第三章 荧光光度法
分子荧光光度法测定荧光素
分子荧光光度法测定荧光素分子荧光光度法测定荧光素，听起来就像是个神秘的科学实验，其实呢，它其实没那么复杂，反而充满了趣味。
想象一下，在实验室里，灯光微微暗下来，空气中弥漫着一股神秘的气息，心里暗自期待着将要发生的事情。
你手里握着的不是一把利器，而是一台看似普通的仪器，但它却能把荧光素的秘密一一揭开。
这种荧光素，它可不是个平凡的家伙，想当年可是在实验室里风光无限。
它的光芒就像是夜空中的星星，闪烁着耀眼的光辉，吸引着每一个好奇的目光。
嘿，别以为这只是个简单的过程哦。
要搞清楚荧光素是什么。
它是某些生物体内的产物，比如小青蛙的皮肤，或者某些海洋生物的体内，想想就觉得有点神奇。
我们用分子荧光光度法，简单来说，就是通过一种仪器，看看荧光素在光照下的表现。
那种色彩斑斓的光芒，简直是让人目不暇接，仿佛置身于一个色彩缤纷的梦境。
你可以想象，它在光照下跳动的样子，就像小孩在草地上追逐蝴蝶，活泼又可爱。
在这过程中，首先要准备好荧光素的样品，可能是提取自生物体的，也可能是实验室合成的，反正你得确保它的纯度。
要是杂质多，那可就麻烦了，可能会影响测量的结果。
就像做菜一样，食材的新鲜度很重要嘛，调味料也要放对了。
我们需要选择合适的波长，调好仪器。
这时候，你就像是一个调酒师，认真调整每一个细节，确保最终的“饮品”味道独特。
波长选择得当，荧光素的光芒就会如期而至，照亮整个实验室。
荧光光度法的关键在于灵敏度。
就像是你去酒吧喝酒，调酒师的手艺越好，喝到的酒就越美味。
荧光素在合适的光照下，表现得淋漓尽致，发出的光越亮，代表浓度越高。
想想看，那一瞬间，仿佛时间都静止了，你心里感到一阵小小的自豪。
看到数据一目了然，结果清晰可见，简直就像发现了新大陆，内心的小宇宙瞬间爆发。
但注意啦，处理数据也不能马虎。
这就像是填报高考志愿一样，得认真对待，不能掉以轻心。
根据测得的荧光强度，计算出浓度，公式在手，心里有谱。
将实验结果与标准曲线对比，这一步可别大意，做错了可就前功尽弃，像是拼图时缺了几块，怎么也拼不完整。
荧光光度分析法及药物分析
荧光光度分析法与药物分析化材院化工3班姚依弟10081224前言当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的光，而当紫外光停顿照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。
利用这种能够反映物质特性的荧光对该物质进展定性和定量分析的方法称为荧光分析法。
荧光是分子从激发态的最低振动能级回到它原来的基态时发射的光，激发的完成是由于光的吸收。
吸收与荧光密切相关，因为吸收必须先于荧光发射。
由于碰撞和热的耗散常使一局部吸收能丧失，剩余荧光的能量比吸收的能量小，因此荧光在更长的波长发射。
【一】荧光分光光度法的分析方法荧光分析的灵敏度一般都高过应用最广泛的比色法和分光光度法。
比色法及分光光度法的灵敏度通常在千万分之几；而荧光分析法的灵敏度常达亿分之几，甚至有千亿分之几的。
荧光分析法的另一优点是选择性高。
荧光分析法还有方法快捷，重现性好，取样容易，试样需要少等优点。
荧光分析法也有它的缺乏之处，主要是指它比起其它方法来说应用X围还不够广泛，因为有许多物质本身不会产生荧光。
为使荧光分析法的应用更加广泛，开展了各类荧光分析方法，如对不发荧光的物质可通过某类化学反响使其转变为适合测定的荧光物质，对荧光较弱的物质可采取荧光增敏分析法。
荧光分析法可分为直接荧光测定法和间接荧光测定法。
直接测定法是利用物质自身发射的荧光进展定量测定。
但是自身发荧光的药物寥寥无几，所以一般采用间接法测定。
1、直接荧光分析法直接荧光分析法适用于自身能产生荧光的药物。
因荧光性质与溶液的EF值有关，故荧光强度的测定需在适宜的EF缓冲溶液中进展。
对于成分复杂的生物供试品，为了防止干扰，有时需利用萃取、沉淀、色谱别离等方法除去干扰物，以降低荧光空白本底，提高分析灵敏度。
已用于直接荧光分析法的药物有盐酸洛哌丁胺、双水杨酯、左旋溶肉瘤素、叶酸等。
本身能发荧光的物质,可用荧光分光光度法直接测定。
鲍霞认为可用荧光分光光度法直接测定氧氟沙星胶囊的含量。
第三章 紫外 荧光 习题
