科创-突变体鉴定
突变体库筛选方法优化及新技术开发论述
突变体库筛选方法优化及新技术开发论述摘要：突变体库筛选是基因工程中非常重要的一项技术，用于筛选出有特定变异的基因，以期望达到某种预期的功能改良。
本文将对突变体库筛选方法进行优化，探索一种新的技术开发，以提高筛选效率和准确性，并应用于基因工程领域。
1. 研究背景突变体库筛选是一项通过人工诱发基因突变，从大量基因变异体中筛选出具有特定变异的基因的技术。
它是基因工程中常用的一种方法，用于改良和创新有关基因功能的研究。
2. 传统的突变体库筛选方法传统的突变体库筛选方法主要通过构建突变体库、筛选出目标基因或表现出特定性状的突变体等步骤。
其中，突变体库的建立是基础，可以通过物理方法（如辐射）或化学方法（如EMS）诱导基因突变。
筛选过程主要是通过酶活性检测、表型筛选或基因定位等方法对突变体进行筛选和确认。
然而，这种方法存在着一些局限性，如效率低、耗时长和筛选过程的不确定性。
3. 突变体库筛选方法的优化为了提高突变体库筛选的效率和准确性，可以采用以下几种优化方法：1) 使用高通量技术：利用现代高通量测序和分析平台，可以快速鉴定突变体库中的突变位点，并对其进行定量和定位分析，从而加快筛选过程和提高准确性。
2) 引入新的筛选策略：结合转基因技术和现代生物学方法，可以开发新的筛选策略，例如逆向遗传筛选、基因编辑技术和CRISPR等，这些方法可以提高筛选效率和准确性，同时降低筛选成本。
3) 结合机器学习和人工智能：利用机器学习和人工智能技术，可以对突变体库中的大量数据进行分析和预测，通过算法模型的训练和应用，可以快速发现有潜力的突变体和指导后续的筛选工作。
4. 新技术开发：CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9基因编辑技术是近年来出现的一种新技术，在突变体库筛选中具有广阔的应用前景。
CRISPR-Cas9系统利用一种特殊的酶（Cas9）和一段特定的RNA序列（CRISPR）来识别和剪切基因组中的特定位点，通过对突变位点进行有针对性的编辑，可以实现对基因组的精确改变。
突变体鉴定
④ 4 ℃， 14000rpm离心8分钟。
⑤取上清至新的EP管中，加300 µl 三氯甲烷， 用手轻轻震荡20s。 ⑥4 ℃， 14000rpm离心8分钟。
⑦取上清至新的EP管中，加250µl异丙醇，混 匀，冰上20分钟。 ⑧4℃，12000rpm离心8分钟。
弃 上 清 ， 加 6 0 0 µl 7 5 % 的 乙 醇 ， 4℃ ， 12000rpm离心8分钟。 室温下干燥（一般干燥5—10分钟）后，加
（1）以所提的突变体和野生型植株的DNA为模板，以F、 R、LBb1为引物两两配对成3对引物对，进行PCR扩 增，20 µl反应体系如下： 10×Buffer 2 µl dNTP 0.4µl 引物 0.4µl 模板 1µl Taq 酶 0.2µl 蒸馏水 16µl （2）PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及分析。将PCR产物 中加入loading buffer，琼脂糖凝胶电泳，成像。 （3）根据电泳条带的分布与数目，初步判断突变体的 纯杂性
2.PCR鉴定突变体纯合体、杂合体
批注：＋表示有条带，－无条带
结果与分析
• 根据PCR鉴定凝胶电泳的成像图，分析材 料中突变体植株的纯、杂合性。
实验原理
• T-DNA插入到植物染色体上的什么位置以及 怎样插入都是随机的。外源DNA插入到目的 基因后，引起该目的基因的核苷酸组成成 分发生变化。三引物法PCR（F、R、LBb1) 鉴定突变体植株的T-DNA整合的纯、杂合性。
• 材料和试剂
野生型拟南芥、T -DNA插入突变体植株。 液氮、 无水乙醇、 酚氯仿溶液、三氯甲A突变体的鉴定
T-DNA突变体的鉴定 T-DNA突变体的鉴定
• 实验目的 • 实验目的 1、了解植物DNA的提
1、了解植物DNA的提取。 取。 2、掌握T-DNA插入突变体中纯合体、杂合 2、掌握T-DNA插入突 体的鉴定方法。 变体中纯合体、杂合
基因突变检测技术简介
基因突变检测技术简介基因突变检测技术是一种用于检测个体基因组中突变的方法。
基因突变是指基因序列发生的变异，可分为点突变、插入和缺失等多种类型。
这些突变可能与遗传性疾病、癌症等疾病的发生有关。
基因突变检测技术的发展，为疾病治疗和预防提供了重要依据。
现今，基因突变检测技术主要应用在两个领域：遗传病筛查和肿瘤突变检测。
在遗传病筛查中，基因突变检测技术广泛应用于新生儿筛查和遗传咨询。
新生儿筛查旨在在婴儿出生后尽早发现可治疗的遗传病。
通过分析婴儿的基因组，可以及早识别出导致遗传性疾病的突变基因，从而及时采取干预措施。
遗传咨询是指向具备遗传病风险的个体提供遗传咨询，帮助他们了解潜在风险，并制定适当的生育计划和预防措施。
基因突变检测技术可通过对个体基因组进行测序，发现其中存在的潜在疾病风险基因，从而提供个性化的遗传咨询。
在肿瘤突变检测领域，基因突变检测技术具有重要的意义。
