大麦_淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌
糖化酶的研究进展
糖化酶的研究进展摘要：糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类,介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。
关键词: 糖化酶; 特性; 活力一、糖化酶的简介糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。
本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。
50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。
糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)](缩写GA或G), 糖化酶是一种习惯上的名称,学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucanglucohydrolace).糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。
（深层发酵是利用深层培养基的厌氧环境来培养厌氧细菌，但不能培养严格厌氧细菌,多用于兼性厌氧菌和微耗氧菌的培养）重要糖化酶生产菌有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉等。
糖化酶是具有外切酶活性的胞外酶。
其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。
对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。
糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。
二、糖化酶的结构组成及分类糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。
不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。
大麦芽酶在工业酿酒中的应用与研究进展
大麦芽酶在工业酿酒中的应用与研究进展大麦芽酶是一种重要的发酵酶，在工业酿酒中被广泛应用。
本文将探讨大麦芽酶在工业酿酒中的应用及研究进展。
首先，我们将介绍大麦芽酶的作用机理和分类，然后探讨其在工业酿酒中的应用和效果，并总结目前的研究进展和未来的发展方向。
大麦芽酶是一种天然的酶类，主要存在于大麦中，可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两类。
α-淀粉酶能够将淀粉分解成麦芽糖和淀粉酚，并且在酿酒过程中会解除淀粉颗粒的结构，促进淀粉的溶解。
而β-淀粉酶则能够将淀粉链上的1，4-链接断裂，产生麦芽糖和麦芽糖醇。
这些酶的作用能够提高酿酒过程中的糖化效率和酿酒品质。
大麦芽酶在工业酿酒中有着广泛的应用。
首先，在啤酒生产中，大麦芽酶是不可或缺的。
在麦汁糖化过程中，大麦芽酶能够将大麦中的淀粉转化为可发酵的麦芽糖，为酵母发酵提供碳源。
同时，大麦芽酶还能够降低酿酒过程中的粘度，提高过滤效果，使得生成的啤酒更加清澈透明。
其次，在白酒生产中，大麦芽酶也扮演着重要的角色。
在高温下，大麦芽酶能够分解淀粉，提供更多的可发酵糖源，增加酵母的发酵效率。
同时，大麦芽酶还能够降解含有麦芽糖醇的多糖，减少产生的副产物，提高酿酒的品质和口感。
此外，大麦芽酶还被应用于其他工业酿酒过程中。
例如，在果酒生产中，它能够帮助糖化果汁中的果糖和葡萄糖，促进酵母的发酵和产生酒精。
在米酒生产中，大麦芽酶能够分解米中的淀粉，转化为可发酵的糖源，提高发酵效率和产酒量。
在葡萄酒生产中，大麦芽酶可以提高果皮萃取的效果，增加香气和口感的复杂性。
目前，大麦芽酶在工业酿酒中的应用仍在不断发展和完善中。
研究人员不仅致力于寻找更高效的大麦芽酶的提取方法和纯化技术，还在探索酶的改良和突变来提高酿酒效果。
此外，还有越来越多的研究关注大麦芽酶与其他酶类的协同作用，以获得更好的酿酒效果和产品品质。