第三章、紫外、可见及荧光光谱法一、选择题1. 下列说法哪个是错误的？( )(1) 荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应(2) 最长的荧光波长与最长的激发光波长相对应(3) 荧光光谱与激发光波长无关(4) 荧光波长永远长于激发光波长2. 按一般光度法用空白溶液作参比溶液，测得某试液的透射比为10%，如果更改参比溶液，用一般分光光度法测得透射比为20% 的标准溶液作参比溶液，则试液的透光率应等( ) (1) 8%(2) 40%(3) 50%(4) 80%3. 下列化合物中，同时有n→π*，π→π*，σ→σ*跃迁的化合物是( )(1) 一氯甲烷(2) 丙酮(3) 1,3-丁二烯(4) 甲醇4. 双波长分光光度计的输出信号是( )(1) 试样吸收与参比吸收之差(2) 试样在λ1和λ2处吸收之差(3) 试样在λ1和λ2处吸收之和(4) 试样在λ1的吸收与参比在λ2的吸收之差5. 在吸收光谱曲线中，吸光度的最大值是偶数阶导数光谱曲线的( )(1) 极大值(2) 极小值(3) 零(4) 极大或极小值6. 在紫外光谱中，λmax最大的化合物是( )7. 用实验方法测定某金属配合物的摩尔吸收系数ε，测定值的大小决定于( )(1) 配合物的浓度(2) 配合物的性质(3) 比色皿的厚度(4) 入射光强度8. 双光束分光光度计与单光束分光光度计相比，其突出优点是( )(1) 可以扩大波长的应用范围(2) 可以采用快速响应的检测系统(3) 可以抵消吸收池所带来的误差(4) 可以抵消因光源的变化而产生的误差9. 下列结构中哪一种能产生分子荧光？( )10. 有下列四种化合物已知其结构，其中之一用UV 光谱测得其 max 为302nm ，问应是哪种化合物 ( )11. 许多化合物的吸收曲线表明，它们的最大吸收常常位于 200─400nm 之间对这一光谱区应选用的光源为 ( )(1) 氘灯或氢灯(2) 能斯特灯(3) 钨灯(4) 空心阴极灯灯12. 所谓真空紫外区,所指的波长范围是 ( )(1)200～400nm (2)400～800nm (3)1000nm (4)10～200nmOHNO 2COOHI (1)(2)(3)(4)CH 3CH CHCOCH 3CH 3CH 3(4)(3)(2)BrOHOOCH 3CH 3CH 3(1)13. 下列四种波数的电磁辐射属于可见光区的是( )(1)980cm-1 (2)2.0³104cm-1 (3)5.0cm-1 (4)0.1cm-114. 波长为500nm的绿色光其能量( )(1)比紫外光小(2)比红外光小(3)比微波小(4)比无线电波小15. 下列四种化合物中,在紫外光区出现两个吸收带者是( )(1)乙烯(2)1,4-戊二烯(3)1,3-丁二烯(4)丙烯醛16. 助色团对谱带的影响是使谱带( )(1)波长变长(2)波长变短(3)波长不变(4)谱带蓝移17. 紫外-可见吸收光谱曲线呈高斯分布的是( )(1)多普勒变宽(2)自吸现象(3)分子吸收特征(4)原子吸收特征18. 指出下列哪种是紫外-可见分光光度计常用的光源？( )(1) 硅碳棒(2) 激光器(3) 空心阴极灯(4) 卤钨灯19. 指出下列哪种不是紫外-可见分光光度计使用的检测器( )(1) 热电偶(2) 光电倍增管(3) 光电池(4) 光电管20. 指出下列哪种因素对朗伯-比尔定律不产生偏差？( )(1) 溶质的离解作用(2) 杂散光进入检测器(3) 溶液的折射指数增加(4) 改变吸收光程长度21. 分子荧光过程是( )(1) 光致发光(2) 能量源激光发光(3) 化学发光(4) 电致发光22. 在分子荧光测量中, 在下列哪一种条件下, 荧光强度与浓度呈正比? ( )(1) 荧光量子产率较大(2) 在稀溶液中(3) 在特定的激发波长下(4) 用高灵敏度的检测器23. 下列哪种方法的测量灵敏度高? ( )(1) 磷光分析法(2) 荧光分析法(3) 紫外-可见分光光度法(4) 目视比色法24. 已知相对分子质量为320的某化合物在波长350nm处的百分吸收系数(比吸收系数)为5000, 则该化合物的摩尔吸收系数为( )(1)1.6³104L/(moL·cm)(2)3.2³105 L/(moL·cm)(3)1.6³106 L/(moL·cm)(4)1.6³105 L/(moL·cm) 25. 在310nm时, 如果溶液的百分透射比是90%,在这一波长时的吸收值是( )(1) 1 (2) 0.1 (3) 0.9 (4) 0.0526. 荧光分析法和磷光分析法的灵敏度比吸收光度法的灵敏度( )(1) 高(2) 低(3) 相当(4) 不一定谁高谁低27. 紫外-可见吸收光谱主要决定于( )(1)分子的振动、转动能级的跃迁(2) 分子的电子结构(3) 原子的电子结构(4) 原子的外层电子能级间跃迁28. 分析线和内标线符合均称线对的元素应该是( )(1)波长接近(2)挥发率相近(3)激发温度相同(4)激发电位和电离电位相近29. 指出下列不正确的说法？( )(1) 分子荧光光谱通常是吸收光谱的镜像(2) 分子荧光光谱与激发波长有关(3) 分子荧光光谱较激发光谱波长长(4) 荧光强度与激发光强度呈正比30. 下列哪一种分子的去激发过程是荧光过程? ( )(1) 分子从第一激发单重态的最低振动能级返回到基态(2) 分子从第二激发单重态的某个低振动能级过渡到第一激发单重态(3) 分子从第一激发单重态非辐射跃迁至三重态(4) 分子从第一激发三重态的最低振动能级返回到基态31. 