmt解体, 则细胞凋亡不成逆转.线粒体跨膜电位的存在, 使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3, 3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6(3)]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质, 其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低.将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM), JC-1(1mM), TMRM(100nM), 37°C平衡30min, 流式细胞计检测细胞的荧光强度.3、TUNEL法细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而发生年夜量的粘性3'-OH末端, 可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下, 将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标识表记标帜到DNA的3'-末端, 从而可进行凋亡细胞的检测, 这类方法（称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标识表记标帜法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL).由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂, 因而没有3'-OH形成, 很少能够被染色.TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色, 能准确地反应细胞凋亡典范的生物化学和形态特征, 可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定, 并可检测出极少量的凋亡细胞, 因而在细胞凋亡的研究中被广泛采纳.（3）DNA片断化检测1、年夜分子染色体DNA片段的测定细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300 kbp长的DNA年夜片段.所有超越一定分子量年夜小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同.线性DNA的双螺旋半径超越凝胶半径时, 即到达分辨力的极限.此时凝胶不再按分子量的年夜小来筛分DNA, DNA 像通过弯管一样, 以其一端指向电场一极而通过凝胶, 这种迁移模式称之为"爬行".因此, 细胞凋亡早期发生的50~300 kbp长的DNA年夜片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离.通常采纳脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题.这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场.每当电场方向改变后, 年夜的DNA分子便滞流在爬行管中, 直至新的电场轴向重新定向后, 才华继续向前移动.DNA 分子量越年夜, 这种重排所需要的时间就越长.当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时, DNA就可以按其分子量年夜小分开.2、DNA Ladder 测定细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单元之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp长的DNA 年夜片段, 或180~200 bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上暗示为梯形电泳图谱(DNA ladder).细胞经处置后, 采纳惯例方法分离提纯DNA, 进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色, 在凋亡细胞群中可观察到典范的DNA ladder.如果细胞量很少, 还可在分离提纯DNA后, 用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA 标识表记标帜, 然后进行电泳和放射自显影, 观察凋亡细胞中DNA ladder的形成.3、凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析（4）Caspase-3活性的检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用, 其中caspase-3为关键的执行分子, 它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能.Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中, 在凋亡的早期阶段, 它被激活, 活化的Caspase-3由两个年夜亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成, 裂解相应的胞浆胞核底物, 最终招致细胞凋亡.但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞, caspase-3的活性明显下降.1、westernblot2. 荧光分光光度计分析活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物, 水解D4-X肽键.根据这一特点, 设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC.在共价偶联时, AMC不能被激发荧光, 短肽被水解后释放出AMC, 自由的AMC才华被激发发射荧光.根据释放的AMC荧光强度的年夜小, 可以测定caspase-3的活性, 从而反映Caspase-3被活化的水平.（5）凋亡相关卵白TFAR19卵白的表达和细胞定位分析TFAR19(PDCD5)是增进细胞凋亡的增强剂.利用荧光素(FITC)标识表记标帜的TFAR19单克隆抗体为探针, 对细胞凋亡过程中TFAR19卵白的表达水平及定位研究发现, 凋亡早期TFAR19表达水平增高并呈现快速核转位现象, 陪伴着细胞核形态学的变动, 继续较长时间, 在凋亡小体中仍然可见.同时我们发现, 凋亡早期TFAR19卵白的核转位早于磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和细胞核DNA的片段化, 提示TFAR19卵白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一.进一步的研究证明, 凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义, 分歧细胞凋亡早期均呈现TFAR19高表达和核转位.这为研究细胞凋亡早期所发生的事件, 提供了一种新的技术和指标.创作时间：二零二一年六月三十日创作时间：二零二一年六月三十日。