未来，大麦芽酶在工业酿酒中的应用前景仍然广阔。
随着人们对酿酒品质的要求越来越高，对大麦芽酶的研究和应用也将进一步深入。
a-淀粉酶概述及应用
面包等焙烤食品储存一定时间后逐渐变干变硬，易碎，风味变差，这些都是 由于面包的陈化造成的，每年由于面包老化造成巨大的损失。传统的用于抑制老 化，提高焙烤食品质地和风味的添加剂主要有化学试剂，食糖，奶粉，糖酯，卵 磷脂和抗氧化剂等，近几年，酶 制剂越来越多的作为面团改良剂和抗老化剂用在 焙烤工业中，包括α-淀粉酶、分支酶、去分支酶、β-淀粉酶和普鲁兰酶等，其 中将α-淀粉酶和普鲁兰酶联合使用可以有效的延迟焙烤食品陈化，提高产品的货 价期。但是 ，在使用α-淀粉酶时，对其加入量要求比较严格，稍微过量就会导 致面包等焙烤食品粘度的增加。因此，最近人们逐渐使用中温α-淀粉酶，由于其 最适作用温度在 50℃～70℃左右，所以其在淀粉糊化时具有活性，而在焙烤过程 中则会逐渐失活，最终在焙烤完成时活性丧失。而且，在加工过程中α-淀粉酶会 水解淀粉生成聚合度在 4～9 的糊精，这些糊精也具有抗老化性。但是，现在中温 α-淀粉酶仅能从极少的一些微生物中提取[9-10]。
4.α-淀粉酶的工业应用
α-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早 的商业化应用在 1984 年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。现在，α-淀粉酶已 广泛应用于食品、清洁剂、啤酒酿造、酒精工业等。
4.1 在焙烤工业中的应用
各种酶制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史，最近几十年α-淀粉酶广 泛地应用于焙烤工业中焙烤工业中使用的酶制剂有很多，如蛋白酶、脂肪酶、普 鲁兰酶、木聚糖酶、纤维素酶、糖化酶等，但没有一种酶能取代α-淀粉酶在焙烤 食品中的应用。α-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高 面团的发酵速度；改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而 稳定的面包外表色泽；提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感； 延长面包心储存过程中的保鲜期。
酿酒发酵工程知识点总结
酿酒发酵工程知识点总结一、酿酒发酵微生物的选择在酿酒工程中，发酵微生物是至关重要的一环。
发酵微生物的种类和数量不仅影响着酿酒产品的品质和口感，还直接关系到酿酒过程中的发酵速度和发酵产物的种类。
酿酒发酵工程中常见的发酵微生物主要包括酵母菌、乳酸菌、酢酸菌等。
1. 酵母菌酵母菌是酿酒过程中最常用的发酵微生物之一。
它能够利用酿酒原料中的碳水化合物进行发酵，产生酒精和二氧化碳，从而实现酒精发酵的过程。
在酿酒过程中，常用的酵母菌主要包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、泡沫酵母（Saccharomyces pastorianus）等。
2. 乳酸菌乳酸菌是一类革兰氏阳性的革兰氏阳性细菌，它们能够将葡萄糖等碳水化合物通过乳酸发酵转化成乳酸。
乳酸是一种具有抗菌作用的有机酸，能够在酒精发酵过程中起到保护作用，还能够为酒液增添口感和香气。
因此，在一些酒类的生产中，常常会使用乳酸菌进行辅助发酵。
3. 酢酸菌酢酸菌是一种产酸的细菌，能够将酒精氧化成乙醇和醋酸。
在酿酒过程中，酢酸菌通常会在酒液中进行醋酸发酵，从而产生醋，丰富酒类产品的口感和香气。
二、酿酒原料的加工酿酒工程的第一步是选择合适的酿酒原料，并且对原料进行合理的加工处理。
酿酒原料的种类繁多，包括谷物、水果、蔬菜等。
不同种类的酿酒原料在酿酒过程中所起的作用也有所不同。
1. 谷物谷物是酿酒中常用的原料之一，包括小麦、大麦、玉米、稻米等。
谷物中所含的淀粉是酵母菌进行发酵所需的主要碳源。
在酿酒过程中，谷物需要经过破碎、粉碎、糖化等工序，将其中的淀粉转化成可被发酵微生物利用的葡萄糖和麦芽糖。
2. 水果水果类原料包括苹果、梨、葡萄、樱桃等。
水果中的果糖和葡萄糖是酵母菌进行发酵所需的主要碳源。
在酿酒过程中，水果需要先进行榨汁，然后通过浸渍、糖化等工序，将果糖和葡萄糖转化成可被发酵微生物利用的碳水化合物。