下列哪种说法有错误? ( )(1) 荧光分子的激发光谱与发射波长无关(2) 荧光分子的激发光谱的荧光强度是激发波长的函数(3) 在分子荧光光谱法中吸收与激发光谱常可以互换(4) 得到荧光分子的激发光谱方法与常规吸收光谱方法是两种基本相同的方法32. 在荧光光谱中, 测量时, 通常检测系统与入射光的夹角呈( )(1) 180°(2) 120°(3) 90°(4) 45°33. 某荧光物质的摩尔吸收系数为2.0³105L/(mol⋅cm),当用激发光强度为50(随机单位)去激发该荧光物质, 若吸收池为1.0cm, 化合物浓度为5.0 ³10-7mol/L,测得荧光强度为2.3(随机单位), 则该化合物的荧光量子效率约为( )(1) 0.2 (2) 0.46 (3) 23 (4) 2.334. 某化合物在λmax=356nm处, 在乙烷中的摩尔吸收系数εmax=87 L/(mol⋅cm), 如果用1.0cm 吸收池,该化合物在已烷中浓度为 1.0 ³10-4mol/L,则在该波长处, 它的百分透射比约为( )(1) 87% (2) 2% (3) 49% (4) 98%35. 某化合物的浓度为1.0 ³10-5mol/L,在λmax=380nm时, 有透射比为50%, 用1.0cm吸收池, 则在该波长处的摩尔吸收系数εmax /[L/(mol⋅cm)]为( )(1) 5.0 ³104(2) 2.5 ³104(3) 1.5 ³104(4) 3.0 ³10436. 在分光光度计的检测系统中, 以光电管代替硒光电池, 可以提高测量的( )(1) 灵敏度(2) 准确度(3) 精确度(4) 重现性37. 基于吸收原理的分析方法是( )(1) 原子荧光光谱法(2) 分子荧光光度法(3) 光电直读光谱法(4) 紫外及可见分光光度法38. 在紫外-可见分光光度计中, 强度大且光谱区域广的光源是( )(1) 钨灯(2) 氢灯(3) 氙灯(4) 汞灯39. 欲分析165～360nm的波谱区的原子吸收光谱, 应选用的光源为( )(1)钨灯(2)能斯特灯(3)空心阴极灯(4)氘灯40. 在光学分析法中, 采用钨灯作光源的是( )(1)原子光谱(2)分子光谱(3)可见分子光谱(4)红外光谱41. 荧光分析是基于测量( )(1)辐射的吸收(2)辐射的发射(3)辐射的散射(4)辐射的折射42. 荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计的主要区别在于( )(1) 光路(2) 光源(3) 单色器(4) 光电倍增管43. 用于测量荧光辐射的检测器是( )(1)光电池(2)热导池(3)热电偶(4)光电倍增管44. 双波长分光光度计的输出信号是( )(1)试样与参比吸收之差(2) 试样与参比吸收之和(3)试样在λ1和λ2处吸收之差(4) 试样在λ1和λ2处吸收之和45. 常用的紫外区的波长范围是( )(1)200～360nm (2)360～800nm (3)100～200nm (4)103nm46. 下面哪一种电子能级跃迁需要的能量最高? ( )(1) σ→σ*(2) n→σ *(3) π→π* (4) π→σ*47. 化合物中CH3--Cl在172nm有吸收带,而CH3--I的吸收带在258nm处,CH3--Br 的吸收带在204nm ,三种化合物的吸收带对应的跃迁类型是( )(1) σ→σ*(2) n→π* (3) n→σ *(4)各不相同二氧六环=295nm，该吸收峰的跃迁类48. 某化合物在乙醇中λmax乙醇=287nm,而在二氧六环中λmax型是（）(1) σ→σ* (2) π→π* (3) π→σ* (4) π→π*49. 一化合物溶解在己烷中,其λmax 己烷=305 nm ，而在乙醇中时，λ乙醇=307nm ，引起该吸收的电子跃迁类型是( )(1) σ→σ * (2)n →π * (3) π→π * (4) n →σ *50. 在紫外－可见光谱区有吸收的化合物是 （ ）(1) CH 3-CH=CH-CH 3 (2) CH 3-CH 2OH(3) CH 2=CH-CH 2-CH=CH 2 (4) CH 2=CH-CH=CH-CH 351. 在254nm 时，如果溶液的百分透射比是10％，其吸光度值为 （ 〕(1) 1 (2) 0.9 (3) 0.1 (4) 0.0552. 某化合物在己烷中（λmax ＝220nm ）的摩尔吸收系数εmax ＝14500L/(moL·cm)，若用1.0cm吸收池，1.0³10－4mol/L 的该化合物在该波长处的百分透射比为（ ）(1) 5% (2) 3.5% (3)10% (4)50%53. 对某特定的仪器，其透射比的标准偏差为0.006，对某溶液测得的透射比T ＝0.015 时那么浓度的相对标准偏差是 （ ）(1) +2.5% (2) +5.0% (3) +9.5% (4) +12.5%54. 对某特定的仪器，其透射比的标准偏差为0.006，当测得溶液的百分透射比T ＝64.8％时，则浓度的相对标准偏差是 （ ）(1) +6.6% (2) +4.2% (3) +3.4% (4) +2.1%55. 