酶底物法测定水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌综合试卷解析及答案
酶底物法与多管发酵法测定水中粪大肠菌群的对比分析
地震等自然灾害过后水体会被大量微生物所污染,特别是被粪便污染。
如水体中含有肠道病原菌株,人饮用后会暴发严重疾病。
粪大肠菌群是一类能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,是水体受人畜粪便污染的最直接指标。
对于粪大肠菌群检测的方法主要为滤膜法和多管发酵法,但试验过程较为繁琐,因此亟需一种快速简便的检测方法。
酶底物法也可用来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希氏菌,操作方便,检测时间短,无需确认试验。
但该方法尚未正式列入国家标准,因此,该文通过与多管发酵法相比较,对酶底物法进行验证分析。
1材料与方法1.1试验材料仪器及试剂:乳糖蛋白胨;EC 肉汤;灭菌锅;科立得TM (Colilert R )试剂(美国爱德士生物科技股份有限公司);酒精灯;100mL 无菌取样瓶(里面装有1.5%硫代硫酸钠去除水样中的余氯);3mm 接种环;无菌培养定量盘(97孔);封口机(带97孔定量盘橡胶托垫);97孔阳性标准比色盘;培养箱。
1.2试验方法1.2.1多管发酵法。
参考《生活饮用水标准检验方法(GB/T5750.12-2006)》和《水和废水监测分析方法(第四版)》,将水样分别接种到发酵管中,发酵管中盛有乳糖蛋白胨,在(37±0.5)℃条件下培养(24±2)h ,如果试管产酸或产气,说明试验呈阳性(初发酵试验),将呈阳性结果的发酵管轻微振荡,用灭菌棒或3mm 接种环将培养物转接至EC 培养液中,在(44.5±0.5)℃水浴下培养(24±2)h ,如果发酵管产气即可确认呈阳性(复发酵试验)。
1.2.2酶底物法。
将科立得TM (Colilert R )试剂加入100mL 装有水样的取样瓶中,待试剂完全溶解后,倒入无菌培养定量盘(97孔)中,对其进行封装,然后置于(44.5±1)℃恒温培养箱中培养24h 。
取出后与97孔阳性标准比色盘进行比较,如果为阳性反应,则黄色孔颜色较标准比色盘深,如果有疑虑,可将可疑阳性的试管继续培养4h ,然后观察,之后出现的颜色反应无效。
酶底物法检测水中总大肠菌群的方法确认
摘 要 ：目的 通过 比较酶底物法与多管发酵法测定水 中总大肠菌群 的一致性 ，判定在某 实验 室条件下 能否用酶底 物法 替代 多管发酵法测定水 中总大肠菌群 。方 法 利用加 标实 验检测 方法 ，比较 酶底物 法和多 管发 酵法检测 结果 的一致 性 。结果 酶底 物法 与多 管发 酵法 用 于水 中大 肠 菌 群检 测 结果 具 有 一致 性 ，差 异无 统计 学 意义 （ｔ：０．８９，Ｐ＞ ０．０５）。结论 酶底物法具有快速简便 的特 点 ，可以作 为评价水质微生物污染的标准方法 。 关键 词 ：酶底 物法 ；总大肠 菌群 ；方 法确认 中图分类号 ：Ｒ１２３．１ 文献标识码 ：Ｂ 文章编 号 ：１００３—６２４５ （２０１５）０５—０５０９—０２
ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｈａｓ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆ ｉｃａｎｔ（ｔ＝０．８９，Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｅｃｈ—
ｎｉｑｕｅ ｉｓ ａ ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄ ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｗａｔｅｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；Ｔ ｏ ｔａｌ ｃｏｌｉ ｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｎｆｉｒ ｍ ａｔｉｏｎ