3. 蔬菜蔬菜类原料包括白菜、辣椒、豆类等。
蔬菜中所含的淀粉、蛋白质、脂肪等成分是酵母菌进行发酵所需的主要营养物质。
黑曲霉糖化酶基因克隆及在酿酒酵母中的表达
（ 湖 南 农 业 大 学 生 物科 学技 术 学 院 ， 湖南 长沙 ４ １ ０ １ ２ ８ ）
摘要： 为 了 以酿 酒 酵母 ￥ ７ ８为 宿 主 菌 异 源 高 效 表 达 糖 化 酶 基 因 ， 进 一步 扩大糖 化酶 基因在 工业 生产上 的应用 。
（ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｂ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｈ ｕ ｎ ａ ｎ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ ４ １ ０ １ ２ ８ ）
● Ｃ Ｔ ●
Ｉ Ｉ Ｂ Ｒ Ｉ ＣＵ Ｌ Ｔ Ｕ Ｒ Ｉ Ｉ Ｅ 华 北 农 学 报 ・ ２ ０１ ７， ３ ２（ ６）： ｌ ２ １ 一 ｌ ２ ５
Ｂ Ｏ Ｒ Ｅ Ｉ ＫＩ － ｜ Ｉ Ｈ Ｉ ％
黑 曲霉 糖 化 酶 基 因克 隆及 在 酿 酒 酵 母 中 的表 达
￥ ７ ８中成 功 表 达 并 能 有 效 分 泌 到 细胞 外 。
关键词 ： 黑曲霉 ； 糖化 酶 ； 酿酒酵母 ； 异 源 表 达
中 图分 类 号 ： Ｑ ７ ８ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ０— ７ ０ ９ １ （ ２ ０ １ ７ ） Ｏ ６— ０ １ ２ ｌ一 ０ ５
运用 Ｒ Ｔ ． Ｐ Ｃ Ｒ法 从 黑 曲霉 中 克 隆 得 到 糖 化 酶 基 因 （ ｇ ｌ ａ Ａ） ｃ Ｄ Ｎ Ａ， 去 除 其 信 号 肽 编 码 区 后 的 序 列 重 组 到 酵 母 表 达 载 体 ｐ Ｖ Ｔ １ ０ ２ Ｕ ／ ｃ ｔ Ａ Ｄ Ｈ １强 启 动 子 下 游 ， 并 与 ｄ因 子 分 泌 肽 信 号 序 列 融 合 。用 Ｐ Ｅ Ｇ ／ Ｌ ｉ Ａ ｃ法 将 构 建 的重 组 表 达 载 体 转 入 酿பைடு நூலகம் 酒酵母 ￥ ７ ８菌株 ， 筛 选 出 的转 化 菌 点 种 到 可 溶 性 淀 粉 平 板 上 培 养 ， 用 碘 染 法 鉴 定 重 组 基 因 的 表 达 情 况 。鉴 定 出 了 典
酿酒工业常用的酶制剂
酿酒工业常用的酶制剂酿酒工业常用酶制剂有糖化酶、β—淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、酯化酶等。
酿酒中的α-淀粉酶（淀粉—1,4糊精酶）主要来源于细菌和霉菌，特别是枯草杆菌和曲霉。
我国工业生产的α-淀粉酶制剂就是用枯草杆菌BF7658。
对直链淀粉的分解率可达100%，对支链淀粉只能达93~94%。
α-淀粉酶怕酸不怕热，作用温度可达90~100℃。
β-淀粉酶（淀粉—1,4—麦芽糖苷酶）对支链淀粉只能分解54%，怕热不怕酸，作用温度70℃左右。
β-淀粉酶存在于植物、微生物中，特别是大麦中最多，小麦、甘薯和大豆中均有。
近年来，发现在不少微生物中，如芽孢杆菌、假单孢菌、链霉菌等均能产生β-淀粉酶，而且有的菌种产量较高。
葡萄糖淀粉酶（淀粉—1,4—葡萄糖苷酶）主要来源于霉菌，如黑曲霉、红曲霉、根霉、拟内孢霉等，酶的活力均较高，各类菌均有特点，在酿酒工业中常用和常见的菌一般都是黑曲霉和根霉。
目前国内生产的糖化酶制剂主要用黑曲霉生产，酶活力较高。
异淀粉酶（淀粉—1,6—葡萄糖苷酶）主要来源于微生物和植物，如杆菌、球菌、假单孢菌、酵母菌以及放线菌均能产生。
在生产中可以将异淀粉酶与其他淀粉酶类协同作用，能提高分解能力，增加产率。
转移葡萄糖苷酶主要来源于黑曲霉，根霉和红曲霉不产转移葡萄糖苷酶，但糖化酶产量没有黑曲霉高，所以选育不产转移葡萄糖苷酶的黑曲霉来生产糖化酶是很重要的。
纤维素酶在微生物、动物、植物中均有存在，特别在多种微生物中都有存在，如霉菌、放线菌、细菌中均能产生，但以木霉的产酶能力较强。
在酿酒过程中如能利用一定量的纤维素酶，它能使原料中含有一定纤维素的谷类、薯类、麸皮、农副产品、野生植物及填充料等充分利用，增加可发酵性糖，提高出酒率。
果胶酶不生成甲醇，它使果胶的半乳糖醛酸的链加水分解生成半乳糖醛酸。
