克隆性基因重重排在淋巴瘤诊断中的应用
t细胞淋巴瘤tcrγ基因重排特征的分析及检测方法优化
Ｔ细胞淋巴瘤ＴＣＲＴ基Ｎ重排特征分析及检测方法的优化摘要研究背景与目的淋巴瘤在组织和细胞形态学方面与高度反应增生性淋巴组织的鉴别诊断十分困难，容易造成误诊。
淋巴瘤病理诊断是临床病理工作的难题之一。
目前国内主要依靠以形态学为主、免疫组化为辅的诊断手段。
随着分子生物学的发展，从基因水平研究和分析诊断疾病的技术不断出现并且日趋成熟，为淋巴瘤诊断提供了有效工具。
淋巴瘤是由单克隆淋巴细胞增生所致，而反应增生性淋巴组织则来自于多克隆淋巴细胞，这是二者的重要区别。
编码免疫球蛋白（Ｉｇ）或Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）的基因经过重排以后，不同克隆之间的重排基因互不相同，因此，基因重排对淋巴瘤的诊断具有特异性价值。
以ＰＣＲ技术为基础的方法以其简便、高效、廉价及适用面广而在淋巴瘤基因重排研究方面越来越受重视。
但不同研究文献中所采用的引物、ＰＣＲ条件、ＰＣＲ产物检测方法等都不尽相同，结果也有差异。
因此，难以找到适于常规临床病理诊断之用的标准程序。
Ｊｕｒｋａｔ细胞是Ｔ细胞淋巴瘤基因重排研究中常用的阳性对照细胞，但有关Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排的详细情况也未见报道。
假基因是Ｉｇ和ＴＣＲ胚系ＤＮＡ中常见的基因，有关假基因参与重排的情况以及在设计引物方面是否应将假基因包括在内也未见有关研究报道。
本实验以ＴＣＲ基因重排为研究对象，通过优化引物选择、ＰＣＲ条件及ＰＣＲ产物的检测方法等，分析Ｔ细胞淋巴瘤基因重排检测的最佳方法。
同时，分析ＴＣＲ基因重排的特点，为进一步研究ＴＣＲ基因重排提供理论和技术支持。
方法１以ＴＣＲｙ基因重排为研究对象，选用通用引物ＴＶＧ、ＶｖＩ及ＴＣＲ７家族特异性引物为工具。
用正交设计实验优化ⅥＩ引物的ＰＣＲ条件。
另选一对ＴＣＲ［ｊ通用引物作为ＴＣＲｙ引物的补充和比较。
２利用ＰＣＲ和测序研究Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排情况，分析ＴＣＲ基因重排的基本特点。
３ＰＣＲ产物检测方法①利用ＴＣＲ通用引物检测淋巴瘤克隆性基因重排阳性率，分别用琼脂糖电泳和ＳＳＣＰ分析ＰＣＲ产物；②将ＰＣＲ产物分别进行直接测序和克隆后测序，分析ＴＣＲ基因重排的特点及探索测序方法在基因重排检测中的应用；⑧分析ＰＣＲ产物中ＤＮＡ的克隆数与ＳＳＣＰ中条带数目的关系。
抗原受体基因重排克隆性分析淋巴瘤辅助诊断技术的发展和应用现状
Ａ Ｇ的种 系（ｅｍｉｅ 或称胚 胎 的（ｍｂ ｏｉ） 型均 由不连 续 的 Ｄ Ａ 片段 组成 ， 括 可变 区（ａｉ ｌ Ｒ ｇｒｌ ） ｎ ｅ ｒ ｎｃ 构 ｙ Ｎ 包 ｖｒ ｂ ａｅ
ｒｇ ｎ ， 、 ｅｉ ｓＶ） 变异 区（ ｉ ｒ ｔ， ） 连 接 区（ｏｎ ｇ Ｊ 和恒定 区（ ｏ ｓ ｎ， ， Ｊ Ｃ 区存在 于 各种 类 型 Ａ Ｇ ｏ ｄｖ ｓｙ Ｄ 、 ｅｉ ｊｉｉ ， ） ｎ ｃｎｔ ｔＣ） Ｖ、、 ａ Ｒ 中， Ｄ 区仅存在 于 ＩＨ 和 Ｔ Ｒ 及 ＾链基 因中。Ａ Ｇ基 因重排是 淋 巴细胞 完成发育分 化成 熟 的正常 生理 而 ｇ Ｃ１ ｙ ３ Ｒ
过 程， 早在 骨髓 淋 巴细胞 分化 阶段 ，Ｒ Ａ Ｇ基 因即发生重 排 ， 形成 Ｖ（ ） 连 续 Ｄ Ａ 片段 （ １ ， 而产生相 应 ＤＪ Ｎ 图 ）从
的抗 原 受体合 成。
基 因 Ｖ、 、 Ｄ Ｊ片段 的数 量愈 多， 产生 的组 合数也愈 多。该 步骤 可 产生许 多不 同的 Ｄ Ａ序 列， Ｎ 从而编 码 出 不 同的蛋 白质 ， 虽然 它们 的差别及 其微 小 ， 却具 有独立特 异性 。基 因重排 过程使种 系 中承载 的相对有 限的 但
李 挺 ， 幼立 祖
（ ． 京 大学 第 一 医 院 病理 科 ， 京 １北 北
Ｃ ｒｅ ｎｖ ｒ ｔ ， Ｓ ｏｎ ｌ Ｕ ｉ ｓ ｙ Ｕ Ａ） ｌ ｅｉ
１０ ３ ；． ｅａｔ ｅｔ ｆ ｅ ａ ｐｔ ｌｇ， ｅＭｅ ｏｉ ｏｐ ａ， ｉ ｄ ａ Ｃ ｌ ｇ ００ ４２ Ｄ ｐｒ ｎ ｍ ｔ ａ ｏｏｙ ｔ ｔ ｄｓ Ｈ ｓｉ ｌＷｅ ｌ ｉ ｌ ｏｌ ｅ ｍ ｏＨ ｏ ｈ ｈ ｈ ｔ ｔ ｌＭｅ ｃ ｅ