如何在组织中检测细胞增殖,分化和凋亡
在组织中检测细胞增殖、分化和凋亡的方法一、检测细胞增殖的方法（1）直接方法：通过直接测定进行分裂的细胞来评价细胞的增殖能力1、胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。
用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。
但是具有放射性。
2、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。
CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。
当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。
这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
3、Brdu检测法Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu 单克隆抗体，ICC染色，显示增殖细胞。
同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义4、增殖标志检测有些抗原只存在于增殖细胞中，而非增值细胞缺乏这些抗原，您也可以通过特异性的单抗来对细胞增殖进行检测。
例如，在人体细胞中，Ki-67抗体识别同名蛋白，在细胞周期S期、G2期和M期表达，而在G0期和G1 期(非增殖期)不表达。
用针对Ki-67蛋白的单抗就可以检测细胞的增值情况。
由于需要组织切片，这种方法无法进行高通量分析。
不过这一方法颇受癌症研究者们的青睐，因为它能够用来检测体内肿瘤细胞的增殖。
其他普遍使用的细胞增殖或细胞周期调控标志还包括，增殖细胞核抗原PCNA、拓扑异构酶IIB和磷酸化组蛋白H3。
CFSE示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T淋巴细胞增殖的影响
◇实验方法学◇CFSE 示踪与流式细胞仪检测法研究环磷酰胺对T 淋巴细胞增殖的影响包晶晶,林海霞,马 璟(上海医药工业研究院国家上海新药安全评价研究中心,上海 201203)收稿日期:2009-12-30,修回日期:2010-03-18基金项目:科技部“十一五新药创制”重大专项资助课题(No2008ZX093052006);上海市科委企业技术创新团队项目资助(No 08430516200)作者简介:包晶晶(1983-),女,硕士生,E 2mail:jjb19831@g mail .com;马 璟(1963-),女,博士,研究员,博士生导师,通讯作者,Tel:0212508003332106中国图书分类号:R 2332;R 329.24;R 331.125;R 979.1;R 979.5文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2010)06-0828-05摘要:目的 利用定量分析羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyflu 2orescein diacetate succini m idyl ester,CFSE )时间系列数据的方法研究淋巴细胞细胞增殖动力学及免疫抑制剂对淋巴细胞增殖抑制机制的研究。
方法 环磷酰胺造成小鼠免疫抑制模型,并用CFSE 染料给对照组和给药组动物的淋巴细胞染色,通过数学模型拟合法分析数据。
结果 对照组和给药组淋巴细胞增殖进入第一代分裂的时间分别是27117h 和22188h,每代细胞死亡率分别为20%和40%;进入分裂前的细胞半衰期分别为31153h 和43132h 。
结论 通过数学拟合法对CFSE 数据进行定量分析,探讨药物对淋巴细胞增殖影响的机制,该实验中的药物环磷酰胺抑制淋巴细胞增殖的方式可能是使细胞增殖时每代细胞的死亡率增加所致。
关键词:CFSE;定量分析;数学拟合;流式细胞仪;淋巴细胞增殖;环磷酰胺 传统的测定淋巴细胞增殖的方法只能通过细胞数量的变化来反映细胞增殖的的变化,不能更深入的洞察细胞增殖是如何被改变的。
CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化
素（ Ｐ Ｈ Ａ） 和佛 波酯 （ Ｐ ＭＡ） 培养７ ２ ｈ对淋 巴细胞分裂与增殖 的影 响． 并采用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法检 测不 同刺激剂
对淋 巴细胞上 清 Ｉ Ｆ Ｎ ￣ ／ 质量浓度的影响． ０ ． １ ２ ５ ｍＬ的抗 Ｃ Ｄ ３ ／ ２ ８抗体和 ５或 １ Ｏ ｇ ／ ｍ Ｌ的 Ｐ Ｈ Ａ 可
ｏ ｆ Ｎｏ ｎ—Ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ｌ ａ Ｄｒ ｕ ｇ Ｍｅ ｔ ａ ｂ ｏ ｌ ｉ ｓ ｍ ｎｄ ａ Ｐ Ｋ ／Ｐ Ｄ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ，Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｍａ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ
中图分 类号 ： Ｒ ４ ４ ６
文献标识码 ： Ａ
文章 编号 ： １ ６ ７ ２— ０ ９ ４ ６ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ２— ０ １ ２ ９— ０ ６
ＣＦＳ Ｅ— － ｌ ａ ｂ ｅ ｌ ｅ ｄ ｐｒ ｏ ｌ ｉ ｆ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｓ ｆ ｏ ｒ ａ ｓ ｓ ｅ ｓ ｓ ｍｅ ｎｔ ｏ ｆ Ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｆ ｕｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎｄ ｕｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｄ ｉ ｆｅ ｒ ｅ ｎｔ ｓ ｔ ｉ ｍｕ ｌ ａ ｎｔ ｓ
Ｖ ｏ １ ． ３ ３ Ｎ ｏ ． ２
Ａ ｐ ｒ ． ２ ０ １ ７
Ｃ Ｆ Ｓ Ｅ法 检 测 刺 激 剂 对 淋 巴细胞 增 殖 与活 化
薛妮娜 坤 ， 董 凯 ， 来芳芳 ， 黄 蕊 ， 陈晓光ｈ
（ １ ．中国医学科学 院药物研究所 ， 天然药物活性物 质与功能 国家重点实验室／ 创新药物非Ｉ 临床药物 代谢及 Ｐ Ｋ ／ Ｐ Ｄ研究北京市重点实验 室 ， 北京 １ ０ ０ ０ ５ ０； ２ ．天津红 日药业股份有 限公 司 ， 天津 ３ ０ １ ７ ０ ０ ）