在果汁澄清和蔬菜软化中都有应用，其作用给糖化创造了有利条件。
果胶酶广泛来源于微生物、植物，如霉菌、酵母菌、细菌均有产生，特别是霉菌的产量较多。
糖化酶及糖化酶基因在酿酒酵母中表达的研究进展
ｒ ｇ ｓｉ ｈ ｅｍａ ｔ ｇｔｗ ｒｏｄ ｒ ， ｋｎ ｏ ｄ ｕ ｅ ｏ ａ ｅ ｓ ｖｎ ｈ ｅａ ｅ ， ｒａ ｇｎ ｈ ｅｅ ｕ ｐ ｎ ｉ ｔｎ ｉｅｙ ａ ｄ ｐ ｖｄ ｎ ｈ ｅａ ｔ ｎ ａ ｅ ｎｔ ｌ ｉ ｏ ｅ ｒ ｅ ｙ ｍａ ｉ ｇｇ ｏ ｓ ｆ ｐ ｃ ， ａ ｉ ｇｔ ｒ ａ ａｒ ｉ ｇｔ ｑ ｉ ｍｅ ｔ ｎ ｅ ｓｖ ｌ ， ｎ ｌ ｓ ｎ ｎ ｒ ｉ ｉｇｔ ｕｏ ｏ ｍａｉ ｏ ｔ ， ａ ｄ ｔ ｃ ｎ ｃ Ｄ ｒ ｔ ｎ ｃ ｎ ｅ ｉｎ ｙ ｈ ｅ ｆ ｗ ｄ ｓｇ ｆ ｔｗｅ ｙ ｔ ｍ ｏｎ ｉ ｅ ｔ ｅ ｐ ｎ ｉｌ ｆ ｂ ｌｙ ｇ ｏ ｔ ， ｔ ｃ ｎ ｒ １ｎ ｅ ｈ ｉ ｏ ｅ ａ ｉ ｏ ｖ ｎ ｅ ｔ ．Ｔ ｏ ｅ ｉｎ ｏ ｏ ｒ ｓ ｓｅ ｃ ｉ ｃｄ ｓ ｗｉ ｔ ｒ ｃｐ ｅ ｏ ａ ｅ ｒ ｗ ｈ ｃ ￣ ｌ ａ ０ ｌ ｌ ｈ ｈ ｉ ｒ ｍｅａ ｏｉｍ ． ｅｍ／ａ ｏ ． ｅｅ ｕｐ ｎ ｃ ｅ ｋ ｓｔ ｅｔｃ ｎ ｌｇｃ ｔｇ ｓｂ ｉｉ ｅ ｒ ｃ ｕ ａｅｙ ａ ｄ ｅ ｓ ｒ ｓｔ ｅｐ ｃ ｄ ｒ ｔｂ ｌ ｓ ｍｄ ｇ ｒ ｎ ｔ ｎ Ｔ ｑ ｉ ｍｅ ｔ ｈ ｍｅ ｍａ ｅ ｈ ｏｏ ｉａ ｓ ｅ ｅｄ ｖｄ ｄ ｍｏ ｅａ ｃ ｒ ｔｌ， ｉ ｈ ｓ ｈ ｅ ｌ ａ ｎ ｎ ｕｅ ｒ ｅ ｕ ｅ ｈ ｏ
高效分泌到酿酒酵母胞 外的研究进展 ； 展望 了糖化酶今后 的研 究方 向以及应 用前景。
关键词： 糖化酶 ； 结构 ； 酒酵母 ； 因表达 酿 基
中图分类号 ： Ｓ ６ ．１ Ｓ６ ．５ １ Ｔ ２ １ ； ２ １１； ３ １Ｔ Ｑ８ 文献标识码： Ｂ
收稿 日期 ：０ ７ Ｏ — ２ ２０一３２ 作者简介 ： 刘喜风 （９ 【 ）河 南安 阳人 ， １８卜 ， 中国科 学院微 生物所博 士
酒曲的种类有哪些？
酒曲的种类有哪些？水为酒之血，曲为酒之骨。
关于酒曲的最早文字可能就是周朝著作>中的'若作酒醴，尔惟曲蘖'。
从科学原理加以分析，酒曲实际上是从发霉的谷物演变来的。
酒曲的生产技术在北魏时代的>中第一次得到全面总结，在宋代已达到极高的水平。
酒曲，在经过蒸煮的白米中，移入曲霉的分生孢子，然后保温，米粒上便会茂盛地生长出菌丝，此即酒曲。
曲霉产生的淀粉酶会糖化米里面的淀粉，因此，自古以来就有把它和麦芽同时作为原料糖，用来制造酒、甜酒和豆酱等。
用麦类代替米者称麦曲。
纵观世界各国用谷物原料酿酒的历史，可发现有两大类，一类是以谷物发芽的方式，利用谷物发芽时产生的酶将原料本身糖化成糖份，再用酵母菌将糖份转变成酒精;另一类是用发霉的谷物，制成酒曲，用酒曲中所含的酶制剂将谷物原料糖化发酵成酒。
从有文字记载以来，中国的酒绝大多数是用酒曲酿造的，而且中国的酒曲法酿酒对于周边国家，如日本、越南和泰国等都有较大的影响。
虽然中国人民与曲蘖打了几千年的交道，知道酿酒一定要加入酒曲，但一直不知道曲蘖的本质所在。
现代科学才解开其中的奥秘。
酿酒加曲，是因为酒曲上生长有大量的微生物，还有微生物所分泌的酶(淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等)，酶具有生物催化作用，可以加速将谷物中的淀粉，蛋白质等转变成糖、氨基酸。
糖分在酵母菌的酶的作用下，分解成乙醇，即酒精。
蘖也含有许多这样的酶，具有糖化作用。
可以将蘖本身中的淀粉转变成糖分，在酵母菌的作用下再转变成乙醇。
同时，酒曲本身含有淀粉和蛋白质等，也是酿酒原料。
酒曲酿酒是中国酿酒的精华所在。
酒曲中所生长的微生物主要是霉菌。
对霉菌的利用是中国人的一大发明创造。
日本有位著名的微生物学家坂口谨一郎教授，认为这甚至可与中国古代的四大发明相媲美，这显然是从生物工程技术在当今科学技术的重要地位推断出来的。
随着时代的发展，中国古代人民所创立的方法将日益显示其重要的作用。
一、大曲分中温曲、高温曲和超高温曲。
