分子生物学常用实验技术
分子生物学研究中常见的实验技术概述
分子生物学研究中常见的实验技术概述分子生物学是现代生物学研究的一个重要领域，它对生物的分子结构、功能和遗传表达等方面进行了深入的探究。
分子生物学的研究实验技术十分复杂和繁琐，但也是该领域成功进行研究和取得重大成果的必要手段。
本文将从PCR、基因克隆、蛋白质表达等多个方面，为读者概述分子生物学研究中常见的实验技术。
一、PCR技术PCR技术是分子生物学研究中最为重要的实验技术之一，其全称是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）。
PCR可以扩增DNA片段，从而使其更容易进行分析，是现代生物学和医学研究的重要基础。
PCR背后的主要技术是DNA复制，尤其是DNA双链的分离和单链的合成。
PCR技术发明后不久，在医学诊断、犯罪学鉴定、基因克隆和进化生物学等领域中就具备了重要的应用。
二、基因克隆基因克隆是分子生物学研究中另一个十分重要的实验技术。
基因克隆指的是将遗传物质的特定区域复制到载体DNA或病毒DNA中，然后再将其插入到宿主细胞中重新组装的过程。
基因克隆最常用的载体是质粒pBR322，其能合成产生抗生素解毒酶，这种抗生素成为已知的大部分细菌所不能耐受的抗生素，这就使得具有质粒pBR322的细胞成为极为重要的参照物。
基因克隆技术是生物工程、生物医学和农业等领域中的一项重要技术，其潜力在许多应用领域中是不可替代的。
三、基因测序基因测序是分子生物学领域中使用广泛的技术之一，其主要功能是破译DNA的序列。
基因测序技术包括许多不同的步骤，从DNA提取和分离，到测序反应的设计和执行。
其中，DNA测序主要采用Sanger法、454 Pyrosequencing法、Illumina平台等多种技术，它们分别以不同的优势和的限制来优化测序结果和运行成本。
基因测序技术在医学、生物学、遗传学和医药研究等领域中都具有广泛应用。
四、限制性酶切限制性酶切是分子生物学研究中常见的一项实验技术，它是通过专一性的内切酶来切割双链DNA，形成特定的切点和切端。
分子生物学的实验技巧
分子生物学的实验技巧分子生物学作为生物科学的重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其相互作用关系。
合理的实验技巧对于分子生物学的研究至关重要。
下面将介绍几种常用的实验技巧及其操作方法。
一、PCR技术PCR（聚合酶链反应）是分子生物学研究中最常用的技术之一，它能够高效地扩增目标DNA序列。
PCR反应的关键步骤包括：DNA变性（Denaturation）、引物结合（Annealing）和DNA合成（Elongation）。
实验中，我们需要准备好所需的试剂和设备，确保实验台和试管清洁，以避免污染。
同时，掌握好反应温度、时间和引物浓度等重要参数的选择，能够确保PCR反应的成功。
二、凝胶电泳技术凝胶电泳是常用的DNA分子大小分析方法，能够通过电场作用将DNA样品分离出来。
在实验中，我们首先需要准备好凝胶，常用的有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
然后，根据需要选择合适的电泳缓冲液，并将待测样品与DNA标记物一同加入凝胶槽中。
接下来，通过给电极施加电压，使DNA在凝胶中迁移。
最后，通过染色或荧光检测等方法，可可视化目标DNA条带。
当我们操作凝胶电泳时，要注意电流的选择、运行时间和电泳条件的控制，以确保分离结果的准确性。
三、蛋白质SDS-PAGE技术蛋白质的分离与鉴定也是分子生物学研究中的重要内容之一。
其中，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是最常用的方法之一。
在进行SDS-PAGE实验时，首先需要准备好聚丙烯酰胺凝胶，根据需要选择合适的凝胶浓度和电泳缓冲液。
接着，将蛋白样品与还原剂和SDS缓冲液混合，然后进行样品沸腾变性。
之后，将样品加载到凝胶孔中，施加电压进行电泳。
最后，可以通过染色或Western blot等方法对蛋白进行检测与分析。
四、基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术之一，它可用于构建重组DNA分子。
在进行基因克隆实验时，需要首先将目标基因进行PCR扩增，然后进行限制性内切酶切割，得到目标基因的载体和酶切后的DNA片段。
分子生物学实验技术3篇
分子生物学实验技术
第一篇：PCR技术
PCR（聚合酶链反应）是一种基于体外体内 DNA 复制的技术。
PCR 技术广泛应用于分子生物学、生物医学研究、医学诊断、生物技术等领域。
在 PCR 中，核酸模板、引物、聚合酶和反应缓冲液是必不可少的组成部分。
PCR 引物是在特定位置的 DNA 片段，用于诱导聚合酶模板 DNA 的扩增。
聚合酶通过催化模板 DNA 在 DNA 引物的引导下合成相应的 DNA 片段，产生大量的重复 DNA 片段。
PCR 是一种快速、高效、灵敏的 DNA 分析技术，可以对非常小的样本进行扩增。
PCR 的操作流程如下：
1．取得合适的 DNA 样品。
2．准备 PCR 反应体系，包括 PCR 反应缓冲液、聚合酶、DNA 模板和引物。
3．用 PCR 机进行程序设定和反应。
4．检查 PCR 反应产物，包括 PCR 产物的带型和验证PCR 产物的特异性和纯度等。
PCR 的应用
1．DNA 序列鉴定以及 DNA 序列变异检测。
2．基因表达分析、基因定量、等位基因分析等基因功能研究操作。
3．分子诊断，可以根据染色体、基因、蛋白质等材料进行分析。
4．农业和畜牧业生物工程的研究。
优点：
PCR 反应时间逐渐缩短，灵敏度高，重现性好，稳定性强。
PCR 技术可以在非常小范围内进行 DNA 分析，并可以处理复杂的实验体系。
缺点：
PCR 技术还有一些局限性，比如需要合理设计引物，需要准确的温度控制，需要恰当的试剂，且对样品的纯度和净化度有严格的要求。
分子生物学常用实验技术
一CTAB 法微量提取植物总DNA1. CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）的作用：CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB 与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。
因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。
2. β-巯基乙醇的作用：巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚轻易去除基因组DNA。
巯基乙醇有消泡的作用。
3. EDAT（乙二胺四乙酸）的作用：是一种重要的络合剂，抑制某些金属蛋白酶的活性，防止DNA被DNase 酶解。