肿瘤是基因突变导致的一类疾病，通过检测肿瘤细胞中的突变基因，可以实现肿瘤的早期诊断、分型、分级以及预后评估。
同时，肿瘤突变检测还可以指导个体化治疗的选择。
以肺癌为例，肺癌患者的基因突变情况会影响对特定药物的敏感性，通过检测突变基因，可以选择最有效的药物治疗方案，提高治疗效果。
目前，常用的基因突变检测技术包括PCR、Sanger测序、下一代测序（NGS）等。
PCR（聚合酶链式反应）技术是一种高度敏感的突变检测方法。
利用PCR技术可以扩增目标基因或特定片段，通过检测扩增产物的变异位点，确定是否存在突变。
PCR技术具有高度特异性和敏感性的优点，广泛应用于突变的快速检测。
Sanger测序是一种经典且广泛应用的突变检测技术。
该技术通过测序反应逐个回顾目标片段的碱基序列。
当一个碱基被修饰时，会生成特定的信号，从而识别突变位点。
Sanger测序技术具有较高的准确性和可靠性，是突变检测的金标准技术。
下一代测序（NGS）是一种高通量测序技术，已逐渐成为基因突变检测的主流技术。
基因组突变的检测方法
基因组突变的检测方法随着生物技术和医学研究的迅速发展，基因组突变相关的研究越来越受到关注，因为基因组突变在某些疾病的发生中起着关键作用。
然而，检测基因组突变的方法存在困难，因为基因组大小较大，所含基因比较复杂。
在本文中，我们将探讨几种基因组突变的检测方法。
一、PCR扩增法PCR扩增法是目前最常用的基因组突变检测方法之一。
PCR扩增利用DNA聚合酶复制目标DNA序列，从而扩增出足够数量的生成物进行检测。
PCR扩增法有高灵敏度，可检测极小浓度的突变。
但是，由于PCR扩增法基于模板DNA，这种方法不适合检测新突变或大规模基因组突变。
二、Southern blotting法Southern blotting法利用电泳将DNA分离到一个凝胶中，然后将DNA传输到一个固体支持的膜中。
随后，在膜上通过亲体结合，将DNA变成可以检测的形式。
Southern blotting法通常用来检测从基因组DNA中特别选出的单一基因的缺陷。
三、序列特异性引物扩增法序列特异性引物扩增法是一种基于PCR扩增法的方法。
不同的是，序列特异性引物扩增法使用特异性引物对目标突变进行扩增。
这种方法使用引物的特异性将其绑定到目标DNA的位置，再进行扩增检测。
这种方法可检测最常见的核苷酸突变和小片段的缺失和插入。
四、二代测序法二代测序法是一种先进的技术，可用于检测某个个体的全基因组、外显子组等。
有了二代测序技术，我们能够对个体的突变、多态性和复杂的基因组变异进行更彻底的检测，从而检测出更多的突变位点。
五、杂合性突变分析法杂合性突变分析法是一种特殊的PCR扩增技术，可用于检测无需基于模板DNA的新突变。
这种方法利用不同标签的突变位点DNA扩增，从而识别新突变。
杂合性突变分析法对杂合性突变和新位点突变的检测十分有效，但需要临床验证。
总结选择何种检测方法应取决于所需要检测的突变类型以及检测平台的可用性和成本。
我们对五种基因组突变的检测方法进行了介绍，这些方法都有一定的优缺点。
突变体筛选与鉴定方法
突变体筛选与鉴定方法近年来，基因编辑技术的发展使得我们能够更加准确地对生物进行基因改造和操作。
而基因编辑的核心工具——CRISPR/Cas9系统，也成为目前最受欢迎的基因编辑技术之一。
但是，伴随着CRISPR/Cas9系统的应用越来越广泛，也带来了突变体筛选与鉴定方法的挑战。
在这篇文章中，我们将介绍突变体的鉴定方法，探讨如何准确地筛选出想要的突变体。
一、突变体筛选的背景突变体筛选是在进行基因编辑后，判断目标基因是否得到改变，验证是否成功。
突变体最直接的改变是单核苷酸多态性（SNP），也就是一种点突变。
此外，还有DNA脱失、插入、替换等多种突变体现象。
然而，由于CRISPR/Cas9系统的特殊性质，突变体筛选方法也有所不同。
相对于传统的突变体筛选方法，CRISPR/Cas9系统可以在细胞中直接用“选育”方式来筛选突变体。
这意味着，只有在目标基因的两端都进行了编辑后，才会得到突变体。
因此，在突变体筛选中，需要一个敏感而具体的方法来判断编辑效果。
二、常见的突变体筛选方法1.聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种快速而常见的DNA扩增技术，也被广泛地应用在突变体筛选中。
PCR可以扩增目标DNA序列，同时提供更多DNA模板来进行下一步的筛选。
PCR筛选通常需要根据目标基因的DNA序列设计引物并扩增目标DNA区域。
这样，分子生物学家就可以快速获得所需的更多模板，在下一步中用于DNA测序和鉴别。
2. T7E1酶切T7E1酶切是基于遇到不匹配DNA（也就是突变！）时，酶会将不匹配的DNA切成两段。
在CRISPR/Cas9系统中，T7E1酶可以用于分析基因组的不匹配区域，并通过Gel切胶和测序鉴定SNP的存在。
3.限制性片段长度多态性（RFLP）RFLP是利用遗传变异在各个基因组区域间的差别，通过酶切不同碱基产生的限制酶切位点差异，从而实现区分人群，确定DNA指纹或植物品种鉴定信息的方法。