遗传 学信息 转变为大量 的基 因片段 ， 而再编码 为 Ｉ和 Ｔ Ｒ分子 的抗原结 合部位 。这 些不连接 片段 的重新 从 ｇ Ｃ 洗牌和连接从 统计学水 平上 阐释 了人体 免疫 系统 发 生的抗 原 受体 的多变性 。据估 计 ， 因重排机 制 可产 生 基
PCR技术在淋巴系统恶性肿瘤患者MRD检测中的应用
国外医学临床生物化学与检验学分册2004年1月第25卷第1期Foreign Medical Sciences.Section of Clin Biochem &Lab Med ,January 2004 ,Vol 25 ,No.1·综述·PCR 技术在淋巴系统恶性肿瘤患者MRD检测中的应用公衍文综述府伟灵审校【摘要】基于PCR 技术检测MRD 的方法多种多样,如共同引物和特异引物PCR , RT2PCR ,ASO2PCR ,SSCP2PCR ,荧光PCR 结合毛细管电泳技术以及定量的竞争PCR 和实时定量PCR(RQ2PCR) 、LightCycle RQ2PCR 等。
各种方法均有其优缺点及适用情况,合理选择才能获得所需的灵敏度和特异性。
【关键词】白血病; 微小残留病; 聚合酶链反应临床治疗达到完全缓解(CR) 后,用传统形态学方法不能检测出的体内残留的微量恶性肿瘤细胞,即微小残留病变(minimal residual disease ,MRD) ,是淋巴系统恶性肿瘤复发和移植治疗失败的根本原因。
MRD 的动态监测为临床建立个体化治疗方案、预后判断、移植疗效观察等所必需。
目前检测MRD 最常用的方法是基于(多参数) 流式细胞技术和PCR 技术的各种方法。
由于PCR 具有灵敏度高、特异性好等优点而应用更为广泛, 各种各样的基于PCR 检测MRD 的技术层出不穷。
本文着重探讨这些方法的特点及应用情况,而方法本身的原理不在本文讨论之列。
抗原受体基因重排的检测正常淋巴细胞抗原受体( IgH、Igκ、TCRγ、TCRδ等) 基因重排是多克隆的,经PCR 扩增后电泳多成片状;淋巴系统恶性肿瘤细胞则为单克隆或寡克隆,电泳呈现单一条带或紧邻的数个条带,因此可将之作为MRD 检测的标志。
1．共同引物和特异引物PCR :目前临床常用来自V 区和J 区的共同保守序列作为扩增重排基因的引物,但存在的一些因素可导致假阴性结果而影响其敏感性。
淋巴瘤的遗传学和基因突变
论文题目：淋巴瘤的遗传学和基因突变淋巴瘤是一类源于淋巴系统的恶性肿瘤，涵盖多种亚型，包括霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。
在淋巴瘤的发生和发展过程中，遗传学和基因突变起着关键作用。
本文将全面探讨淋巴瘤的遗传学特征，重点分析主要的染色体易位、基因突变及其在淋巴瘤发生发展中的影响和意义。
1. 染色体易位和重排染色体易位和重排是淋巴瘤遗传学研究的重要内容之一。
淋巴瘤中常见的染色体易位和重排事件导致了关键基因的表达异常，从而促进肿瘤的发生和发展。
●t(14;18)(q32;q21)易位: 这是最常见的染色体易位，在滤泡性淋巴瘤（FL）中广泛存在。
该易位将BCL2基因（位于18号染色体）与免疫球蛋白重链基因（IgH，位于14号染色体）连接，导致BCL2基因的过度表达，抑制细胞凋亡，从而促进FL的发生和维持。
●t(8;14)(q24;q32)易位: 这是布基特淋巴瘤（BL）的特征性染色体易位。
该易位将MYC基因（位于8号染色体）与免疫球蛋白重链基因（IgH，位于14号染色体）连接，导致MYC基因的异常激活，促进细胞的异常增殖和快速生长。
●其他常见易位: 例如，t(11;14)(q13;q32)易位在成熟B细胞型非霍奇金淋巴瘤（MCL）中常见，将CCND1基因（位于11号染色体）与IgH基因连接，导致CCND1基因的异常表达，促进细胞周期的进展和肿瘤细胞的增殖。
2. 基因突变除了染色体易位，淋巴瘤中的基因突变也是重要的遗传学特征。
这些突变影响了多种关键信号通路和调控网络，推动了淋巴瘤细胞的增殖和生存能力。
●BCL2家族基因: BCL2是一个抗凋亡基因，其过度表达通过抑制细胞凋亡促进淋巴瘤的发展。
在FL和DLBCL等亚型中，BCL2基因的转录调控异常或基因突变常导致其过度表达。
