水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建

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水稻苗期低温诱导表达新基因OsCOI的克隆、过表达载体的构建与转化

ＳＮＱ，Ｉｉｇｌｇ，ＨＮｉｇ，ＵＢｉｈｎＵｉＬＵＸａ —ｎＺＡＧＮｎ。Ｙａｓｅｇｎｉ —
（．ｏｅｅｏｉｃｎｅｎｅｈｏｇ，ａｓｇｉｌｒｎｖｒｔ，ａｚｏ７０７，ｈａ１ＣｌｇｆｆＳｉｃｓａｄＴｃｎｌｙＧｎｕＡｒｕｔａＵｉｓｙＬｎｈｕ３００Ｃｉ；ｌＬｅｅｏｃｕｌｅｉｎ２ＩｓｔｔｏＧｎｔｓｎｅｅｐｅｔｉｏｙＣｉｓＡａｅｙｏｃｅｃｓＢｉｎ１００，ｈｎ）．ｎｔｕｅｆｅｅｃａｄＤｖｌｍｎａＢｏｇ，ｈｎｅｃｄｍｆｉｅ，ｅｉｉｉｏｌｌｅＳｎｊｇ０１１Ｃｉａ
ＡｂｔａｔＣｉｉｇｉｊｒｎｓｅｌｇｐｒｄｉｏｅｏｊｒｌｔｇｆｃｏｓｆｒｐｏｕｔｉｆｒｅＯｙａｓｔａｓｒｃ：ｈｌｎｎｕｅｉｅｄｉｅｉｓｎｆｍａｏｉｉａｔｒｏｒｄｃｉｔｏｉ（ｒｚａｉｌｎｏｍｉｎｖｙｃｖＬ）Ｔｍｐｏｅｒｅｃｌｌｒｎｅｉｅｄｉｇｐｒｄｉｉｉｏｔｎｏｅｐｏｔｏｅｏｄｒｓｓｎｅｅ，ｎａｅｔｅ．．ｏｉｒｖｉｏｄｔｅａｃｓｅｌｅｉ，ｔｓｍｐｒｔｘｌｉｎｖｌｃｌ—ｅｉａｔｎｓｕｒｖｌｈｃｏｎｎｏａｔｔｇ
定了基础。
关键词：稻；温诱导表达基因；水低载体构建；遗传转化
中图分类号：７５Ｑ８文献标识码：Ａ文章编号：００— ０１２１）１— ０８— ５１０７９（００Ｏ０１０

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

作者简介尉连伶（１９７３－），女，河北香河人，讲师，从事植物生理学的研究与教学工作。
收稿日期２００７! ０９! ２６
剪碎，置于１．５ｍｌ离心管中；缓慢加入液氮进行预冷，再加液氮后用研杵迅速磨碎叶片，并立即加入３００ μｌ６５ ℃预热的提取缓冲液，６５ ℃水浴约１ｈ，温浴时摇动３次；用等体积酚∶氯仿∶异戊醇、氯仿∶异戊醇各抽提１次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移水相到另一离心管中；加入１／１０体积的ＮａＡｃ（３ｍｏｌ／Ｌ）混匀，再加入２倍体积预冷的无水乙醇，混匀后静置２ｍｉｎ，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ沉淀ＤＮＡ；用７０％冰浴乙醇２００ μｌ清洗ＤＮＡ沉淀，小心吸去乙醇，自然风干ＤＮＡ；最后溶于５０ μｌ重蒸水中，－２０ ℃保存备用。１．３水稻ＳＬＲ１基因的克隆在ＮＣＢＩ上搜索到水稻ＳＬＲ１基因ｃＤＮＡ序列，与水稻基因组ＳＬＲ１基因序列相同，设计１对引物（由上海生工公司合成）：ＳＬＲ１!Ｆ，５′!ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＧＡＧＴＡＣＣＡＡ!３′；ＳＬＲ１!Ｒ，５′!ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣ!３′。在引物５′端引入ＫｐｎⅠ酶切位点。ＰＣＲ反应按标准体系进行，反应参数为：９４ ℃预变性５ｍｉｎ；９４ ℃ １ｍｉｎ，５６ ℃ １ｍｉｎ，７２ ℃ １ｍｉｎ３０ｓ，循环３０次；７２ ℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳后用北京天为时代公司的ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收，并连接到ｐＧＥＭＴ载体中，通过蓝白筛选得到ｐＧＥＭＴＳＬＲ，送上海生工公司测序。１．４水稻ＳＬＲ１基因正义和反义表达载体的构建将ｐＧＥＭＴＳＬＲ和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ＵＮＨＰ分别用ＫｐｎⅠ 单酶切；ＳＬＲ１基因片段通过ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收；植物表达载体用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法（同“１．２”）得到。将片段和载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞。经筛选和测序后获得水稻ＳＬＲ１基因的