对某特定的仪器，其透射比的标准偏差为0.006，当测得溶液的吸光度A ＝0.334时， 则浓度的相对标准偏差是 （ ）(1) +0.6% (2) +1.7% (3) +3.5% (4) +7.6%56. 比较下列化合物的UV －VIS 光谱λmax 大小 （ ）(1)a>b>c (2)c>a>b (3)b>c>a (4)c>b>a57. 比较下列化合物的UV －VIS 吸收波长的位置（λmax ） ( )(C)CH 3OCH 3O C (b)COOH O Cl(a)O(1) a>b>c (2) c>b>a (3)b>a>c (4)c>a>b58. 在紫外－可见吸收光谱中，下列具有最大吸收波长的物质是 （ ） CH 3CHO N(CH 3)2 (a)OH O Cl CH 3COOC 2H 5(b)COOHCl (CH 3)2N (C)59. Fe 和Cd 的摩尔质量分别为55.85g/mol 和112.4g/mol ，各用一种显色反应用分光光度法测定，同样质量的两元素分别被显色成容积相同的溶液，前者用2cm 吸收池，后者用1cm吸收池，所得吸光度相等，此两种显色反应产物的摩尔吸收系数为（ ）(1) ε Fe ≈2ε Cd (2) ε Cd ≈2ε Fe (3) ε Cd ≈4ε Fe (4) ε Fe ≈4ε Cd60. 双波长分光光度计和单波长分光光度计的主要区别是 （ ）(1)光源的个数 (2)单色器的个数 (3)吸收池的个数 (4)单色器和吸收池的个数61. 物质的颜色是由于选择性地吸收了白光中的某些波长所致，CuSO 4 溶液呈蓝色是由于它吸收了白光中的 （ ）(1) 蓝色光 (2) 绿色光 (3) 黄色光 (4) 红色光62. 符合朗伯－比尔定律的有色溶液稀释时，其最大吸收峰的波长位置 （ ）(1) 向长波方向移动 (2) 向短波方向移动(3) 不移动，但最大吸收峰强度降低 (4) 不移动，但最大吸收峰强度增大63. 某金属离子X 和R 试剂形成一有色配合物，若溶液中X 的浓度为1.0³10－4mol/L ， 用1cm 吸收池在525nm 处测得吸光度为0.400，则此配合物在525nm 处的摩尔吸收系数为( ）(1) 4.0³10-3 (2) 4.0³103 (3) 4.0³10-4 (4) 4.0³10464. 以下三种分析方法：分光光度法（S ）、磷光法（P ）和荧光法（F ），具有各不相同的灵敏度，按次序排列为 ( ）(1) P<F<S (2) S=F<P (3) P<S<F (4) F>P>S65. A 和B 二物质紫外－可见吸收光谱参数如下：物质 λ1时的摩尔吸收系数 λ2时的摩尔吸收系数/[L/(moL·cm)]A 4,120 0.00B 3,610 300若此二种物质的某溶液在λ1时在1.00cm 吸收池中测得A ＝0.754，在λ2时于10.0cm 吸收池中测得A ＝0.240，问B 的浓度是多少？（ ）(1) 0.64³10-5mol/L (2) 0.80³10-5 mol/L (3) 0.64³10-4mol/L (4) 0.80³10-4mol/L66. 分光光度法中，为了减小浓度测量的相对误差，配制的试样溶液的透射比应控制在什么范围？ （ ）(1) 小于1% (2) 1%-10% (3) 30%-50% (4) 90%-99%67 K I O 4法氧化Mn 2+到MnO 4－，然后用分光光度法测定，选择合适的空白为（ ）(1) 蒸馏水 (2) 试剂空白 (3) 除K I 外的试剂空白 (4) 不含K I O 4的溶液空白68. 在分光光度法中，运用朗伯－比尔定律进行定量分析采用的入射光为（ ）（1）白光 （2）单色光 （3）可见光 （4）紫外光69. 在分光光度法中，运用朗伯－比尔定律进行定量分析采用的入射光为（ ）（1）白光 （2）单色光 （3）可见光 （4）紫外光70. 邻二氮菲亚铁配合物的最大吸收波长为510nm ，如用光电比色计测定时应选哪种滤光片？ （ ）（1）红色 （2）黄色 （3）绿色 （4）蓝色71. 分子运动包括有电子相对原子核的运动（E 电子）、核间相对位移的振动（E 振动）和转动O(1)(2)(3) (4)（E 转动）这三种运动的能量大小顺序 （ ）(1) E 振动>E 转动>E 电子 (2) E 转动>E 电子>E 振动 (3) E 电子>E 振动>E 转动 (4) E 电子>E 转动>E 振动72. 现有紫外－可见吸收光谱相互干扰的A 和B 两组分，它们的最大波长分别为λA 和λB ，若用双波长测定A 组分的含量，则下面哪一种选择λ1和λ2的方法是正确的？（ ）（1）使λ1和λ2分别等于λA 和λB （2）选λ1等于λA ，选λ2使B 组分在λ2的吸光度和它在λ1处的吸光度相等 （3）选λ1等于λA ，选λ2为A ，B 两组分吸收峰相交处的波长 （4）选λ1等于λB ，选λ2使A 组分在λ2的吸光度和它在λ1处的吸光度相等73. 