●TP53基因: TP53是一个重要的抑癌基因，参与调控细胞周期和DNA损伤修复。
TP53的突变或丢失在多种淋巴瘤中观察到，特别是在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中，与治疗抵抗性和预后不良相关。
免疫细胞克隆扩增技术及其在肿瘤治疗中的应用
免疫细胞克隆扩增技术及其在肿瘤治疗中的应用随着医学技术的不断进步，免疫治疗被越来越多的科学家和医生看做是未来治疗癌症的有效手段。
而免疫细胞克隆扩增技术（Immune Cell Clonal Expansion）则是实现免疫治疗的一项核心技术。
本文将会介绍该技术的原理和在肿瘤治疗中的应用。
免疫细胞克隆扩增技术原理作为人体对细胞异常增殖的反应，免疫系统会产生针对癌细胞的攻击。
研究发现，其中的效应T淋巴细胞是实现人类自然免疫的关键。
然而情况并不总是如此理想，因为T细胞可能无法识别肿瘤细胞。
而肿瘤细胞能够通过多种机制逃避T细胞免疫的攻击，从而避免被清除。
为了解决这个问题，科学家们想到使用免疫细胞克隆扩增技术。
这项技术可以从患者体内采集到一群T细胞，然后在实验室进行分离纯化、鉴定、扩增和增殖，得到充足的T细胞，再通过一定的方法引导这些T细胞去攻击癌细胞。
这样就可以进行个体化肿瘤免疫治疗，而不需要使用传统的放射治疗、化学治疗等疗法。
具体地，免疫细胞克隆扩增技术包括以下几个步骤：1.采集样品：从患者体内采集外周血、腫瘤、脂肪等组织样品。
2.纯化、鉴定：使用流式细胞术（FACS）或磁珠分选等方法来纯化出患者体内的T细胞，并对这些T细胞进行鉴定。
3.合成：将患者体内T细胞的表面上的抗原（Peptide）与一种分子（MHC分子）结合，从而制成一种复合物。
接着，将复合物放入细胞培养基中培养。
4.扩增和增殖：通过将上述合成的Peptide-MHC复合物与刺激T细胞的物质一同作用，促使T细胞内的免疫元件活跃起来，不断增殖。
经过若干次的增殖和筛选之后，得到大批能够针对某抗原发生反应的T细胞。
5.治疗：将扩增和增殖出的T细胞注入患者体内进行治疗。
免疫细胞克隆扩增技术在肿瘤治疗中的应用肿瘤是一类常见的疾病，目前治愈率较低，因此免疫细胞克隆扩增技术被广泛应用于肿瘤的治疗。
目前，免疫细胞克隆扩增技术在肿瘤治疗方面被广泛应用，特别是对于晚期肿瘤、难治性肿瘤和复发转移性肿瘤都有较好的效果。
ctDNA在淋巴瘤诊疗中的全程应用
Distinct biological subtypes and patterns of genome evolution in lymphoma revealed by circulating tumor DNASci. Transl. Med . Nov 2016IF: 16.3背景1.弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma, DLBCL) 是非霍奇金淋巴瘤(NHL) 中最为常见的类型。
治愈率高，但是30-40%的患者仍会复发；2.目前缺乏有效方法对患者进行风险分级评估并指导治疗。
COO分类法的临床应用潜力巨大，但是基于组织的分子表达水平检测具有局限性；3.对于由滤泡淋巴瘤(Follicular Lymphoma, FL)转化而来的DLBCL，缺乏准确的转化预测指标。
ctDNA：无创连续方法1. Panel 设计:recurrent SNV, Indel;breakpoints (BCL2, BCL6, MYC IGH);重链可变区IgVH & 重链连接簇IgJH2. 样本信息患者92例: 76 DLBCL (初诊/复发) + 12 FL + 4 其它组织活检76份: 76 DLBCL血浆144份: 45 治疗前+ 99 治疗后结果——技术表现●100%的肿瘤组织中检测到体细胞变异，中位突变个数为134；●与Fish相比，translocation的检出灵敏度为89%。
