第六章 重组克隆载体引入受体细胞-新
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
06.第六章-遗传重组的分子机理
• Mu的DNA是线型的，两端没有粘性末端，而是类 似于IS的序列，并有与转座有关的基因A和基因B ， 其整合方式与λ噬菌体不同，不是位点专一性的整 合和切除，而是类似于转座因子，其末端常常带 有一小段宿主DNA，因而可以引起转导。
model): DNA双链的断裂与重接
3)Holliday模型：异源双链
(heteroduplex)的断裂与重接
4)Meselon-Radding 模型：
1.Holliday 模型
a) 同源染色体联会
b) 内切酶切割非姊妹染 色单体DNA
c) 交换重接形成交联桥 结构(cross-bridge
structure)
A: phe- try- tyr- × B: met- his-
苯丙AA 色AA 酪AA
甲硫AA 组AA
↓
原养型菌落
phe+ try+ tyr+ met+ his+
问题：是接合引起的？是转化引起的？
U型管实验
• 但在这里，结果却获 得了原养型菌株，说 明有一种可通过滤膜 的过滤性因子(FA)， 细菌不必直接接触即 可进行基因转移
遗传学讲义 第六章 遗传重组的分子基础
中国海洋大学 生命学院 汪小龙 xiaolong@
1、遗传重组的类型
(1) 同源重组(homologous recombination)
又叫普遍性重组(generalized recombination) ，大范围同源序 列对等交换。真核生物减数分裂中同源染色体联会，非姊妹 染色单体之间的交换就是同源重组。需要重组蛋白因子参与， 如E.coli. 的RecA.参与重组，又叫依赖于RecA的重组（RecAdependent recombination)；
第六章 重组DNA导入受体细胞
根据基因转移方法的特性，重组DNA导入受体细胞的 方法有以下几种： •转化：将重组质粒导入受体细菌细胞，使受体细菌遗传 性状发生改变的方法； •转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（磷 酸钙沉淀法与体外包装法）； •微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； •电转化法 •基因枪技术：又称微弹技术或高速离子轰击法； •脂质体介导法 •其他方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法。
CaCl2使细菌发生休克后，立即进行转化（E.coli X1776
可长期冷藏，并保持其摄取DNA的能力）。 也可以采用Rb+、Mn2+、K+、二甲基亚砜、二流苏糖
醇（DTT）等制备感受态细胞。
CaCl2制备感受态细胞的一般过程：
•E.coli 接种于LB agar培养基，37℃培养一晚；
•挑选3-5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37 ℃振摇培 养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为对 数生长期）；
以病毒（噬菌体）为载体，转染宿主细胞的方法主 要有磷酸钙沉淀法和体外包装转染法。 一、磷酸钙沉淀法
磷酸钙沉淀法（磷酸钙-DNA共沉淀法），它能把外 源基因与λ噬菌体DNA的重组子导入大肠杆菌和哺乳动物 细胞，但转染效率仍不如体外包装法。
细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA（吞噬DNA-磷酸 钙复合颗粒）的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这 种方法导入细胞。
第六章重组dna导入受体细胞????????????外源基因与载体在体外连接成重组体dna分子后需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选得到大量单一的重组体分子这就是外源基因的无性繁殖即
第六章 重组DNA导入受体细胞
内容提要
•克隆与导入方法 •转化 •转染 •共转化 •电转化 •基因枪法 •微注射技术 •脂质体导入法 •转化酵母菌 •植物细胞的基因转移方法 •哺乳动物细胞基因导入法 •反转录病毒载体的转染
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
重组DNA导入受体细胞
2、原核生物细胞表达真核生物基因存在的缺点：
原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性 系统，即使许多真核生物基因得以表达，得到的也 多是无特异性空间结构的多肽链。 原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统， 而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧 链的糖基化或磷酸化等修饰作用。 原核生物细胞内源性蛋白酶易降解空间构象不正 确的异源蛋白，造成表达产物不稳定等。
转化因子的吸收。双链 DNA 分子与结合蛋白 作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被降解，而 另一条链则被吸收到受体菌中。 整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复 合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各 种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色 体DNA处。 转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通 过同源重组，置换受体染色体DNA的同源区域， 形成异源杂合双链 DNA结构。
从遗传性考虑： 重组缺陷型recA－，用于基因扩增或高效表达的
受体细胞（recA-）
限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免 对外源DNA的除解。外切酶和内切酶活性缺陷
（recB-，recC-，hsdR-）
与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与 载体选择标记互补的表型）
具有较高的转化效率
二、受体细胞
受体细胞(receptor cell)：又称为宿主细胞 (host cell)，是指能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞 感受态(competence)：是指细菌吸收外源DNA的 生理状态。 感受态细胞(competence cell)：是指具有接受外 源DNA能力的细胞。