酶底 物 法 （ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ） 的 原 理 是 ：利 用 大 肠 菌 群 细 菌 能 产 生 ｐ２ 半 乳 糖 苷 酶 （ Ｂ２Ｄ２ｇａ１ａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ） 分 解 ＯＮＰＧ （ Ｏｒｔｈｏ２ ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ１２￣２Ｄ２ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ），使 培 养 液 呈 黄 色 ，检测水样 中是否含有大肠菌群。利用大肠埃希氏 菌 产 生 Ｂ２葡 萄 糖 醛 酸 酶 （１３２ｇｌｕｅｕｒｏｎｉｄａｓｅ） 分 解 ＭＵＧ （４２ ｍ￣ｔｈｒ＇１２ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙ１２￣２Ｄ２ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ），使
检测总大肠菌群和大肠埃希氏菌成本分析比较——多管发酵法和DST-酶底物法比较
个样品
使用的 ５ 管法）
器 皿 单价 缚个 样 品 的价 格 备 注
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ｓｏ ｓ ｏｉｖ， － ｏｉ ｓ ｂ ｓ ｄｆｒ ｅ．ｎｔｉ ａｔ ｌ ｕｅＤ ｆ ｅ ｕ ｓ ａｅ ｅ ｈ ｏｏｙ （ Ｓ、 ｎｙ ｅｓｂｔ ｔ ｈｗ ｓ ｅ Ｅ Ｃ ｌｍｕｔ ｅｔ ｔ ｔ ｒＩ ｓ ｒ ｃ ｓ ｅ ｎ ｄＳ ｂｔ ｔ Ｔ ｃ ｎ ｌ ｐ ｔ ｉ ｅｅ ａｈ ｈ ｉｅ ｉ ｒ ｇ Ｄ Ｉ ｅ ｚｍ ｕ ｓ ａｅ ｒ ｔ ｈｉｕ ～科立 得 ａｄｍｕ ｉｌ－ｕｅｆ ｍ ｎａｉ ｃｎｑ ｅｏｔｓＴ ｔ ｏｉｒ ｎ —ｏｉｎＷ ｔ ． ｎ ｏ ａｅ ｅ ｎｑ ｅ ｃ ｎ ｈｐｅｔｂ ｒ ｅｔ ｏ ｔ ｈｉｕ ｔ ｏａ Ｃｌｏ ａｄＥ ｃｌｉ ａｅ Ａ ｄｃｍｐｌ ｅ ｔｎ ｅ ｔ ｅ ｌ ｆｍ ｒ
１引言 ． 供水企业 为保证供水 水质必 须对原水 、 出厂 水 、 管 网水进 行大量的水 质检测 工作 ，其 中大 肠菌群 的含量 是水质的重要指标 。国家标准 Ｇ ５４ － ０６中规定 Ｂ ７９ ２ ０ 大肠 菌群及大肠埃 希 氏菌的方法 ，有传统 的经典 的 多 管 发酵 法和 最新 的 固定 底物 （Ｓ ） 底物 ５ 孔 定量 Ｄ Ｔ酶 １ 盘法 。 本文依照两个标准检查 了成 本分析和经 济比价 。 ２多 管发 酵法 ． ２ １培养基 与价 格分 析 ．
酶底物法检测水中粪大肠菌群方法验证
酶底物法检测水中粪大肠菌群方法验证摘要：本文对《水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法》HJ1001 -2018、《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750-2006进行了方法验证，以评价该两种检测方法是否适用于水中粪大肠菌群的检测工作，以确保该方法能够满足水中粪大肠菌群的测定。
关键词：粪大肠菌群；质控样品。
引言：试样与固定底物酶底物法（DST）采用大肠菌群能产生β—半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色的原理，来判断水样中是否含耐热大肠菌群，大肠菌群的培养温度是44.5℃。
1.测定方法与参数（注：方法为酶底物法法，参数为质控样品）2.仪器与设备2.1恒温培养箱2.2冰箱2.3高压蒸汽灭菌锅2.4烘箱2.5量筒2.6吸管2.7程控定量封口机2.8 51孔或97孔定量盘2.9无菌水样瓶（100mL）2.10阳性比色盘2.11干热灭菌器3培养基和试剂3.1无菌水3.2科立德（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基。