●血浆中能检出组织中91%的driver突变；●52%的组织Non-driver突变能在血浆中检测到；●检出率与分期和ctDNA浓度(黑色三角)有关：当ctDNA浓度大于5hGE/mL时，血浆中能检出至少一个SNV；基于CAPP-seq的ctDNA检测能够反应肿瘤组织的分子特征结果——监测对三例服用依鲁替尼的患者进行疗效监测，其中2例患者的ctDNA检测到BTK的耐药突变，相邻的BTK突变显示趋同的进化方式基于CAPP-seq的ctDNA检测能够实时监测肿瘤的克隆进化和分子耐药结果——预后ctDNA可以作为一个独立的预后指标结果——复发对来自11名患者的30个CR期血浆和8个复发血浆进行CAPP-seq检测●73%（8/11）的患者复发前能检测到ctDNA；●首次检测到MRD距离临床复发平均时长188天；●CAPP-seq的MRD检出率高于IgHTS两倍；●疗后ctDNA阳性患者的PFS显著短于ctDNA阴性患者基于CAPP-seq的ctDNA能够改善MRD检测和提前预测复发结果——分型从以往研究中筛选出23个基因以及该基因在不同类别中的突变频率根据样品的突变频谱，通过Bayesian方法分别计算归属ABC和GCB类别的可能性并完成分类。
PCR和FISH技术在子宫颈淋巴瘤与淋巴瘤样病变诊断和鉴别诊断中的作用
PCR和FISH技术在子宫颈淋巴瘤与淋巴瘤样病变诊断和鉴别诊断中的作用摘要】目的分析子宫颈淋巴瘤样病变与淋巴瘤临床分别采用PCR、FISH技术诊断、鉴别的效果。
方法对我院2015.1-2017.9期间收治的5例子宫颈淋巴瘤样病变、8例原发性子宫颈弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者回顾性分析，观察患者临床分别以FISH检查、PCR-IgH重排检测诊断情况。
结果 DLBCL者均发生IgH基因重排，同时间期FISH检测IgH 、bcl-6基因断裂，bcl-2 、myc基因未断裂；子宫颈淋巴瘤样病变PCR—IgH检测， 2例出现单克隆重排；间期 FISH检测无IgH、bcl-2、myc、bcl-6基因断裂，1例myc 基因多拷贝现象。
结论 FISH 检测能帮助临床鉴别、诊断子宫颈淋巴瘤样病变、淋巴瘤疾病，可临床推广应用。
【关键词】FISH；淋巴瘤；PCR；淋巴瘤样病变淋巴瘤是临床较见为常见的疾病类型，但原发性子宫颈淋巴瘤发病率较低，相关数据统计显示其发病率仅为非霍奇金淋巴瘤的0.5%，目前原发性瘤体免疫表型以B细胞多见，其中DLBCL为发病率最高原发性淋巴瘤疾病[1]。
子宫颈淋巴瘤样病变是病理特征表现受良性炎症刺激淋巴组织增生主线增生的一种疾病，由于疾病临床在活检中有B细胞浸润情况，导致临床时容易出现误诊，将淋巴瘤样病变与淋巴瘤混淆[2]。
本文观察子宫颈淋巴瘤样病变与淋巴瘤者临床分别以PCR、FISH技术诊断、鉴别的情况，旨在为后期临床疾病诊断提供依据。
1资料与方法1.1一般资料对2015.1-2017.9期间收治的5例子宫颈淋巴瘤样病变、8例原发性子宫颈弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者回顾性分析，患者入院后取活检标本、附件切除标本行PCR、FISH检测，患者年龄区间37～70岁，平均（52.9±4.3）岁。
1.2方法PCR—IgH检测选择半巢式 PCR 方法，将两组引物分别扩增到IgH基因的CDR III 和 CDR II 区，第一轮引物为FR2A 或 FR3A和LJH ，第二轮引物为FR3A 和V LJH或FR2A.其中FR3A 片段大小为 80～120 bp，FR2A为240～280bp，阳性对照为淋巴瘤组织标本DNA（有单克隆性重排），阴性对照组为无模板DNA的PCR扩增产物、增生淋巴结组织DNA。
T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用
T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用潘鑫艳;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;王丽【摘要】目的：探讨T细胞受体( T cell receptors, TCR)基因重排检测对T细胞性淋巴瘤诊断的价值。
方法收集T细胞性淋巴瘤30例和淋巴反应性增生组织30例,提取DNA,应用BIOMED-2引物系统中的56条引物进行PCR扩增,核酸分子异源双链凝胶电泳分析结果。
结果30例T细胞性淋巴瘤标本中TCRβ、TCRγ、TCRδ的检出率分别为83．3%(25/30)、93．3%(28/30)、13．3%(4/30),三者联合检测的检出率为96．7%(29/30),30例淋巴反应性增生组织中均未检测出TCR 基因重排。