4. 为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。
因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。
但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。
折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。
也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。
一般在室温下放置15－30分钟即可。
2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc 或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验
1.基因克隆：通过PCR扩增目标基因或外源基因，将其克隆到载体中，如质粒、病毒等，使其能够在宿主细胞中表达。
2. PCR：聚合酶链式反应，是一种可在体外扩增DNA序列的技术，适用于从少量DNA样品中扩增特定区域的DNA片段。
3. 蛋白质表达与纯化：通过基因克隆，将目标蛋白质表达于宿主细胞中，并通过蛋白质纯化技术将其纯化出来。
4. DNA测序：通过测序仪对DNA序列进行测定，可以用于基因组测序、基因突变分析等。
5. RNA干扰：通过RNA干扰技术，将RNA分子导入到细胞中，靶向特定的基因，从而抑制基因表达。
6. 细胞培养：将细胞放入培养皿中，提供合适的营养物，使其在体外生长并繁殖，可用于体外实验研究。
以上是分子生物学实验室常见实验，这些实验技术广泛应用于生命科学领域的基础研究和应用研究，为疾病诊断和治疗等方面提供了重要的科学支持。
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分子生物学常用实验技术及方法
第二章 常用实验技术及方法一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)反应总体积为50 µl ，其中含有：模板DNA 0.5 µlPCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 µl10×MgCl 2 溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl引物1 (50 umol/L) 0.5 µl引物2 (50 umol/L) 0.5 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl无菌去离子水加至 50 µl上层用25 µl 液体石蜡油覆盖。
循环参数为： 94 ℃变性10 min94 ℃变性1 min56 ℃退火1 min72 ℃延伸2 min共30个循取环，PCR 结束后，取2 µl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。
二、基于PCR 技术的定点突变1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA 片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR 扩增DNA 片段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA 片段1和DNA片段2；3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 µl：片段1 1 µl片段2 1 µl10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl10×MgCl2溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 5 µlTaq酶 1 µl加ddH2O至50 µl在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突变的正确性。
常用分子生物学实验技术--整理
常⽤分⼦⽣物学实验技术--整理常⽤的分⼦⽣物学实验技术：离⼼技术： 是分离纯化蛋⽩质、酶、核酸（DNA、RNA）、细胞的最常⽤⽅法之⼀。
电泳（electrophoresis）：带电粒⼦在电场中向着与其所带电荷相反⽅向电极移动的现象。
可⽤于分离不同分⼦量的⽣物⼤分⼦。
1.蛋⽩质的电泳： ⽤途：蛋⽩质的定量。
2.核酸的电泳： ⽤途：⽤于核酸的分离、鉴定、纯化、回收。
⽐如：我只需要长度300bp左右的分⼦。
那么，电泳后，在切胶过程中，只切300bp处的分⼦即可。
蛋⽩质研究相关的技术： 1. 含量测定： 2. 结构的测定： （1）⼀级结构的测定：搞清楚蛋⽩质肽链的氨基酸排列顺序。
⽅法：Edman降解法、质谱法（MS, 将蛋⽩⽔解，多肽链分成⼩段。
检测肽段） （2）空间结构测定：蛋⽩空间结构分析⽐⼀级结构分析复杂得多。
⽅法：X射线衍射晶体分析法、核磁共振法等。
3. 功能的测定： （1）酵母双杂交（YTH）： 假设：欲检测蛋⽩X与蛋⽩Y是否相互作⽤。
检测⽅法： 将蛋⽩X与报告基因转录因⼦的BD融合； 将蛋⽩Y与AD融合； 确认蛋⽩X与蛋⽩Y形成的复合体能否激活报告基因的表达。
如果能激活报告基因的表达，说明：X与Y形成了复合体，则BD和AD靠近，激活了下游报告基因的表达；反之，报告基因不表达。
原理： 真核⽣物的转录因⼦（尤其是酵母转录因⼦GAL4），包括两个彼此分离、但功能必需的结构域：⼀个是与DNA结合的结构域-BD；⼀个是转录激活域-AD。
BD识别转录因⼦效应基因的上游序列并与之结合；AD通过与转录复合体的其他成分作⽤，启动下游的基因转录。
即使BD与AD分开，但如果在空间上较为接近时也能激活转录。
——利⽤转录因⼦的BD、AD这⼀特性，通过检测转录因⼦是否启动了其效应基因的表达，可研究蛋⽩质X与Y是否相互作⽤。
（2）蛋⽩质芯⽚技术：⼀种⾼通量、微型化、⾃动化的蛋⽩质分析技术。
⼀次试验中可同时检测⼏百甚⾄⼏千种⽬标蛋⽩或多肽。
分子生物学常用技术
切除所有结合与不 结合蛋白质的DNA 带，并用六氢吡啶 切割甲基化的G残 基
缺失的DNA带表 结合带 非结合带 明相应G残基的重 要意义，它得到 结合蛋白质的保 护
甲基化干扰实验
4、体内足迹实验
完整的细胞 × G G
DMS
裸露的DNA G G
× G
me
G
分离DNA并用 六氢吡啶切割
Me Me
G
G
PCR扩增 凝胶分析
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）