水稻抗性基因和无毒基因互作的广谱抗病基因工程的研究

水稻抗性基因和无毒基因互作的广谱抗病基因工程的研究分类号编号,十初大学硕士学位论文论文题目学科、专业研究生姓名导师姓名及专业技术职务中南大学二零一一年五月中南大学二零一一年五月一令一一,牛血月原创性声明本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的地方外, 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。

与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说明。

作者签名么.纽蓬关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留学位论文,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文;学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。

日期:型年月明作者签名:么鱼盔导师签名水稻抗性基因和无毒基因互作的广谱抗病基因工程研究摘要水稻的高产稳产直接关系着国家粮食安全和社会稳定。

稻瘟病害造成的粮食减产已成为我国粮食产量增长缓慢的主要原因之一。

喷施农药防治病害给环境造成重大污染,而且效果不佳。

多数抗病品种在生产上推广?年后就因为病原菌变异产生新的生理小种而导致抗性丧失。

培育持久抗病品种防治稻瘟病需要创新抗病育种策略。

水稻与稻瘟病菌之间的特异互作符合“基因对基因”.假说。

根据这一假说,提出植物双因子广谱抗性策略:即将基因和相应的基因置于病原菌侵入诱导表达的启动子下导入寄主植物,当寄主受到病菌侵染时,基因便被诱导表达蛋白,激发其特异基因表达产生对应的受体蛋白,它们之间相互识别,导致寄主的反应,阻止入侵病原菌的定殖和.扩展,同时还会进一步诱导系统获得性抗性,使植物获得对多种病原菌的广谱抗性。

而其关键就是互作的/基因对以及只能由病原菌侵染所触发的适当的启动子。

本研究基于这一广谱抗病基因工程育种策略,筛选受稻瘟菌侵入诱导特异表达的启动子, 将互作的水稻抗稻瘟病基因胁和稻瘟病菌无毒基因置于这一启动子下,构建双元表达载体。

水稻OsAPX基因的克隆及过表达载体的构建

（１．福建农林大学生命科学学院，福建
福州３５０００２；２．农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种
重点实验室／福州（国家）水稻改良分中心／福建省作物分子育种工程实验室／福建省水稻分子育种重点实验室／福建省农业科学院水稻研究所，福建福州３５０００３；３．福建省作物种质创新与分子
福建农业学报２８（２）：１０１～１０６，２０１３
ＦｕｊｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００８ —０３８４（２０１３）０２ —１０１ —０６
关键词：克隆；ＡＰＸ；过表达载体；遗传转化中图分类号：Ｓ５ｌ１文献标ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＯｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｏｆＯｓＡＰｘＧｅｎｅ
育种省部共建国家重点实验室培育基地，福建福州３５０００３；４．杂交水稻国家重点实验室华南基地，福建福州３５０００３；５．水稻国家工程实验室，福建福州３５０００３）
ＷＡＮＧＺｏｎｇ — Ｈｕａ．ＺＨＡＮＧＪｉａｎ — ｆｕ。 ’ 。 ’ ’

水稻OsXCP2基因表达载体及RNAi载体构建

江西农业大学学报2018,40(1):10-14 Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensishttp://xuel)a().j DOI：10.1383d/j.jjau.2018002张磊，孙晓棠，唐子清，等.水稻0^匚?2基因表达载体及謂“载体构建口].江西农业大学学报，2018,40(1):10-14.水稻0sXCP2基因表达载体及RNAi载体构建张磊，孙晓棠，唐子清，叶梦斐，崔汝强4(江西农业大学农学院，江西南昌330045)摘要:木质部半胱氨酸蛋白酶XCP2(xyZem c y s t e i n e p r o t e a s e s2)是植物管状细胞凋亡过程中的自溶酶，参与植物与多种病原物互作，但目前未见对水稻XCP2蛋白酶的报道。

此研究克隆获得水稻XCP2编码基因〇rf序列，经取Z II和V I酶切纯化后，克隆到植物表达载体pCAMBIA1302(含GFP、h i s tags)。

将该基因。

rf序列信息提交至NCBI比对，查找到其特异序列，利用Gateway技术将该特异序列重组到植物RNAi载体pB7G W I W G2(I I)，并冻融法将重组质粒转化进人土壤农杆菌GV3101。