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大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌3罗进贤 李政海 李文清(中山大学生物化学系及生物工程中心,广州510275)摘要 将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶cDNA 重组进同一大肠杆菌2酵母穿梭质粒构建含双基因的表达分泌载体pMA G 15.用原生质体转化法将pMA G 15引入酿酒酵母(S.cerevisiae GRF18),在酵母P GK 基因的启动子和转录终止信号及本身的信号序列的调控下,实现大麦α2淀粉酶和糖化酶的高效表达,99%以上的酶活力分泌至培养基中.构建的酿酒酵母菌株GRF18(pMA G 15)在含15%可溶性淀粉的培养基中,培养47h 能水解99%的淀粉,并能发酵产生酒精.关键词 大麦α2淀粉酶 黑曲霉糖化酶 酿酒酵母 表达和分泌酿酒酵母是酿酒工业、酒精和单细胞蛋白的生产菌,但由于其不具有淀粉水解酶的活力不能发酵淀粉.发酵前淀粉需先经过蒸煮、液化、糖化等工序变成葡萄糖后才能被利用.从80年代中期开始将各种来源的α2淀粉酶和糖化酶基因分别克隆进酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母菌株[1～5].只是由于构建菌株的酶活力不高,降解淀粉的速率较慢还不能用于生产.我们曾将地衣芽孢杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶G AI 的cDNA 分别或同时转入酿酒酵母获得表达和分泌[6～9],其中含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27),酶的表达和分泌水平都很高,但淀粉水解的速率仍较低.本文报道用酶学性质与黑曲霉糖化酶比较接近的大麦α2淀粉酶取代细菌α2淀粉酶,构建含大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母工程菌,实现α2淀粉酶和糖化酶的高表达和分泌,获得能快速分解淀粉的酵母工程菌.1 材料和方法111 材料11111 菌株与质粒 本研究所用菌株与质粒如表1,其中pBAL 27是含大麦α2淀粉酶基因的大肠杆菌2酵母穿梭质粒,pMA G 69为含黑曲霉糖化酶G AI cDNA 的大肠杆菌2酵母穿梭质粒.11112 培养基 大肠杆菌培养和转化用LB 培养基,酵母的培养和转化使用的YPD , 1996209208收稿,1996211205收修改稿 3广东省自然科学基金资助项目中国科学 (C 辑) 第28卷 第1期SCIENCE IN CHINA (Series C ) 1998年2月YP GE ,YPSB ,YNB ,SC ,SORB ,YPS 等培养基,其配方见文献[10].表1 菌株与质粒菌株/质粒基因型来源E.coli C600F -,thi 21.leuB6,lac Y1,tonA21,Sup E44Jacob 2Monod 研究所S.cerevisiae GRF18leu2,his3,sta -,ihn-Dr.Hollenburg pBAL 27Amp r ,amy +,L EU ,2μori ,pBR322ori 广东省微生物研究所pMA G69Amp r ,GAI ,L EU 2μori ,pBR322ori 本室构建[8]pMA G15Amp r ,amy +,GAI ,L EU 2μori ,pBR322ori 本研究工作11113 主要生化试剂 限制酶EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ,T 4DNA 连续酶购自GIBCO 2BRL 公司,低熔点琼脂糖、BSA 、A TP 等为Sigma 公司产品.葡萄糖试剂盒为广州环通生物技术公司产品.112 方法11211 质粒的检测和制备 大肠杆菌质粒的检测和制备按Sambrook 的方法[11],酵母质粒的检测按Sherman 的方法[12].11212 质粒的酶解、酶解片段的回收、D NA 分子的连接和大肠杆菌转化 参照文献[11]的方法.11213 酵母原生质体转化 按Burgers 的方法[10].11214 淀粉酶阳性菌落的检测和总酶活力测定 见文献[6].一个酶活力单位定义:p H610,60℃的条件下保温1h 产生1mg 葡萄糖的酶量.11215 培养液中剩余淀粉含量的测定及重组质粒稳定性检测 参照K im 的方法[13].11216 发酵液中酒精含量的测定 采用简易的酒精定量测定法.