1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交 技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后 同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。
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目录目录第一章 基因克隆1.操作流程---------------------------------------------------- 12.方法-------------------------------------------------------- 12.1 设计引物 ------------------------------------------- 12.2 PCR------------------------------------------------- 12.3 割胶回收目的片段------------------------------------ 22.4 连接------------------------------------------------ 32.5 感受态细胞制备及转化-------------------------------- 32.6 接菌------------------------------------------------ 42.7 阳性克隆鉴定---------------------------------------- 52.8 质粒抽提-------------------------------------------- 52.9 测序------------------------------------------------ 63.基因克隆的编码---------------------------------------------- 6 第二章 酵母双杂交筛选1.操作流程---------------------------------------------------- 72.方法-------------------------------------------------------- 72.1 诱饵基因转化筛库宿主菌 Y190------------------------- 72.2 含Bait基因质粒的Y190保种 ------------------------- 82.3 Bait 基因的自激活检测 ------------------------------ 92.4 诱饵基因筛库--------------------------------------- 102.5 抽提酵母质粒--------------------------------------- 132.6 酵母质粒的扩增------------------------------------- 142.7 Prey质粒与Bait质粒共转Y190----------------------- 16 第三章 细胞培养和转染1.细胞培养--------------------------------------------------- 172.细胞转染--------------------------------------------------- 172.1 脂质体介导的贴壁细胞转染法------------------------- 172.2 磷酸钙介导的贴壁细胞转染法------------------------- 183.相关试剂--------------------------------------------------- 19 第四章 免疫共沉淀1.操作流程--------------------------------------------------- 202.方法------------------------------------------------------- 202.1 收获细胞------------------------------------------- 202.2 Protein G beads 悬液的制备------------------------- 202.3 Preclear ------------------------------------------ 212.4 免疫共沉淀----------------------------------------- 213.试剂------------------------------------------------------- 22生命经纬网站/——关注生命科学与交叉学科研究1第五章 Western Blot1.操作流程--------------------------------------------------- 232.方法------------------------------------------------------- 232.1 电泳----------------------------------------------- 232.2 转膜----------------------------------------------- 232.3 杂交----------------------------------------------- 242.4 显色----------------------------------------------- 242.5 膜的 strip----------------------------------------- 243.试剂------------------------------------------------------- 25第六章 报告基因检测系统1.NF-kB 报告基因检测系统------------------------------------- 261.1 细胞培养------------------------------------------- 261.2 转染----------------------------------------------- 271.3 细胞收获及处理------------------------------------- 281.4 luciferase 分析------------------------------------ 281.5 Western-blot检测待检基因的表达情况----------------- 282.p53报告基因检测系统---------------------------------------- 292.