某化合物在乙醇中的λmax ＝240nm ，εmax ＝13000L/(moL·cm)，则该UV －VIS 吸收谱带的跃迁类型是（ ）(1) n →σ * (2) n →π * (3) π →π * (4) σ →σ *74. 在分子荧光法中，以下说法中正确的是 （ ）（1）激发过程中的电子自旋虽不变，但激发态已不是单重态（2）激发态电子的自旋不成对，此状态称为单重态 （3）激发三重态能级比相应激发单重态能级要低一些（4）单重态到三重态的激发概率高于单重态到单重态75. 在分子荧光分析法中，以下说法正确的是 （ ）（1）分子中π电子共轭程度越大，荧光越易发生，且向短波方向移动（2）只要物质具有与激发光相同的频率的吸收结构，就会产生荧光（3）分子中π电子共轭程度越大，荧光越易发生，且向长波方向移动（4）非刚性分子的荧光强于刚性分子76. 在分子荧光分析法中，下面说法正确的是 （ ）（1）荧光发射光谱不随激发波长的变化而改变（2）荧光发射光谱要随激发波长的变化而改变（3）荧光激发光谱与它的紫外－可见吸收光谱互为镜像对称关系（4）荧光发射光谱与它的紫外－可见吸收光谱形状相似且波长位置也一样77. 在分子荧光分析法中，下面说法不正确的是 （ ）（1）吸电子基团常使荧光增强（2）将一个高原子序数的原子引入到π体系中，使荧光减弱（3）与π电子体系作用小的取代基引入，对荧光影响不明显（4）给电子基团常使荧光增强78. 化合物（1）的烯醇式乙酰化产物可能是（2）和（3），它的紫外吸收λmax 为238nm(lg εmax =4.2)。
荧光光度法测定天然水中痕量的苯酚和苯胺
ＷＡＮ Ｇ ｕ —ｚ ｏ ｇ Ｘｉ — ｈ ｎ
（ ｏ ｅｅｏ ｈｍ ｓｙａｄＰ ａ ｃｕ ｃｌ ｃ ｎｅ ， ｉｇａ ｇ ｃｌ ｒｌ ｎｖｒ ｔ， ｈｎｎ ｉｇａ ６ １９ Ｃ ｉａ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｅ ｉｒ ｎ ｈｒ ｅｔ ａ Ｓｉ ｃｓ Ｑ ｎｄｏＡ ｒ ｕｔ ａ Ｕ ｉ ｓｙ Ｓａ ｇｏｇＱｎ ｄｏ ６０ ， ｈｎ ） ｌ Ｃ ｔ ｍａ ｉ ｅ ｉ ｕ ｅｉ ２
关键词 ： 苯酚； 苯胺 ； 荧光光度法； 天然水
Ｄｅ ｅ ｍ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ａ ｅ Ａｍ ｏ ｎｔｏ ｔ ｒ ｎ ｔｏ ｆ Ｔｒ ｃ ｕ ｆ Ｐｈｅ ｏ ｎ ｉｉ ｙ Ｆｌ ｏ ｅ ｃ ｎｃ ｎ ｌａ ｄ Ａｎ ｌ ｎｅ ｂ ｕ ｒ ｓ ｅ ｅ
Ｓ ｃ ｒ ｐ ｔ ｍ ｅ ｒ ｎ Ｎａ ｕ ａ ａ ｅ ｐｅ ｔ ｏ ｈｏ ｏ ｔ ｙ ｉ ｔ ｒ ｌＷ ｔ ｒ
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荧光光谱法
荧光分析法测定维生素B2一、实验目的1．学习和掌握荧光光度分析法测定维生素B2的基本原理和方法；2．熟悉荧光分光光度计的结构及使用方法；3. 学习掌握固体及液体试样的荧光测试方法。
二、实验原理当用一种波长的光照射某种物质时，这种物质会在极短的时间内，发射出一种比照射光波长较长的光，这种发射出来的光就叫做荧光。
当照射光停止照射时，荧光也随之很快地消失。
利用某些物质被紫外光照射后所产生的、能够反映出该物质特性的荧光，以进行该物质的定性分析和定量分析，称为荧光分析。
实验证明，荧光通常发生于具有刚性平面的л - 电子共轭体系分子中。
随着л-电子共轭度和分子平面度的增大，荧光也就越容易产生。
因此几乎所有对分析化学有用的荧光体系都含有一个以上的芳香基团，芳环数越多，荧光愈强。
能发荧光的纯无机物很少，通常是利用有机配位体与金属离子形成荧光络合物进行无机离子的分析。
图1．荧光分光光度计的结构原理图荧光分光光度计工作原理（图1）可简述为：光源发出的光束经激发单色器色散，提取所需波长单色光照射于样品上，由样品发出的荧光经发射单色器色散后照射于检测器上，检测器把荧光强度信号转变为电信号并经放大器放大后，由信号显示系统显示或者记录。
荧光光谱包括激发光谱和发射光谱两种。
激发光谱是是指发射单色器波长固定，而激发单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随激发光波长变化的曲线。
荧光发射光谱是指激发单色器波长固定，发射单色器进行波长扫描所得到的荧光强度随发射光波长变化的曲线。
一般所说的荧光光谱实际上仅指荧光发射光谱。
这一光谱为分析指出了最佳的发射波长。
荧光定性定量分析与紫外可见吸收光谱法相似。
定性时，是将实验测得样品的荧光激发光谱和荧光发射光谱与标准荧光光谱图进行比较来鉴定样品成分，一般荧光定性的依据是荧光光谱峰的个数、位置、相对强度及轮廓。
定量分析时，一般以激发光谱最大峰值波长为激发光波长，以荧光发射光谱最大峰值波长为发射波长，测量样品的荧光强度。
分子荧光光度法基本原理
400