为进一步探究水稻0sZCP2基因在水稻木质部细胞凋亡及水稻与病原物互作中的作用提供条件。

关键词:水稻;0sZCP2;过表达;RNAi;G a t e^w a y r中图分类号:S432.1 文献标志码:A文章编号：1000-2286(2018)0卜0010-05 Construction of Rice OsXCP2 Overexpression and RNAi VectorsZHANG Lei，SUN Xiao-tang，TANG Zi-qing，YE Meng-fei，CUI Ru-qiang"(College o f Agriculture，Jiangxi Agricultural University，Nanchang330045，China) Abstract ：Xylem cysteine proteases 2(X C P2) i s the autolytic enzyme in the process o f withering and death o f plant tracheary cells，which joins in the interactions between plants and many pathogens.However there have not been any reports about rice X C P2 protein.The cds and conserved fragments o f rice0sXCP2were cloned.After digested by restriction endonuclease Bgl I I and Spe I，i t s cds sequence was cloned into plant overexpression vector p C A M B I A1302( contain G F P，his tags).Via Gateway clone technology the conserved fragment was reconstituted into plant RNAi vector pB7G W I W G2(II).And for further study o f the functions o f Rice 0sXCP2gene in the withering and death o f the xylem cells o f rice and the interaction between rice and patho-gens，the recombinant plasmids were transformed into Agrobacterium G V3101.Keywords ：rice;0sXCP2；overexpression；RNAi；Gateway水稻作为世界范围内种植的主要粮食作物之一，其产量受多种病原物影响。

水稻PR10a基因启动子的克隆及其活性检测

物表达载体ｐ３３００一ＰＲ１０ａＰ — ＧＦＰ，并用农杆菌介导法将其导入烟草，检测转基因植株经水杨酸（ＳＡ）诱导前后ＧＦＰ的表达水平。序列分析表明ＰＲ１０ａＰ长度为１１８２ｂｐ，与已经报道的序列存在４个碱基的差别，含已报道序列的顺式作用元件，如水杨酸相关的Ｗ— ｂｏｘ、ＡＣＧＴ序列等，也有增强子ａｓ－ａ－ｌｉｋｅ元件及ＣＡＡＴ、ＴＡＴＡ等常见应答元件。ＰＣＲ检测结果显示，成功地获得了转基因烟草，荧光检测表明启动子ＰＲ１０ａＰ在正常条件下不表现活性，而在水杨酸诱导下ＧＦＰ表达，证明新获得的水稻病程相关蛋白１ｏａ的
件下表达。
从北京赛百盛生物工程公司购买了连接酶、限制性内切酶，ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙｆＨｉＦｉ）Ｔａｑ酶，从成都福际生物技术有限公司购买
了胶回收试剂盒。从加拿大ＭＢＩ公司购买了分子量标准２００ｂｐ
动子，组织特异性启动子是控制功能基因在植株特定部位表达，从北京全式金生物工程公司购买了ＴｒａｎｓＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ
在转基因植物的研究中，提高植物抗逆性是一个重要的研
ｌａｄｄｅｒ。
水稻ＰＲ１Ｏａ基因启动子的克隆及其活性检测刘红双马建王云鹏
水稻ＰＲ１Ｏａ基因启动子的克隆及其活性检测

载体构建

水稻中cdc2超表达载体的构建生物技术专业吴娇娇指导教师：傅体华教授寿惠霞教授摘要：每个细胞都是一个细胞周期的产物。

细胞增殖是由一系列细胞分裂调控机制精确控制的，在此过程中细胞周期蛋白依赖性激酶起着关键作用。

由p34cdc2和细胞周期蛋白组成的复合物在真核生物中被称为有丝分裂启动子（MPF），控制从G1到S期的转变，而目前通过转基因的材料来研究水稻中cdc2的报道比较少。