这种筛选方法需要在基因组中筛选适合的酶切位点，并使用RFLP分析盒进行限定性酶切，以确定序列到位。
突变体的筛选和评价方法
突变体的筛选和评价方法突变是基因组的一种常见现象，突变可以是自然发生的，也可以是由环境因素引起的。
突变可以导致基因组的结构和功能出现重大变化，从而影响生物个体的生存和繁殖。
突变体的筛选和评价是生物学研究中非常重要的步骤。
下面将从基本概念、筛选方法和评价方法三个方面进行讨论。
一、基本概念所谓突变体，是指基因或染色体在自然环境或人工处理下出现的一种或多种变化。
突变体通常与野生型相比，表现出一些新的性状，包括代谢、生长、发育、生殖等方面的改变。
这些变化可以用于生物育种、污染监测、环境毒性评价、分子修饰等领域。
突变体的筛选和评价通常涉及到以下几个方面的问题：1. 筛选出突变体：如何选择或设计合适的筛选条件，从复杂的基因组变异现象中筛选出有意义的变异类型。
2. 突变体的鉴定与分类：如何根据遗传特征、分子结构等特点，对筛选出来的突变体进行鉴定和分类。
3. 突变体的功能评价：如何通过基因表达、代谢代谢产物、生理生化指标等方面的测定，评价突变体在生物学各方面的功能变化，从而为应用提供理论依据。
二、筛选方法突变体的筛选通常是通过人工设计或自然筛选的方式来实现的。
下面介绍几种常用的筛选方法：1. 微生物筛选微生物筛选是目前最常用的筛选方法之一。
其中最常用的方法是在培养基中添加突变源和需要鉴定的物质，筛选出突变株生长或代谢性能改善的菌株。
利用此法，已经筛选出了许多能够高效生产酶、生物柴油等物质的菌株。
2. 生长筛选生长筛选方法是将突变株和野生型放在同一环境中，通过比较生长速度、形态、生理特征等指标来鉴定和筛选突变株。
生长筛选方法最常用于植物和细胞的研究中。
3. 身体表型筛选身体表型筛选是指通过比较突变体和野生型在形态、生理、生化代谢等方面的差异，来鉴定和筛选突变体。
例如，通过对荔枝果实表型特征的比较，可以鉴定出野生型与浅色肉品种间对比浓色肉品种等突变体。
三、评价方法突变体的评价方法通常包括以下几个方面的内容：1. 分子鉴定方法分子鉴定方法是目前最常用的方法之一。
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。
人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。
对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。
多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。
其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。
下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。
PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。
其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。
由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。
用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。
应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。
Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。
突变体筛选与功能鉴定
突变体筛选与功能鉴定随着科学技术的不断发展，突变体筛选与功能鉴定成为生物学领域中的重要研究方向之一。
突变体是指在生物体基因组中发生突变或变异的个体，通过筛选与鉴定这些突变体，我们可以深入研究基因功能和生物体的遗传特性。
一、突变体筛选方法突变体筛选主要有两种常用方法：自然突变体筛选和人工突变体筛选。
1. 自然突变体筛选自然突变体是在自然界中诞生的突变体，它们不是由人为诱导的突变。
自然突变体筛选方法主要包括观察、筛选和定位。
观察：通过对大量生物体进行观察，发现具有特定性状变化的个体。
筛选：根据特定性状进行筛选，从大量个体中挑选出表现突变性状的个体。
定位：确定突变基因的位置，找出突变体在基因组中的具体位置，并进行基因测序。
2. 人工突变体筛选人工突变体是通过人为手段诱导的突变，常用的诱导方法包括化学诱变剂和突变基因工具。
化学诱变剂：通过给生物体暴露在化学物质中，使生物体的DNA 发生突变。
常用的化学诱变剂包括EMS（剧毒亚硝酸甲酯）和ENU （乙基甲烷磺酸酯）等。
突变基因工具：利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，通过设计特定的引物和酶切酶，引导Cas9蛋白靶向性地编辑目标基因，导致基因发生突变。
二、突变体功能鉴定突变体筛选后，对于突变基因的功能进行鉴定是非常重要的。