450
500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、物质分子结构与荧光的关系
（一）荧光效率（φf） 激发态分子中以发射荧光的光量子数目和 分子吸收激发光的光量子总数之比：
φf =
发射荧光的光量子数目 吸收激发光的光量子总数
[ φf∈（0，1）]
激发态的分子有几种途径可以回到基态, 荧光去 激发比其它去激发快 ,才可以观 察到荧光发射。
（二） 荧光和磷光的产生 激发态分子在极短的时间内回到 去活化过程： 基态的过程 。
无辐射跃迁
途径 体系跨越 -----最常见 辐射跃迁
1. 无辐射跃迁
振动驰豫 内转换 体系跨越 外转换
① 振动驰豫 较高能级分子与其它分子（样品或溶剂） 碰撞，能量变为热能。 ② 内转换和体系跨越 当两个相邻电子能级相距较近以致其振 动能级重叠，电子由较高电子能级以无辐射 跃迁方式至低一级电子能级，称为内转换。
（3）镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与 激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 镜像规则的解释：
基态上的各 振动能级分布 与第一激发态 上的各振动能 级分布类似。
基态上的零振动能级与第一激发态的二 振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也 然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
250
300
350
620
3.激发光谱与发射光谱的关系 （1）Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫 消耗了能量。 （2）发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同 波长的能量（如能级图 2 , 1），产生不同 吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振 动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧 光（如’2 ）。
第三章 荧光分光光度法
螯合物中金属离子的发光机理，通常是 螯合物首先通过配位体的*跃迁而被激 发，接着配位体把能量转移给金属离子，导 致d d*跃迁或f f*跃迁，最终发射的是 d*d跃迁或f*f跃迁光谱。
3.3 荧光分析的方法及影响因素 1. 荧光参数 （1）激发光谱和发射光谱 荧光的激发光谱和发射光谱是用荧光 法进行物质的定性、定量分析的基本参数 和依据。
b. 工作曲线法 先配制一系列不同浓度的标准溶液，分 别测定其荧光值，然后将减去试剂空白荧光 值的标准溶液荧光值与其相应浓度作图，即 得其工作曲线。 根据试液及试液空白荧光值，在此曲线 上即可找到试液的浓度。同时根据工作曲线 的线性情况，可以确定试液测定的最高浓度。
b. 分子的几何排布 物质的分子为平面型，且具有一定的刚 性结构，这样的分子荧光强烈。
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团 在同一侧，由于位阻原因不能共平面，而没 有荧光。
c. 芳环上取代基的类型和位置 类型 • 有些取代基可增强荧光。如：-OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等；
•
有些取代基可减弱荧光。如：-COOH、 -C=O、-NO2、-Cl、-Br、-I等； 有些取代基影响不明显。如：-F、-SH、 -SO3H等。
不少有机化合物虽然具有共轭双键，但 由于不是刚性结构，分子处于非同一平面， 因而不发生荧光。
若这些有机化合物和金属离子形成螯合 物后，伴随着分子的刚性增强，平面结构增 大，常会发出荧光。
例如：8-羟基喹啉本身有很弱的荧光， 但其金属螯合物具有很强的荧光。这是由于 刚性和其平面性增加所致。
一般来说，能产生这类荧光的金属离子 具有硬酸型结构，如：Be2+、Mg2+、Al3+等。
•
位置 • 邻、对位取代，荧光增强；
第三章 分子荧光光度法
测器，检测方向与激发光成直角。
由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发波 透光强度为I；荧光物质被激发后，发射荧光F。 为消除入射光的影响，荧光测量通常在与激发光 成直角的方向上进行。
长I0，经样品池后，一部分光能被荧光物质吸收，
第二发射单色器的设置是为了消除可能共存的
其它光线的干扰，如散射光以及溶液中其它杂 质所发生的荧光，以获得所需要的荧光，让其 作用于检测器上，得到相应的电信号，经放大 后作记录。 §3-5 分子荧光光度法的特点及应用