为了了解细胞分裂调控基因cdc2在水稻中的作用，通过基因芯片我们得到了一个水稻的cdc2同源基因，期望通过对其超表达得到一些水稻中细胞周期调控的信息。

在此我们选择了包含玉米泛素ubi启动子的双元载体pCAMBIA1390-ubiquitin作为超表达载体，该载体可以在大肠杆菌和农杆菌中稳定表达。

之后我们将最终载体通过电击转化进入强毒力农杆菌强毒力菌株EHA105，保菌。

经典的构建载体的构成就是一系列是酶切和连接反应，因此如何能够高效的进行酶切和连接反应就成为提高构建效率的关键。

在实验中我们也积累了一些经验，同时也改进了一些方法以提高效率。

关键词：细胞分裂调控基因2；细胞周期蛋白；超表达；双元载体Construction of overexpressing vector for rice cdc2 geneBiotechnology Wu JiaojiaoAcademic advisor Shou HuixiaAbstract：Every cell in life is the production of cell division which is controlled by a serial precise reaction. Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) play an important role in regulating the eukaryotic cell cycle. A key element of cell cycle control in eukaryotes is the M-phase kinase, composed of p34cdc2 and cyclin A. To dissect the plant cell cycle, we have previously got a cdc2 (cell division control) gene which is homologous to Arabidopsis thaliana from Oryza sativa through DNA chips, We have cloned it into a overexpressing vector termed pCAMBIA1390-ubiqiutin using ubi as promoter which can express efficiently in E.coli and Agrobacterium, then it could be transformed into rice callus. So the target gene is tightly linked to a strong constitutive promoter from Maize, which can over express cdc2. In this study, it is found that digestion and ligation are the key steps in the construction of vector. Some questions in experiment were found and discussed in this paper.Key words:cdc2；cyclin；overexpression；binary Ti vector细胞周期的进程是通过细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）的活性变化来控制的。

两个水稻胚乳启动子的克隆及表达分析

中图分类号Ｑ９４３．２植物种子中贮存的大量蛋白质不仅是人类和动物食用植物蛋白的主要来源，而且在植物基因工程中，植物种子还可用作生物反应器，用来生产在医疗和工业领域中具有重要价值的蛋白质
［１］
因连接后导入水稻，经检测ＧＵＳ基因仅在种子胚乳中
１０］表达；Ｍｉｎｉｃ等［研究发现拟南芥 α Ｌ阿拉伯糖苷酶基
因启动子为胚乳特异性启动子。为了寻找在基因工程中具有重要意义的种子特异性启动子，我们对网上ＥＳＴ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｓｔａｒｒａｙ．ｏｒｇ）进行分析，发现水稻醇溶谷蛋白基因Ｏｓ１２ｇ１６８９０和过敏蛋白ＲＡ５基因Ｏｓ０７ｇ１１５１０在水稻胚乳中具有较高的表达丰度。我们从水稻中克隆了这两个基因的启动子，分别与ＧＵＳ报告基因融合，构建重组表达载体转化水稻，通过对转基因水稻的ＧＵＳ检测发现这两个启动子启动该基因在胚乳特异性表达，可用于水稻基因工程研究。
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（８）：５７～６１
两个水稻胚乳启动子的克隆及表达分析
崔永兰钟晓丽张永明杨仲南（上海师范大学生命与环境科学学院上海２００２３４）
摘要启动子的克隆对基因表达及基因工程研究有重要意义。根据数据库中ＥＳＴ丰度，从水稻中克隆了两个预测在水稻胚乳中高效表达的启动子Ｏｓ７７２和Ｏｓ３５９，并将启动子片段与ＧＵＳ报告基因融合，构建了重组表达载体。通过农杆菌介导方法将其导入水稻愈伤组织细胞。转基因水稻经ＧＵＳ组织化学分析显示，Ｏｓ７７２和Ｏｓ３５９能启动ＧＵＳ基因在水稻胚乳中表达但不能在根、茎、叶和花中表达。该结果表明Ｏｓ７７２和Ｏｓ３５９为两个水稻胚乳特异性启动子。关键词水稻胚乳启动子ＧＵＳ报告基因