结论利用BIOMED-2引物系统检测TCR 基因重排可作为T细胞性淋巴瘤的辅助诊断工具。
%Purpose To discuss the TCR gene rearrangements in the diagnosis of T-cell lymphomas. Methods Formalin-fixed and paraffin-embedded samples including 30 cases of T-cell lymphomas and 30 cases of reactive lymphoid hyperplasia were chosen for ex-tracting genomic DNA and PCR amplification using 56 BIOMED-2 primers. PCR products were analyzed by heteroduplex and polyacryl-amide gel electrophoresis. Results In all 30 cases of T-cell lymphomas, 25 cases (83. 3%) showed TCRβ gene monoclonal rear-ran gements, 28 cases (93. 3%) of TCRγ gene monoclonal rearrangements, 4 cases (13. 3%) of TCRδ gene monoclonal rearrange-ments. 29 cases (96. 7%) with TCRβ+TCRγ+TCRδ gene monoclonal rearrangements were detected. but no clonal TCR gene rear-rangements were found in 30 cases of reactive lymphoid hyperplasia. Conclusions The detection of TCR gene rearrangements using BIOMED-2 primers is a useful assistant method for the diagnosis of T-cell lymphomas.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】4页(P400-403)【关键词】T细胞性淋巴瘤;基因重排;BIOMED-2;TCR基因【作者】潘鑫艳;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;王丽【作者单位】成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032【正文语种】中文【中图分类】R733.4非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)包括B细胞性淋巴瘤(B-cell lymphoma)和T细胞性淋巴瘤(T-cell lymphoma)，因T细胞性淋巴瘤种类繁多，分类复杂，病理诊断较难。
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30例LyP病例TCR基因重排总体阳性率80% 20例CALCL病例TCR基因重排总体阳性率100%， 两组病例TCR基因重排阳性率无统计学差别（P>0.05) 表明TCR基因重排在LyP和CALCL的鉴别中无应用价值。
必须结合临床病史
基因重排不一定是谱系的标志： ２．Ig和TCR基因重排不一定是谱系的标志： 和 基因重排不一定是谱系的标志 某些T、 淋巴瘤有基因重排的交叉 某些 、B淋巴瘤有基因重排的交叉
新鲜、冻存、石蜡、显微切割或细胞学标本， 不受DNA片段的影响，仅需要少量的DNA， 时间短，敏感性高，
是目前最常用的克隆性重排的检测方法。
引物的选择原则
引物位置：PCR产物长度<300bp (最好在100－300bp） 离连接区的距离>10-15bp 引物本身的长度<25bp 精确地将所有VDJ基因片段捡出 家族性引物或通用引物 不同的组合具有互补性，提高阳性率 引物数目和同源性之间平衡