一.荧光光度法的特点 1.灵敏度
与紫外—可见光度法比较，荧光法检测是在
黑背景下进行，所以其灵敏度要高出2∼4个
数量级，测定下限为0.1∼0.001g/mL。
2.选择性强
荧光法既能依据特征发射又能依据特征吸收
来检定物质。如某几个物质的发射光谱相
似，则可从激发光谱的差异来区分；而如果
它们的激发光谱相同，则可通过发射光谱将
激发光谱和荧光发射
光谱的特点：
(1)荧光发射光谱与激
发波长无关，如前所述，
无论引起物质激发的波
长是1还是2，但荧光
发射波长都为3。
这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基 态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收
带；由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫
回到第一激发态的几率很高，远远大于由高能
决定于第一电子激发态中各振动能级的分布状况；
三．荧光和分子结构的关系 产生荧光的分子必须具备下列条件： (一)物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频
率的吸收结构，才能吸收激发光。
(二)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光效率。 荧光效率也称为荧光量子产率，表示物质发 射荧光的本领，为发出荧光量子数和吸收激发 光量子数的比值。
荧光光度法测定二氯荧光素
荧光光度法测定二氯荧光素一、实验目的1.了解荧光光度法的基本原理。
2.掌握荧光物质的标准曲线法定量测量含量的操作方法和原理。
3.掌握wgy-10荧光分光光度计使用方法，熟悉测量软件的数据处理。
二、方法原理分子在紫外和可见光的照射下，可吸收辐射形成激发态分子。
分子外层的电子在10-8s内返回基态。
在返回基态的过程中，部分能量通过热能形式释放，另一部分能量则以辐射光的形式释放。
这种分子在光照射下，分子外层电子从第一激发态的最低振动能级跃迁至基态各振动能级时，发射出来的光称为分子荧光，因此荧光是一种光致发光现象。
荧光光谱包括激发谱和发射谱。
激发谱和吸收谱极为相似，呈镜象对称关系。
激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。
发射谱中最大荧光强度的位置称为 max，是荧光光谱的一个重要参数。
分子发射的荧光强度与浓度的关系遵循比尔定律：I=2.3kbcI0。
在一定条件及一定浓度范围内，荧光强度与物质浓度成线性关系。
一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强。
如荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对荧光强度有较大影响。
荧光强度一般随介质粘度的升高而增强。
因为介质粘度增加，减少了分子碰撞，从而减少了能量损失。
三、仪器和试剂仪器：wgy-10荧光分光光度计（天津港东科技发展股份有限公司）试剂二氯荧光素（0~5 μg·mL-1）标准储备液：称取0.0100 g二氯荧光素（A.R.）加入1 mol·L-1 NaOH 5 mL，再加3 mL 1 mol·L-1 HCl溶解后，转移至100 mL容量中，用二次蒸馏水稀释至刻度、摇匀，备用；取0.50 mL上述溶液，转移至100 mL容量瓶中稀释至刻度，配成0.50 μg·mL-1标准储备液供配制标准系列用。
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
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3.2 荧光光谱曲线
* 激发光谱曲线和其吸收曲线可能相 同，但性质不同。 * 荧光光谱较激发光谱而言，位于长 波。
I 激发光谱
A、荧光效率（量子产率） = 发射荧光的分子数 / 激发分子总数 B、分子结构 是否有共轭双键体系，共轭高，荧光效率高 是否有刚性平面结构，刚性平面使荧光效率高 取代基类型，给电子基团使荧光增强，吸电 子基团使荧光减弱
3.5 荧光光度计
3.5.2 单色器
闪耀光栅
3.5.3 检测器
光电倍增管
3.6 实验技术
3.6.1 经常用标准基准物质校正仪器波长
3.6.2 选择溶剂
由于偶极、氢键作用，激发光谱和发射光谱 发生位移．增大溶剂极性可使荧光强度增强。
3.6 实验技术
3.6.3 浓度效应（内滤效应）
荧光物质浓度大时，光强与浓度不成线性关系。 原因：
3.7 荧光法的应用
3.7.2 时间分辨荧光法
脉冲光激发荧光体，形成激发态荧光群体， 激发群体随时间而衰变，记录讯号，进行积分。
激发 衰减时间 计数时间 t,ns
3.7 荧光法的应用