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合适的启动子及依此建立良好的可诱导调控系统是目前植物基因工程研究的重要课题之一．
水稻幼苗在２０ｏ・～１ｍｏ・的硝酸盐溶液中培养时，５ｍｌＬＯｍｌＬ即可诱导体内生成硝酸还原酶［．３进一步研究表明，］硝酸盐不仅诱导硝酸还原酶的生成还诱导大量与硝酸盐代谢过程相关的其他蛋白质的生成［］由于硝酸盐是植物体的一种营养源，４．本身对植物体没有伤害，并且其诱导作用在硝酸盐
导表达的启动子；探讨基于硝酸盐诱导建立“ 因开关 ” 基的可行性．为建立依赖植物体自身调节的内源可诱导调控系统奠定基础．
１材料与方法
１１材料．供试水稻（ｒｚａｉａ）ＯｙａＳｔｖ品种是籼稻 “ 优２７，两８ ” 为我院周勇老师培育．ＲＮＡ提取试剂（ｒｏ）自Ｉｖｔｇｎ公司；ＮＡ分离试剂盒与反转录试剂盒购自ＰｏｇＴｉ１购ｚｎｉｏｅｒｍＲｒｍｅａ公司；ａＴｑ酶、制性限
胁迫解除后也随之停止，以这样不仅不会对植物体内的资源造成浪费，所而且还可以对外源基因进行精
确调控．因此与硝酸盐诱导相关的启动子具备有建立良好可诱导调控系统的条件．本研究旨在分离出水稻幼苗中受硝酸盐诱导的特异基因的启动子，并进行启动子的活性分析，选择出具有低背景表达和高诱
关键词：水稻；硝酸盐；电子克隆；启动子；双元表达载体
中图分类号：９ —３Ｑ４３文献标志码：Ａ
目，前国内外在植物基因工程中最常用的启动子有组成型启动子、不同细胞或器官的特异性启动子以及诱导型启动子［．１组成型启动子会使目的基因恒定而持续表达，］过度消耗细胞内的物质和能量，造成植物体内资源的浪费，影响正常代谢［；２不同细胞或器官的特异性启动子难以对特定的代谢进行精确调控，也难以控制植物在缺失或获得某些致死效应或其他不利效应基因时的基因表达．因此，寻找一种
基金项目：湖北省教育厅自然科学项目（０４０３；２０１１）湖北省自３然科学基金（０４Ｂ１３资助项目２０ＡＡ２）作者简介：吴文华（９７）男，１６一，副教授，－ｉ：ｗｈｈｂ．ｄ．ｎＥｍａｌｗ＠ｕｕｅｕｃ
内切酶以及ｐ１一ＭＤ８Ｔ载体购自大连ＴＫＲ公司；ａａａ凝胶回收试剂盒购自Ａｘｇｎ公司；ｙｅ引物合成与ＤＡ测序均由上海Ｉｖｒｇｎ公司完成；ＣＮｎｉｏｅｔＰＲ仪（Ｃ５２为Ｔｃｎ公司产品；杆菌Ｅ１５Ｔ＿１）ｅｈｅ农ＨＡ０、ｐＡＭＢＡ１９Ｚ由本实验室保存；ＣＩ３１其他生化试剂均为国产分析纯．
１２水稻幼苗的培养．
将水稻于３℃温水中浸泡１，７催芽．７２３￣ｈＣ待芽长至１ｍ左右时，ｍ将水层纱布以固定幼苗．将培养皿移至２５℃培养箱培养，光周期为１光４ｈ
收稿日期：２０ —１ —１０６１５
异ｃＮＡ片段，Ｄ结合已发表的硝酸盐诱导的相关基因，经过序列比对确定特异片段所在的基因．电子克隆出对应基因的５侧翼约１５０ｂ０ｐ的序列．以总ＤＮＡ为模板利用ＰＲ技术克隆出了对应的５侧翼序列．Ｃ经过测序分析，序列具有许多启动子特征的顺式作用元件，ＴＡｂｘＣＧ岛等．这些启动子序列连接到该加＿ｏ，ｐ将ｐＡＭＢＡ１９Ｚ双元载体中，ＣＩ３１构建植物双元表达载体以进行启动子活性检测．
文章编号：１０ —２７（０７０ —０９ —０００３５２０）３２４４
水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植物双元表达载体的构建
吴文华，李新舟
（湖北大学生命科学学院，湖北武汉４０６）３０２
摘
要：为克隆水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子，Ｇｅｅａｋ中找到了６从ｎＢｎ组水稻中受硝酸盐诱导的特
组；另一部分用５ｏ・的硝酸钾溶液培养，０ｍｍｌＬ称为诱导组．培养约２，４ｈ后分别收集对照组和诱导组的幼苗叶片，用液氮速冻后贮藏于一７ ℃ 保存备用．ｏ１３水稻叶中总ＤＡ的提取参照陶刚等＿的方法进行．．Ｎ６Ｊ１４水稻叶中ｅＮ．ＤＡ的合成分别称取冻存的适量的相同质量的对照组和诱导组的水稻幼苗．参照
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第３期
吴文华等：水稻中受硝酸盐诱导的基因启动子的克隆与植
夔签蕉
照／０ｈ黑暗培养，１定期换水．稻幼苗长至三叶期时，幼苗分成两部分：部分继续水培，为对照水将一称
维普资讯
第２卷第３９期
２００７年９月
湖北大学学报（自然科学版）
ＪｕｎｌｆＨｕｅｉｅｓｔ（ｔｒｌＳｉｎｅｏｒａｂｉｏＵｎｖｒｉＮａｕａｃｅｃ）ｙ
Ｖｏ．９Ｎｏ３１２．Ｓｐ，２０ｅ．０７