4.样品的采集和保存4.1采样前准备：4.1.1采样瓶：高压灭菌瓶。
4.2样品采样及注意事项4.2.1将已灭菌和封包好的采样瓶，无论在什么条件下采样时，均要小心开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶子颈部受杂菌污染。
4.2.2在采集江，河湖，库，地表水时，可握住瓶子底部直接将采样瓶插入水中，约距水面10-15厘米时，瓶口朝来水方向，使水样灌入瓶内。
如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直至充满水样为止。
采样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。
采样后，采样瓶内上不应留有一些空隙，一边检验前充分混匀水样。
4.2.3从自来水龙头采集样品时，不要选用漏水的水龙头，采水前可先将水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌或用75﹪酒精溶液消毒水龙头，然后将水龙头打开，放水数分钟后除去水管中的滞流杂质。
采水时控制水流速度小心接入瓶内。
4.2.4在同一采样点进行分层采样时，应自上向下进行，以免不同层次的干扰；同一采样点与理化检测项目同时采样时，应先采集细菌等检验样品，否则样品可能被污染，采样前，不得用水样刷洗采样瓶。
两种方法对水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌检测的对比论述
两种方法对水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌检测的对比论述发布时间：2021-03-23T04:11:47.963Z 来源：《学习与科普》2020年19期作者：邱磊[导读] 文章首先分析了实验时所使用的材料和试验方法，其次阐述了试验结果，最后对试验结果进行了总结。
谱尼测试集团江苏有限公司摘要：文章首先分析了实验时所使用的材料和试验方法，其次阐述了试验结果，最后对试验结果进行了总结。
通过结果，得出结论，在水中，对总大肠菌、大肠埃希氏菌进行实际试验检测的过程中，通过两种方法来对其检测，这两种方法是酶底物法和多管发酵法。
通过试验检验结果来看，酶底物法检测的时间比较短，操作简单，方便进行观察，是值的普及和推广的一种检测方法。
关键词：大肠埃希氏菌；总大肠菌；酶底物法；多管发酵法1.材料和方法1.1使用材料、仪器试验检测的过程中，使用材料及仪器有MMO-MUG培养基，EC-MUG、乳糖蛋白胨培养基。
还有培养箱36℃±1、44.5℃±0.5℃；紫外灯，其波长是366m.1.2方法（1）试验前准备在试压之前，要先做好相应的准备工作，试验正式开始前，准备好实用性菌株和加标水样等，同时还要准备培养基粉末（2.7±0.4）g；然后在结合配置有关要求，将EC-MUG、乳糖白胨培养液制作好。
（2）方法原理在检测总大肠菌的时候，应用MMO-MUG来检测，能够产生胨半乳糖苷酶，其能够分解ONPG，分解完成后，这个时候，会出现颜色上的变化，在检测大肠埃希氏菌的时候，应用MMO-MUG及EC-MUG培养基来检测，这个时候会产生β-葡萄糖醛酸酶，然后在进行分解，分解后挥释放荧光，而且通过紫外线照射，特征性荧光也十分的明显[1]。
（3）试验方法在进行适用性实验的时候，要先把分装好的MMO-MUG以及EC-MUG等培养液取出来，取出来后，将混悬液分别加入到各个管中，其结果要在二十四小时后来进行观察。
①灵敏度试验在试验之前，将培养后的侵袭性培养物取出来，这种培养物培养了二十四个小时，取出来之后，在将制成0.5适度菌液，然后在进行稀释，稀释的时候要对其菌液进行十倍稀释，一直稀释到1500MPN/100mL～1MPN/100mL，在开始灵敏度试验。