所有引物采用相同的扩增条件和检测方法，并具有 很高的敏感性和特异性， 已被推荐为可疑淋巴组织增生性疾病克隆性分析的 标准方法，试剂已商品化
/
PCR产物分析方法 产物分析方法
1. 聚丙稀酰胺凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶电泳(PAGE)-异源双链分析 异源双链分析
TCRγδ+ Proliferations or immature T-cell
IGH (VH-JH) Preferably with IGK No clonality but still suspected IGH (DH-JH) Preferably with IGL
Clonal (generally multiiple Clonal results)
( 6） 外周血和骨髓累及情况
胃DLBCL
胃DLBCL，要求观 察外周血累及情况
外周血
MRD理想的检测方法： 理想的检测方法： 理想的检测方法 活检组织的PCR产物克隆， 对连接区进行测序， 再设计病人特异的引物做real-PCR进行MRD的评价
应用策略
• 采用所有引物组，工作量大，不实用，没 有必要， 有交叉和重叠
Biopsy Morphology with IHC If necessary, Molecular Dx Cytogenetics/ FISH （5-10%） ）
Carcinoma CLL
Suspect Lymphoma, Negative or Non-diagnostic
Workup for Primary
FISH
Diagnosis
Treatment
Staging and Treatment
分子和细胞遗传学异常
• 抗原受体基因的克隆性重排 • 与类型相关的染色体异常
简要原理 检测方法 应用和策略 注意事项
淋巴细胞表面受体
IG： IGH （14q32) ： IGL κ (2q12) λ (22q11) TCR: TCRα TCRβ TCRγ TCRδ
17F, 右颈淋巴结肿大
CD20 -+-+-+-+
内 FR1 FR2 FR3
Bcl-2
3. 组织小或无法取得组织病变的诊断
• 深部肿块的穿刺或活检标本如胃镜标本 • 无明显肿块，仅表现为胸腹水 但要特别注意细胞的量 52M ， 左眼内吸取物 细胞涂片检查：见恶性肿瘤细胞，小圆细 胞肿瘤，倾向淋巴瘤 基因重排：FR1(+), FR2(+), FR3(-)
克隆性基因重排在淋巴瘤诊断中的应用
NCCN NHL Lymphoma Guidelines
Evaluation of the Suspicious Lymph Node
Clinically Suspicious LN Carcinoma v. Lymphoma Suspect Lymphoma
ห้องสมุดไป่ตู้
FNA With Flow Cytometry
14q11 7q32 7p15 14q11.2
IG和TCR基因结构及重排过程 和 基因结构及重排过程
胚 胚系 系
D-J重排 V-D-J重排 转录与拼接
可变区
恒定区
各区片段数多 重排的多样性 抗体多样性
IGH V D J 66 27 6
IGK 43 76 5
IGL 38 56 5
TCRA TCRB TCRG TCRD 46 54 61 47 67 13 6 9 5 8 8 4
淋巴细胞发育过程中基因重排顺序
• IG: H重排→κ: IgH/κ κ缺失 →λ： IgH/λ TCR: δ→γ：TCRδγ β→α：TCR α β
淋巴瘤中基因重排形式 ——克隆性重排 克隆性重排
不同的淋巴细胞 相同的重排形式 淋巴细胞单克隆性增生 淋巴瘤诊断和鉴别诊断的分子指标
克隆性重排的检测方法
If not clonal
No evidence 0f presence of clonal B/T population in the samele
结果的解释和注意事项
克隆性不等于恶性： 1. 克隆性不等于恶性： 有些良性病变有时也有克隆性重排
• • • • • • •
•
CD8+（有时CD4+) T 细胞增生症 良性单克隆性r球蛋白病 r EBV阳性的淋巴细胞增生 （AILT) 自身免疫性疾病(Sjogren 综合症,风湿性关节炎) 免疫缺陷状态(先天性,移植后,HIV感染) 免疫调节异常疾病（Castleman 病） 皮肤异常病变（淋巴瘤样丘疹病，急性苔藓样糠疹）