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 292.2 转染----------------------------------------------- 292.3 细胞收获及处理------------------------------------- 302.4 luciferase 分析------------------------------------ 302.5 Western-blot检测待检基因的表达情况----------------- 313.NFAT报告基因检测系统--------------------------------------- 313.1 细胞培养------------------------------------------- 313.2 电击转化------------------------------------------- 313.3 铺板加药------------------------------------------- 323.4 细胞收获及处理------------------------------------- 333.5 Luciferase 检测------------------------------------ 333.6 Western-blot检测待检基因的表达情况----------------- 334.Western-blot----------------------------------------------- 335.注释------------------------------------------------------- 355.1 几种药物的储存浓度和应用浓度----------------------- 355.2 各系统的control------------------------------------ 365.3 Lumat LB P507仪器操作步骤-------------------------- 36 第七章 流式细胞分析分选术1.96孔板样本处理--------------------------------------------- 411.1 操作流程------------------------------------------- 411.2 方法----------------------------------------------- 411.3 注释----------------------------------------------- 282.Cell Cycle Assay------------------------------------------- 422.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 422.3 细胞分板------------------------------------------- 432.4 加药刺激------------------------------------------- 432.5 细胞收获及处理------------------------------------- 442.6 上机样本制备--------------------------------------- 442.7 上机----------------------------------------------- 442.8 相关试剂的配制------------------------------------- 443.FACS analysis on Apoptosis -------------------------------- 453.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 453.2 转染----------------------------------------------- 463.3 细胞收获------------------------------------------- 473.4 上机样本制备--------------------------------------- 473.5 上机----------------------------------------------- 474.CD69检测-------------------------------------------------- 484.1 细胞培养------------------------------------------- 484.2 电击转化------------------------------------------- 484.3 铺板加药------------------------------------------- 494.4 细胞收获及处理------------------------------------- 494.5 样本制备------------------------------------------- 504.6 上机----------------------------------------------- 514.7 几种药物的储存浓度和应用浓度----------------------- 515.细胞分选--------------------------------------------------- 525.1 分选细胞样本处理----------------------------------- 525.2 分选细胞的上机操作程序----------------------------- 535.3 相关试剂的配制------------------------------------- 53 第八章 siRNA技术1.方法------------------------------------------------------- 542.注释------------------------------------------------------- 542.1 不同培养体积贴壁细胞用 RNAfect 转染时的初始条件---- 552.2 在24孔平板中优化RNAfect转染效果的方法------------ 552.3 在24孔平板中优化 RNAfect转染效果的方法------------ 55第九章 杆状病毒表达系统1.操作流程--------------------------------------------------- 562.