受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋 白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细 胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
2013-2014分子生物学章节练习题第5-6章练习题
第五、六章分子生物学研究方法练习题1一、【单项选择题】1.一般的限制性核酸内切酶II作用的特点不包括A.在对称序列处切开DNAB.DNA两链的切点常不在同一位点C.酶切后产生的DNA片段多半具有粘性末端D. DNA两链的切点常在同一位点，E.酶辨认的碱基一般为4-6个4.下列关于建立cDNA文库的叙述哪项是错误的A.从特定组织或细胞中提取mRNAB.将特定细胞的DNA用限制性核酸内切酶切割后，克隆到噬菌体或质粒中,C.用逆转录酶合成mRNA的对应单股DNAD.用DNA聚合酶，以单股DNA为模板合成双链DNA5.限制性核酸内切酶的通常识别序列是A.粘性末端B.RNA聚合酶附着点C.回文对称序列,D.多聚腺苷酸E.甲基化的“帽”结构9.基因工程的操作程序可简单地概括为A.载体和目的基因的分离、提纯与鉴定B.分、切、连、转、筛，C.将重组体导入宿主细胞，筛选出含目的基因的菌株D.将载体和目的基因接合成重组体E.限制性核酸内切酶的应用11.常用质粒有以下特征A.是线性双链DNAB.插入片段的容量比λ噬菌体DNA大C.含有抗生素抗性基因，D.含有同一限制性核酸内切酶的多个切口E.不随细菌繁殖而进行自我复制14.表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是A.大肠杆菌表达体系B.原核表达体系C.酵母表达体系D.昆虫E.哺乳类细胞表达体系，18.在分子生物学上“重组DNA技术”又称为A.酶工程B.蛋白质工程C.细胞工程D.发酵工程E.分子克隆技术22.基因组代表一个细胞或生物的A.部分遗传信息B.整套遗传信息，C.可转录基因D.非转录基因E.可表达基因25.在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A.化学合成法B.基因组文库法C.cDNA文库法D.PCRE.差异显示法27.PCR主要的酶是A.DNA连接酶B.反转录酶C.末端转移酶D.碱性磷酸酶E. Taq DNA聚合酶28.重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶A.DNA聚合酶B.RNA聚合酶C.DNA连接酶D.RNA连接酶E.限制性核酸内切酶30.最常用的筛选转化细菌是否含重组质粒的方法是A.营养互补筛选B.抗药性筛选，C.免疫化学筛选D.PCR筛选E.分子杂交筛选33.用于重组DNA的限制性核酸内切酶，识别核苷酸序列的A.正超螺旋结构B.负超螺旋结构C.α-螺旋结构D.回文结构，E.锌指结构58、基因治疗是指A．对有基因缺陷的细胞进行修复，从而使其恢复正常，达到治疗疾病的目的B．把健康的外源基因导入到有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的C．运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变恢复正常D．运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的93．PCR实验的特异性主要取决于A．DNA聚合酶的种类B．反应体系中模板DNA的量C．引物序列的结构和长度D．四种dNTP的浓度E．循环周期的次数94．基因剔除（knock out）的方法主要被用来研究A．基因的结构B．基因的功能C．基因的表达D．基因的调控E．基因的突变95．反义核酸作用主要是A．封闭DNA B．封闭RNAC．降解DNA D．降解DNA E．封闭核糖体的功能105. 酵母单杂交技术是分析【】的实验系统。
基因重组技术
寡核苷酸片段组装基因的方式
基因的组装：按设计要求用许多寡核苷酸片段装 配成完整基因的过程。
第一种方法是先将寡核苷酸 激活，带上必要的5’-P基团， 然后再与相应的互补寡核苷 酸片段退火，形成带有粘性 末端的双链寡核苷酸片段。 把这些双链寡核苷酸片段混 合在一个试管中，加上T4 DNA连接酶，使它们彼此连 接组成一个完整的基因或者 是基因的一个片段。
基因重组技术
1
3 基因重组技术 3.1 概述 3.1.1 定义
基因重组技术是一种在分子水平上按照人们设 计的蓝图对基因进行人工操作的技术，具体地说， 就是从一种细胞中把目的基因提取出来，在体外把 它和一种载体分子连接，然后用人工的方法将这种 杂种DNA分子引入到另一种细胞中去，让其大量复 制繁殖或产生大量基因表达产物。
3 基因重组技术 3.4 基因重组技术的载体 3.4.1 载体的定义和基本特性
• 载体(vector)的定义：
在基因重组中，可与外源DNA片段构成重组体， 并能将重组体DNA导入受体细胞，使外源DNA得以复 制或表达的DNA分子。
• 载体应具备的基本特性：
• 在宿主细胞中能独立复制；
• 具一段不影响其复制的非必需区域；
• 简称 限制性内切酶、限制酶、内切酶。
6
• 种类 目前，已从近300种不同的微生物分 离出约500种限制性核酸内切酶。
• 类型（ 三种类型） 型酶、 型酶和 型酶。 若无说明，通常的限制性核酸内切
酶就是指 型酶。
7
三种核酸限制性内切酶的主要特性比较
特性
酶分子的结构与功能 辅助因子 识别序列 切割位点 在DNA克隆中的用途
定义：能催化双链DNA分子中相邻的5’-P与3 ’-OH 之间形成磷酸二酯键的酶。
基因工程练习题
基因⼯程练习题第⼀章绪论1基因:是指DNA分⼦中含有特定遗传信息的⼀段核苷酸序列，是遗传物质的最⼩功能单位。
2管家基因与奢侈基因：具有相同遗传信息的同⼀个体细胞间其所利⽤的基因并不相同，有的基因活动是维持细胞基本代谢所必须的，⽽有的基因则在⼀些分化细胞中活动，这正是细胞分化、⽣物发育的基础。
前者称为管家基因，⽽后者被称为奢侈基因结构基因与调节基因：结构基因是可以转录成为各种RNA（rRNA,tRNA,snRNA）直接⾏使功能，或者转录成信使RNA（mRNA）然后翻译成多肽链，最终形成各种功能蛋⽩质和酶。
从⼴义上讲，任何⼀种能够调节或限制其他基因活性的基因都可以叫做调节基因。
移动基因：转座⼦属于可移动的遗传因⼦重叠基因：它的同⼀部分DNA可以编码两种不同的蛋⽩质，也就是说同⼀部份DNA存在2个重叠基因3基因组:是指⼀个⽣物体、细胞器或病毒的全部基因4断裂基因:被间隔序列间隔成若⼲个部分，⽽形成不连续形式的基因，是真核基因的普遍形式5假基因:是⼀类在基因组中稳定存在，序列组成也酷似正常基因，但不能表现出任何功能的DNA序列。
6启动⼦：DNA链上能指⽰RNA转录起始的DNA序列称为启动⼦，(1)-35序列提供RNA聚合酶全酶识别位点，(2)-10序列是酶与DNA紧密结合的位点，(3)RNA 合成的起始点7复制⼦：DNA 中发⽣复制的独⽴单位称为复制⼦(Replicon)，这是⼀段具有特殊结构的DNA序列，载体有复制起点才能使与它结合的外源基因在宿主细胞中独⽴复制繁殖。