3.7.2 时间分辨荧光法 得在固定波长下的荧光强度-时间曲线及固 定时间的荧光发射光谱。 1. 用以对混合物中光谱重叠但寿命差异的 组分进行分辨并分别测定。 2. 通过调节延迟时间，可把不需要的信号 有效地消除以提高信噪比。 灵敏度提高3~4个数量级
A≠B
I
分
A≠B
可分
可分
λ
A=B
A=B
不可分 不可
λ
3.7 荧光法的应用
Case 2：
叶绿素a和叶绿素b的同步荧光分析
HC H3 C N CH2 N CH3 C CH3 H2 CH3 H3C HC CH2 N
CHO
N
Mg
H3 C
Mg
H3C
C CH3 H2 CH3
N
CH2 CH2
O O
N
COOCH3 O CH 3
与UV-VIS的两个差异： A.90角接收光信号——去除透射 B.两个单色器（选择激发光单色器、分离荧光单 色器）——去除杂散光
光源 第一单色器 或滤光片
激发
记录仪
荧光
第二单色器 或滤光片
样品池
3.5 荧光光度计
3.5.1 光源
A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞， 常用氙灯（波长： 200-700nm） C、激光光源
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
3.1 荧光的产生
3.1.1 荧光产生的必要条件 A、有吸收结构 B、入射光频率=特征频率 C、有高的荧光效率
3.2 荧光光谱曲线
激发光谱：固定发射波长，改变激发波长，测 荧光强度和激发光波长的关系。 荧光光谱：固定激发波长为最大激发波长处， 测不同波长时的荧光强度。
Case 1： 对环境样品中PAH的同步荧光测定
苯并芘 菲 萘 蒽
440
普 通 荧 光
同 步 荧 光
315 387 347
丁省
472
λ ，nm
λ ，nm
3.7 荧光法的应用
激发光谱
I
荧光光谱
激发
光谱
荧光
光谱
普通
荧光
可分
同步
荧光
可分
A=B
λ I
A≠B
A≠B
λ
A=B
不可分
可分
3.7 荧光法的应用
激发光谱 I 荧光光谱 激发 荧光 普通 同步 光谱 光谱 荧光 荧光
第三章 荧 光 光 度 法
Fluorescence Spectrometry
分子荧光：分子价电子跃迁 原子荧光：原子外层电子跃迁 X—荧光：原子内层电子跃迁
3.1 荧光的产生
分子在辐射能的照射下，电子跃迁至单重 激发态，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激 发态的最低振动能级，由此再跃回基态或基态 中其它振动能级时所发出的光。
N
N
H H
H H
CH3
3
CH 3
CH2 O CH2 COOCH3
O CH3 CH3
O
3
CH3
叶绿素a H+ 叶绿素a MW 893.48
叶绿素b 脱Mg叶绿素a MW592.67
3.7 荧光法的应用
C叶a ＝ka（I未－I酸） C叶b ＝kb（I未－I酸）
（上述2式经推导得出）
用标样C叶a和 C叶b，测未酸化和酸化后的荧光 强度I，可得ka ，kb。再测未知样。 由于叶绿素a和b结构相似，普通荧光法无法 分开，故采用同步荧光法。
3.3 荧光的影响因素
C、溶剂的影响 增大溶剂的极性使荧光增强 含重原子的溶剂（e.g. CBr4）使荧光减弱 D、荧光猝灭 激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互 作用，使能量转移，荧光强度减弱甚至消失 E、温度影响 温度上升，荧光减弱
3.4 定量分析
F = KI0CL = K’CL
: 荧光效率，K：仪器常数，
3.1 荧光的产生
基态和激发态 单重态和三重态：单重态的分子具有抗磁性 三重态的分子有顺磁性 跃迁分为：辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热）
三重态能级低于单 重态（Hund规则） 激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单 重态，以S1，S2…表示
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
C：浓度，I0：吸收光强
3.4 定量分析
分光法与荧光法定量比较
UV-VIS分光法 定量基础
A = lgI0/I 两个较大信号 I0和I的微小差别 与 有关 10-6-10-9
荧光法
F C 叠加在很小背景 值上的荧光信号 与 有关 10-9-10-12
灵敏度 检测限
3.5 荧光光度计
A、发光集中在一边 B、自吸收效应
3.6.4 温度的影响
低温荧光
3.7 荧光法的应用
3.7.1 同步荧光法
对多组分的测定 混合物荧光光谱比较复杂不易分开。使激发 和发射光波长保持一固定差距，对试样进行扫 描，获得荧光信号。 因为激发和发射光谱均一样的物质不多，因 而可提高选择性和分辨率。
3.7 荧光法的应用