先配浓度体积分数为1%,3%,5%,7%及9%的酒精标准液.加3mL K 2Cr 2O 4溶液(4%K 2Cr 2O 4溶于20mol/L H 2SO 4)于6mL 刻度试管内,将刻度试管置于加有012mL 饱和K 2CO 3的50mL 比色试管中,加015mL 酒精标准液于比色管中,立即盖好盖子,摇匀,于50℃保温5h.取出后在刻度管内加入3mL 蒸馏水,摇匀,测A 560并以双蒸水代替酒精作对照.以酒精标准液浓度为横坐标,A 560为纵坐标绘制标准曲线.测定发酵液中酒精含量时,用015mL 发酵液取代酒精标准液,测定A 560值后,查标准曲线乘以稀释倍数即得发酵液中酒精含量.11217 SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳 参照文献[11]的方法.2 实验结果211 含α2淀粉酶和糖化酶双基因的酵母表达载体的构建为使大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因在酿酒酵母中同时表达,需将这2个基因重组在同一表达载体.大麦α2淀粉酶cDNA 位于质粒pBAL7上酵母P GK 启动子和转录终止信号之间.黑曲霉糖化酶cDNA 位于质粒pMA G 69上.我们设想将pBAL7上含P GK 启动子2大麦α2淀粉酶cDNA 2P GK 转录终止信号的314kb 片段切出转移至质粒pMA G 69上构建含双基因的表达载体.如图1所示,用Hind Ⅲ酶切质粒pBAL7,低熔点琼脂糖凝胶电泳分离314kb 的含α2淀粉酶cDNA 及P GK 调控序列的片段;同时用Hind Ⅲ部分酶切质粒pMA G 69,电泳分离第1期罗进贤等:大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌51 图1 重组质粒pMA G 15的构建P ,T 分别为PGK 基因的启动子及转录终止信号,BA 为大麦α2淀粉酶基因,GA 为黑曲霉糖化酶基因1116kb 的线状质粒DNA.将314及1116kb 的片段以适当比例混合,经T 4DNA 连接酶连接后转化大肠杆菌C600,筛选Amp r 转化子,经质粒检测和酶切分析,获得α2淀粉酶cDNA 正确插入pMA G 69上合适位点的重组质粒pMA G 15.由于pMA G 69上有3个Hind Ⅲ切点,构建重组质粒时采用Hind Ⅲ部分酶切的方法,可获得酶切位点不同的1116kb pMA G 69线状DNA ,314kb 的α2淀粉酶基因可以在不同的Hind Ⅲ位点插入,用EcoR Ⅰ酶切重组质粒pMA G 15可以判断α2淀粉酶的插入位点(图2).本实验的结果表明不管从那个位点插入都不会影响葡萄糖淀粉酶基因的表达.212 大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌用原生质体转化法将211中构建的重组质粒pMA G 15转入酿酒酵母GRF18,在缺亮氨酸的SORB 再生培养基上筛选转化子,获得能在不含亮氨酸的培养基生长的酿酒酵母GRF1852 中 国 科 学 (C 辑)第28卷(pMA G 15),然后把此转化株GRF18(pMA G 15)转移至缺亮氨酸的YNB 淀粉培养基上,并以酿酒酵母GRF18(pMA G 69),GRF18(pBAL7)及受体菌GRF18作对照,在30℃培养4d 后,倒碘液于平板上,可见在GRF18(pMA G 15),GRF18(pMA G 69)及GRF18(pBAL7)菌落周围均出现淀粉水解圈,其中以GRF18(pMA G 15)最大,受体菌GRF18则不生长(图3);这一结果表明,淀粉酶已在酵母中表达并分泌至胞外.图2 重组质粒pMA G 15的酶切分析1为λcl857S7/Hind Ⅲ,2为pMA G69/EcoR Ⅰ,3为pMA G15/EcoR Ⅰ,4为pMA G69/Hind Ⅲ,5为pMA G15/Hind Ⅲ,6为pBAL7/HindⅢ图3 酿酒酵母转化子在淀粉培养基上形成的水解透明圈1为酿酒酵母GRF18(pMA G15),2为酿酒酵母GRF18(pMA G69),3为酿酒酵母GRF18(pBAL7),4为酿酒酵母GRF18为了进一步研究α2淀粉酶和糖化酶在酵母中的表达和分泌情况,按照文献[6]的方法,将上述酵母转化子接种于不含葡萄糖的YP GE 培养基中,30℃振摇60h ,离心测上清液中的总酶活,用蜗牛酶和超声波将菌体裂解后测胞内酶活力,结果如表2.