8增强⼦：就是远离转录起始点（1 ~ 30 kb）、决定基因的时间、空间特异性表达、增强启动⼦转录活性的DNA序列，其发挥作⽤的⽅式通常与⽅向、距离⽆关。
9单克隆抗体：由单⼀细胞克隆⽣成的抗体是单克隆抗体，所有这些抗体分⼦都是相同的并以同样的亲合⼒结合在抗源的相同部位上10黏性末端：由限制性内切酶切割后在双链DNA的切⼝处产⽣交替互补的单链末端11操纵⼦：是指染⾊体控制蛋⽩质（酶）合成的功能单位，操纵⼦包括调节基因、操纵基因和结构基因12终⽌⼦：模板DNA上存在终⽌转录的特殊信号称为终⽌⼦。
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
10
（一）引入酶切位点连接法
21
电转化的原理图（引自孙明，2006）
22
（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
23
二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
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↓
↓
寄主菌中大量积累尾部蛋白和D蛋白 寄主菌中大量积累头部前体蛋白和尾 部蛋白 ↓ 尾部蛋白、D蛋白
↓
头部前体蛋白
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转化率
转化率的定义
定义：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。
由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载
体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，接
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Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备：
100 mL 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 mL 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体 用1 mL 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用
缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细
胞均有效，但转化效率差别很大
基因枪法 显微注射法
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转染-概念
重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程
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转染-过程
λ噬菌体DNA的转染
感受态细胞的培养：
将大肠杆菌在含有MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5
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取100 mL 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组DNA连接液，混匀
冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲）
快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟
加入1 mL 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
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转化-人工转化常用方法
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受体细胞方面：
受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌
JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高
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转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例：
Ca2+诱导转化 原生质体转化 0.1 mL 感受态细胞 109 个原生质体 50 ng DNA 50 ng DNA
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转化率的影响因素
载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：
不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同
载体的空间构象：
质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体 由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质 粒低两个数量级
插入片段的大小：
对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低
细菌原生质体的转化
革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳 外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用 原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒 或重组DNA分子酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质
体法进行转化
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细菌原生质体的转化
细菌原生质体的制备：
不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细 菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，在制备过程中，菌
第六章 重组克隆载体引入 受体细胞
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基因工程的操作过程