水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌(酶底物法)分析原始记录
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
查表结果 （MPN/100mL）
检测结果 （MPN/L)
备注 XXXX-04-J071
分析人：
校核人：
审核人：
分析日期及时间：
XXXXXX 有限公司
2021 年 09 月 09 日颁布
水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌（酶底物法）分
析原始记录（续表）
培养温度℃培养时间 h 大肠埃希氏菌 黄色 无色
金黄色葡萄球菌 无色
培养温度℃培养时间 h 大肠埃希氏菌 黄色 无色
金黄色葡萄球菌 无色
培养温度℃培养时间 h 大肠埃希氏菌（耐热型） 黄色有荧光 无荧光
产气肠杆菌 无色
样品空白对照
样品编号
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
查表结果
（MPN/100mL）
检测结果
（MPN/L)
样品编号
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
查表结果
（MPN/100mL）
检测结果
（MPN/L)
样品编号
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
接种量 （mL）
检出限
10MPN/L
采样日期
样品描述
液态色澄清浑浊
样品种类 分析步骤
地表水地下水工业废水 生活污水 其他
环境条件
温度℃；湿度 RH%
1. 样品稀释：根据样品污染程度确定接种量，接种量为 10mL 时，取 10mL 样品加入到盛有
酶底物法和多管发酵法检测水中大肠菌群的比饺研究
ｉ ａ ｅ （ｎ ｙ ｅ ｓｂ ｔａ ｅｍ ｔｏ ）Ａ ｗ ｔ ｒ ｅ ｚｍ ｕ ｓｒ ｔ ｅ ｈ ． ｎ ｏｐ ｒ ｎｙ ｅ ｓｂ ｔａ ｅｍ ｔ ｏ ｗ ｔ ｄ ｄ
ｕ ｔ ｐ ｅ ｔ ｂ ｅ ｍ ｎｔｍ ｈ ｔ ｅ ｅ ｔ ｔ ｅ ｔ ｔ ｌｃ ｉ ｏ ｍ ｍ ｌ ｉ ｌ － ｕ ｅ ｆ ｒ ｅ ｔ ｏ ｏ ｄ ｔ ｃ ｈ ｏ ａ ｏｌ ｆ ｒ ｓ、 ｅ ｃ ｒｉ ｈｉ ｃ ｉ ａ ｄ ｅ ｄ ｓ ｈｅ ｃ ａ ｏｌ ｎ
Ｚ ａ ｇａ Ｓ ｎ ｏｇ ｅ Ｃ ｅｘ ｐ ｎ ｈ ｙｊ ｅ ｕ ｚｎ ｋ ｈ ｎ ｉｉ ｇ ｎ ｉ Ａ ｓｒ ｃ ：Ｏ ｊ ｃ ｉｅ Ｍ ｔｏ ｓ ｂ ｔａ ｔ ｂ ｅｔ ｖ ｅｈ ｄ Ｒｓｌｓ ｅｕ ｔ Ｃ ｎ ｌｓ ｏ ｏ ｃｕ ｉｎ
Ａ ｓ ｒｃ Ｔ ｉ ｒ ｉ ｌ ａ ｎ ｙ ｉ ｔ ｏ ｕ ｅ ｔ ｏ ｈ ｃ ａ ａ ｔ ｄ ｔ ｃ ｏ ｉ ｏ ｂ ｔ ａ ｔ： ｈ ｓ ａ ｔ ｃ ｅ ｍ ｉ ｌ ｎ ｒ ｃ ｓ ａ ｍ ｈ ｗ ｉ ｈ ｃ ｆ ｓ ｅ ｅ ｔ ｃ ｌ ｆ ｒ ｄ ｅ ｄ ｎ ｍ
酵法对地表水中总大肠菌群的俭测结果无显著性差异目 呈中度正相关 （ ｔ 配对 检验 ｔ２５，．２＜＜．５ ＝．７ｏ０５Ｐ００； 直线相关分析 ５７ ．２＜＜．５ ；（）酶底物法对大肠埃希氏菌的检测结果与多管发酵法对粪大肠 ９ ，ｏ０５Ｐ００ ） ２
Ｉ佥 测
菌群的Ｉ测结果呈高良丑相关 （ 佥 直线 关 纷析 ｒＯ８３ ．２＜＜．５ 。结论：酶底物法可 －．６ ，ｏ０５Ｐ００ ） －
目 前，我国生物防护材料及 功能ｌ防护装备品种数量饺少， 生 特别是高效、便携、成本
低 、无污染、使用简单的生物防护器材，远不能满足平时、战时及突发公共卫生事故时生 物防护 的需要。与传统病毒分离方法相比，荷 电体 电吸附作用吸附分离病毒 ，不造
检测大肠菌群和大肠埃希氏菌的新方法——固定底物技术酶底物法
卫生学评价 ， 检测的指标为大肠 菌群和大肠埃希 氏菌 或粪大肠菌群 （ 耐热大肠菌群） 以这些指标作为粪便 ， 污染的指示 菌。 采用的标准检测方法为膜过滤法和多 管发酵法。但这两种方法检测时间相对较长 ， ４— 需 ８ ７ ２小时 ， 需验 证 试 验 ， 验 步骤 较 为 繁 琐 ， 以 不 能 试 所