克隆性重排判断基本原则：
1. 条带在期望的碱基大小范围内；一条或两条 条带在期望的碱基大小范围内； 2. 带宽不超过 带宽不超过1mm, 3. 边缘整齐； 边缘整齐；
+
多克隆性： 无特异性条带， 多克隆性： 无特异性条带，弥散带或梯状带
2. 毛细管电泳基因扫描（genescan） 毛细管电泳基因扫描（ ）
- + - + -+ - + - +- +
• 阳性对照 • 阴性对照
•内对照: 3个病例的内对照b-actin均为阳性
对照的设立
－＋－＋－＋－＋－＋－＋
2007-01-04 control and 1
克隆性基因重排的应用
诊断与鉴别诊断 谱系确定 分期 克隆相关性判断
（1）形态和IHC不能得出肯定结论的淋巴组织增生性病变
(4) 淋巴瘤谱系的判断
T or (富于 B? T or NK/T? , T or γδ-T ? 富于T) 富于
34M, 右面部肿胀5月，CD56-, TIA+, PE+, EBER+, TCRr (-), TCRb (-)
CD56
内γ 1
γ2 β1β2
TCRγ(-) TCRβ(-)
EBER
(5） 比较两个淋巴瘤克隆性的相关性， 或区别复发和第二原发肿瘤。 组织细胞/树突细胞肉瘤- ALL, T淋母
BMH4－CT983936的欧洲 － 的欧洲BIOMED－2 协作研究 的欧洲 －
该协作研究由47个研究所组成7个网络和一个病理panel。它由 分子生物学、免疫学、血液学、病理学等领域的专家。
1998.6-2002.7， 12次国际性会议。
主要目的： （1）开发和标准化PCR实验操作和PCR引物 （2） 评价和应用该标准化方法
IGHB+IGKA+B
TCRGA+B
TCRαβ TCRγδ
If not clonal
IGHA+C+D IGHB+IGKA+B
Lineage unknown
TCRBA+B
TCRBA+B+C
TCRBc +TCRD
If not clonal
IGL+IGHE
TCRBC+TCRD B
Preferably with
TCRB Preferably with TCRG
Clonal No evidence of clonality
TCRG and TCRD
Results should be considered in the context of all available clinical, histological and immunophenotypic data
• Southern 杂交 • PCR法
Southern 杂交
特异性探针： 胚系的特征性片段外 另一不同大小的片段 • 优点： 敏感性较高 可靠性高 • 缺点： DNA量多（10ug) 新鲜组织 操作复杂 时间长、成本高 放射性同位素 逐渐被PCR方法替代．
PCR法
原理: 原理 VDJ重排 后相互靠拢，用适当的引物可扩增 出重排片段
• 合理的应用策略——以最少的引物组最大 可能地检测克隆性
Van Krieken, et al. Leukemia 2007;21:201-206
Suspected B-cell Proliferations Suspected Lymphoid Proliferations of unknown origin (B or T) Suspected T-cell Proliferations
T,B之间：不成熟的T或B相对频繁 TCRab, TCRrd之间
细胞性白血病/细胞淋巴瘤 前T细胞性白血病 细胞淋巴瘤 细胞性白血病 前B细胞性白血病/淋巴瘤，非特殊类型
几乎所有都存在TCR克隆性重排，但大 克隆性重排， 几乎所有都存在 克隆性重排 同时伴有IGH基因重排 约20%同时伴有 同时伴有 基因重排 均有IGH DJ 区克隆性重排 ＞70% 存在TCR， 重排对谱系鉴定无帮 助 共同表达多克隆性IG亚型，认为存在多 点亚型转换阻滞 TCRγ，TCRβ克隆性重排，存在TCRγδ， TCRαβ交叉 没有IG和TCR克隆性重排 没有IG和TCR克隆性重排 大多IG及TCR无重排，少数因存在反应 性细胞毒性T细胞导致TCR克隆性重排 TCRγ克隆性重排 Γδ来源的存在等位的TCRγ克隆性重排 αβ来源的一部分存在TCRβ克隆性重排， 一部分未产生TCRβ克隆性重排