切 接 转
增 检
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受体细胞的特性
具有接受外源DNA的能力 应为限制、修饰系统缺陷型
应为DNA重组缺陷型
不适于在人体内或非培养条件下生存 DNA不易转移
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重组DNA进入受体细胞的途径
→ 双链DNA结合 → 双链DNA解链 → 单链DNA进入
感受态：细胞能从周围环境中吸取DNA的生 理状态
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转化-人工转化常用方法
Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化
Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌
（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2 发生收缩作用，使细胞膜出现空隙
转化方法：
Ca2+诱导转化 原生质体转化 106 - 107 / mg DNA 105 - 106 / mg DNA
λ -DNA转染 电穿孔转化
107 - 108 / mg DNA 106 - 109 / mg DNA
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转化细胞的扩增
扩增操作
转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。
重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导
重组λDNA + 噬菌体头部蛋白+ 噬菌体尾部蛋白
包装
成熟λ噬菌体颗粒
感染宿主细胞
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重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导—基本原理 无义突变：由于一对或几对碱基的改变而使决定 某氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突 变 琥珀突变：密码子变为UAG的无义突变 （amber mutation）
吸附：
加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟
转染裂解：
加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选
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转导-概念
通过噬菌体为媒介，重组DNA进入受体细胞的过程
感染：噬菌体侵染宿主菌的过程
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体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有
器皿应保持无水无去污剂
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细菌原生质体的转化
细菌原生质体的转化：
取0.2 - 1mL的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加 入10 - 20 mL DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等
转化 转染
转导
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转化-概念
受体菌直接接受来自供体菌的DNA片段，而能获 得部分新的遗传性状的过程 把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的 过程
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转化-过程
感受态因子出现 → 与膜受体结合 → 特异性蛋 白质表达 → 细胞表面DNA结合蛋白及核酸酶裸露
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Egene→E蛋白 λ 噬菌体头部蛋白组成（占头部蛋白72%） Dgene D蛋白 噬菌体头部外侧蛋白（占头部蛋白20%）
λ噬菌体B（Dam） λ噬菌体A（Eam） ↓ 不能合成E蛋白
↓
不能合成D蛋白
↓
不能形成头部结构
↓
λDNA不能进入头部前体，
成熟终止于头部前体阶段
渗溶液，混匀
细菌原生质体的再生：
原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在 特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素
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转化-人工转化常用方法
电穿孔转化
将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，
两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生
在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 λ 噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作
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扩增操作的目的
增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定
纳DNA的受体细胞个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的 受体细胞不长）
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转化率的定义
例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有
10 8 个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011 个分子，也就 是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2mL感受态 细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有 一个细胞能接纳pUC18 DNA