表2 酿酒酵母GRF18转化子的酶活力酿酒酵母转化子胞外酶活/U ・mL -1胞内酶活/U ・mL -1总活力/U ・mL -1分泌量/%GRF180000GRF18(pMA91)0000GRF18(pBAL7)56.500.5257.0299.10GRF18(pMA G69)90.00.4590.4599.50GRF18(pMA G15)152.300.80153.1099.47表2的结果显示含α2淀粉酶和糖化酶双基因的转化子GRF18(pMA G 15)的总酶活力比含α2淀粉酶或糖化酶单基因的转化子GRF18(pBAL7)及GRF18(pMA G 69)要高,而且99%以上的酶活力都分泌至培养基中.为了证明大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶已在酿酒酵母中同时表达,把酵母转化子GRF18(pMA G 15)及GRF18(pBAL7),GRF18(pMA G 69)的培养上清液用80%饱和度的硫酸铵于4℃沉淀过夜,沉淀用20mmol/L 的磷酸缓冲液(p H6.0)溶解后透析除盐,真空干燥浓缩后,用第1期罗进贤等:大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌53 适量20mmol/L 的磷酸缓冲液溶解,走SDS 2PA GE 电泳,结果如图4.从图中可见GRF18(pBAL7)在43ku 处有1条新带而GRF18(pMA G 69)在67ku 稍大的位置上有1条多余的带(黑曲霉糖化酶的分子量为71ku ).含双基因的转化子GRF18(pMA G 15)在43ku 和71ku 的相应位置上都出现新的带.我们曾将培养上清液用硫酸铵沉淀后上DEAE 2纤维素柱层析亦发现有α2淀粉酶和糖化酶活力,前者在流出液中,后者在500mmol/L 的洗脱液中(数据未列出).以上结果显示α2淀粉酶和糖化酶已在酿酒酵母中同时获得表达和分泌.213 酿酒酵母转化子GRF18(pMAG 15)对淀粉的水解和利用为了检查酿酒酵母GRF18(pMA G 15)的水解和利用淀粉的能力,挑取其单菌落接种于含组氨酸的SC 培养基中,培养60h 后收集菌体,转接至含15%可溶性淀粉的YPS 培养基中,30℃振荡培养,定时取样,测A 510,酶活力及淀粉残余量.图5的结果显示,构建的酵母工程菌GRF18(pMA G 15)在47h 内可水解99%的淀粉,而且水解进程与酵母的生长和酶的生成是平行的.我们曾试过10%的马铃薯淀粉,发现培养50h 亦可将其中99%的淀粉水解掉.这一结果表明GRF18(pMA G 15)的淀粉水解能力比我们构建的含地衣杆菌α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶双基因的酿酒酵母GRF18(YEpMA G 27)要高得多.GRF18(YEpMA G 27)在含10%的马铃薯淀粉的YPS 培养基中需培养7d 才能水解97%的淀粉.图4 表达产物电泳分析1为标准分子量,2为GRF18(pBAL7),3为GRF18(pMA G69),4为GRF18(pMA G15)图5 酿酒酵母GRF18(pMA G 15)在YPS (含15%的可溶性淀粉)中生长、产酶及水解淀粉曲线图1为A 570,2为酶活,3为残余率214 酿酒酵母GRF18(pMAG 15)发酵淀粉产生酒精图6 酿酒酵母GRF18(pMA G 15)在YPS (含15%可溶性淀粉)中产生酒精曲线1为淀粉残余率,2为酒精含量为了考察构建的酵母工程菌能否将淀粉水解产物发酵产生酒精,将GRF18(pMA G 15)接种于含10%可溶性淀粉的YPS 培养基中,定时取样,按材料与方法中介绍的方法测定培养上清液中的酒精含量及淀粉残余量.图6是酿酒酵母GRF18(pMA G 15)水解淀粉和发酵产生酒精的进程.虽然酿酒酵母GRF18是实验室菌株不是酒精的生产菌,但从图上可以看到,构建的酵母工程菌在水解淀粉的同时还可发酵产生酒精,为构建能水解和利用淀粉生产酒精的酵母工程菌打下基础.54 中 国 科 学 (C 辑)第28卷215 重组质粒pMAG 15在酵母工程菌中的稳定性带2μ质粒的酵母转化子在无选择压力的情况下,经多代培养都会不同程度地产生质粒丢失的现象.