方法------------------------------------------------------- 562.1 共转染--------------------------------------------- 562.2 病毒扩增------------------------------------------- 572.3 滴度与plaque纯化---------------------------------- 582.4 小规模表达带有 His标签的目的基因------------------ 593.昆虫细胞Sf9的培养条件------------------------------------- 593.1 培养基--------------------------------------------- 593.2 培养方式------------------------------------------- 602.3 细胞的冻存和解冻----------------------------------- 60第十章 蛋白的表达和纯化1.基因表达载体构建------------------------------------------- 621.1 操作流程------------------------------------------- 621.2 方法----------------------------------------------- 622.蛋白纯化--------------------------------------------------- 642.1 重组蛋白的提取------------------------------------- 642.2 金属鳌合层析(IMAC)--------------------------------- 652.3 谷胱苷肽配体亲合层析(GAF)-------------------------- 662.4 离子交换层析(IEC)---------------------------------- 662.5 凝胶过滤(GF)--------------------------------------- 673.蛋白浓度测定----------------------------------------------- 68 第十一章 RNA技术1.组织Total RNA提取------------------------------------------691.1 组织取材和保存------------------------------------- 691.2 组织的破碎和匀浆----------------------------------- 691.3 总RNA的抽提--------------------------------------- 702.荧光定量PCR (Q-PCR)---------------------------------------- 712.1 Q－PCR反应体系------------------------------------- 712.2 Q－PCR反应程序------------------------------------- 71 第十二章 抗体的制备和纯化1.多克隆抗体的制备------------------------------------------- 722.单克隆抗体的制备------------------------------------------- 722.1 免疫动物------------------------------------------- 722.2 细胞融合------------------------------------------- 732.3 细胞筛选------------------------------------------- 742.4 细胞克隆------------------------------------------- 752.5 细胞扩增------------------------------------------- 752.6 细胞冻存------------------------------------------- 752.7 腹水制备------------------------------------------- 762.8 腹水的纯化----------------------------------------- 762.9 杂交瘤鉴定----------------------------------------- 763.Peptide-KLH的偶联及-SH偶联率测定方法---------------------- 763.1 Peptide-KLH偶联------------------------------------ 763.2 -SH偶联率测定------------------------------------- 773.3 Cys标准曲线制作----------------------------------- 773.4 -SH偶联率换算公式--------------------------------- 783.5 透析及分装保存-------------------------------------- 78 第十三章 病理实验基本技术1.基本技术--------------------------------------------------- 792.常规制片--------------------------------------------------- 792.1 操作流程------------------------------------------- 792.2 方 法---------------------------------------------- 793.免疫组织化学----------------------------------------------- 814.免疫细胞化学----------------------------------------------- 825.组织微阵列------------------------------------------------- 826.常规溶液配制----------------------------------------------- 82第一章 基因克隆1.操作流程收集基因信息——>设计引物——>PCR ——>回收目的片段——>与载体连接，取得连接产物 ——> 用感受态细胞做转化 ——>接菌——>阳性克隆鉴定(酶切法或PCR)——>质粒抽提——>质粒测序——>测序结果分析——>克隆信息输入数据库——>质粒实物保存2.方法2.1设计引物引物设计要求：引物长度为25bp-35bp.forward primer和reverse primer的Tm 为70℃(±4℃)，且两条引物的Tm相差不超过4℃。