ｔｏ ｈｎ ｌ ｒｐ ｅｙ－ｐ－ －ｇｌｃｏ ｙ ａ ｏｉｅ 使培 养液 呈 黄 Ｄ ａａｔｐ ｒｎ ｓ ） ｄ
３２ 耗材 ： ． 取样 瓶或 使 用 灭 菌的 玻 璃瓶 ；ｌ 定 ５孔
量盘 或 ９ ７孔定 量盘 。
注 ： 孔定 量盘 可在 无需 稀释 的情 况 下 检测 ｌ ５ ｌ ～
２ 放在 ３ ±１ ） ６ ℃培养箱 ， 培养 ２ 小时 ； ４ 注： 如检测耐热大肠菌群 （ 粪大肠菌群） 则需放在
４ ．℃ ， ４５ 培养 ２ ４小时 ； 果 培养 时 间超过 ２ 时 ， 如 ８小 呈 阴性 结果 则结果 有效 ，如果 呈 阳性 结果 则结 果 无效 ， 需 重做 此水样 。
可在 ２ ４小时内同时定量检测出大肠茵群和 大肠埃希 氏菌。 此方法大大的减少 了 工作量 ， 免 了 避 使用 多管法的逐 级稀释带来的操作误差 ； 也避免 了使用滤膜 法时肉眼读数的人 为误差， 所以其假 阳性率和假 阴性率都比传统方
法低 。 由于 ２ ４小时 内就得 到 结果 ， 以很 好 的用 于 突发事件应 急 。 可
关键词 ： 大肠菌群 大肠埃希氏菌 固定底物酶底物 法 Ｃ ｌｅｔ可立得 试剂 ｏｌ （ ｉｒ
１背 景
出水 样 中大肠 菌群和 大肠埃 希 氏菌 的 ＭＰ 值 。 Ｎ
目前 我 国对 生 活饮 用 水 、 源 水 、 水 地表 水 等 进 行
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一、填空题
1．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌(粪大肠菌群)时，需要取 ml水样，在±℃培养 h。
①②
答案：100 36 1 24
2．采用固定底物技术酶底物法定性测定总大肠菌群，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，呈现色为阳性。
①
答案：黄
3．采用固定底物技术酶底物法定性测定大肠埃希氏菌，水样加入培养基后经过适当温度及时间培养后，将呈现——色的水样在暗处用波长为__ ___nm的紫外灯光照射，如果有产生则表示有大肠埃希氏菌存在。
②
答案：黄 366 蓝色荧光
4．采用固定底物技术酶底物法定量测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌时，水样加入培养基摇匀后，需倒入51孔或97孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以，然后用封口。
①②
答案:赶除孔穴内气泡程控定量封口机
二、判断题
1．总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生乒半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。
( )①
答案：正确
2．采用固定底物技术酶底物法测定总大肠菌群和大肠埃希氏菌可以定性测量，也可以定量测量。
( )①②
答案：正确
3．采用固定底物技术酶底物法可在48h判断水样中是否含有总大肠菌群和大肠埃希氏菌及含有的总大肠菌群和大肠埃希氏菌的最可能数值。
( )①②
答案：错误
正确答案为：应该是24h。
三、问答题
采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌时，采用正确步骤培养后的样品，怎样判断大肠埃希氏菌的数值?②
答案：采用固定底物技术酶底物法定量测定大肠埃希氏菌，采用正确步骤培养后的样品，观察51孔或97孔无菌定量盘，将变成黄色的水样的定量盘在暗处用波长为366nm的紫外灯光照射，如果有蓝色荧光产生则表示该定量盘孔穴中有大肠埃希氏菌存在，计算有荧光反映的孔穴数，对照MPN表即可查出大肠埃希氏菌最大可能数(MPN)，结果以MPN／100m1表示；如所有孔未产生荧光，则可报告为大肠埃希氏菌未检出。