为了检测来源于2μ的重组质粒pMA G 15在酵母转化子GRF18中的稳定性,挑取GRF18(pMA G 15)单菌落接种于YPD 液体培养基中,30℃连续培养5d 后,取样涂平板,分离单菌落,点种于缺亮氨酸的SC 选择培养基及YPD 完全培养基上,30℃培养2d.在YPD 培养基上生长而在SC 培养基上不能生长者即为丢失质粒的转化子.从表3的结果可知,重组质粒pMA G 15的丢失率为913%.表3 重组质粒pMA G 15在酿酒酵母GRF18中的稳定性转化子名称YPD 上总菌落数SC 上不长菌落数丢失率/%GRF 18(pBAL7)51624547.5GRF18(pMA G69)51614 2.7GRF18(pMA G15)516489.33 讨论本文报道将大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因引入酿酒酵母在P GK 启动子和转录终止信号的调控之下获得高表达;在本身信号肽的引导下,表达产物的99%分泌至胞外,构建的酿酒酵母工程菌GRF18(pMA G 15)在含15%淀粉的YPD 培养基中培养47h 将99%的淀粉水解.我们曾用地衣杆菌α2淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶基因构建表达载体转化酿酒酵母;获得的酵母工程菌GRF (YEpMA G 27)比仅含α2淀粉酶或葡萄糖淀粉酶单基因的工程菌的酶活力及淀粉水解率都高,但水解淀粉的速度慢[9].估计是由于这两种酶的性质特别是作用的温度(80℃,60℃)和p H (7,4.5)不同造成的.本文用大麦α2淀粉酶取代地衣杆菌α2淀粉酶取得良好的效果,淀粉水解时间从6d (10%淀粉)缩短至47h (15%淀粉).这与大麦α2淀粉酶的最适温度(68℃)和p H (5.2)与黑曲霉糖化酶的最适p H 和温度接近有关.在构建表达载体pMA G 15时,大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶基因的信号序列均未被除去.这2个酶都是靠本身的信号肽被引导至胞壁再分泌至胞外的.我们的工作已经证实,黑曲霉糖化酶信号肽切除位点的氨基酸残基与酵母信号肽切除位点的相同,因而能被酵母识别和加工[8].但大麦α2淀粉酶信号肽序列与酵母的不完全相同,却能高效表达和分泌,原因有待进一步研究.参 考 文 献1 Rothstain S J ,Lahners K N ,Lazarus C M ,et al.Synthesis and secretion of wheat α2amylase in S acharom vces cerevisiae .G ene ,1987,55:3532 Pretorius I S ,Laing E ,Pretorius G H J ,et al.Expression of a bacillus α2amylase gene in yeast.Current G enetics ,1988,14:13 Cole G E ,McCabe P L ,Inlow D ,et al.Stable expression of aspergillus awamori glucoamylase in distiller ’s yeast.Bio/Tech 2nology ,1988,6:417第1期罗进贤等:大麦α2淀粉酶和黑曲霉糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌55 56 中 国 科 学 (C 辑)第28卷4 Segoard M,Svenson B.Expression of cDNAs encoding barleyα2amylase1and2in yeast and characterization of the secreted proteins.G ene,1990,94:1735 Shibuya I,Tamura G,Shima H,et al.Construction of anα2amylase/glueoamylase fusion gene 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