常用的突变体功能鉴定方法主要有：1. 表型分析通过观察突变体在形态结构、生理生化等方面的差异，来分析突变体的表型变化，进而推测突变基因的功能。
2. 基因表达分析通过比较野生型和突变体基因的表达差异，来研究突变基因在转录水平上的功能变化。
常用的基因表达分析方法包括RT-PCR、实时荧光定量PCR等。
3. 蛋白质互作分析突变体功能鉴定还可以采用蛋白质互作分析的方法，来研究突变基因在蛋白质水平上的功能。
常用的蛋白质互作分析方法包括酵母双杂交法、质谱分析等。
4. 代谢途径鉴定通过分析突变体代谢物的变化，来研究突变基因在代谢途径上的功能。
常用的代谢途径鉴定方法包括代谢物分析、代谢组学等。
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项目编号东北农业大学大学生科技创新基金申请书项目名称：拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540的突变体鉴定项目主持人：李松所在学院：生命科学学院研究起止时间：2008年11月1日至2009年11月1日东北农业大学教务处制项目名称拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540的突变体鉴定研究起止时间2008.11~2009.11 申请金额1000元项目主持人姓名李松学号A09060068所在学院生命科学学院所学专业生物技术学生类别二年级年级班级生物技术指导教师（1）姓名才华职称讲师所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程指导教师（2）姓名纪巍职称助教所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程项目组成员姓名刘维学号A0960072 专业班级生技062 姓名肖松学号A09060086 专业班级生技062 姓名王鹏姬学号A09060080 专业班级生技062 姓名卢清瑶学号A09060073 专业班级生技062一、项研究的目的意义、国内外研究概况、主要创新之处1．研究的目的意义基因功能的主要研究方法包括：(1)克隆相关基因，进行异体超表达研究(Meyer 等2000，2004；Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变技术，获得目的基因敲出突变体(Bouche 和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)，再通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能(Meyer等2004)。
与前者相比，后者具有许多优势(Meyer 等2004)，已成为反向遗传学研究的主要手段(Bouche和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)。
bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中，是植物中一类很大的转录因子家族，在拟南芥中就有75个家族成员，在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中起到重要的作用。
本研究利用已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。
本研究可为利用突变体进行功能互补研究AtbZIP1基因的功能提供突变体材料，进而为研究AtbZIP1转录因子在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中所起的作用奠定基础。
2．国内外研究概况1)突变体鉴定的方法的研究现状反向遗传学研究的首要条件是获得大量基因敲除突变体，建立一套快速、可靠的T-DNA插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重要。
目前，鉴定方法主要有2种(/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物法”。
“三引物法”的原理如图1 所示，即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR 扩增。
野生型植株(wild type, WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR 产物仅有1 种，分子量即从LP到RP的大小; 纯合突变体植株(homozygous lines, HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入，而T-DNA 本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物，分子量即从LP 或RP 到T-DNA 插入位点的片段的长度再加上从LB 到T-DNA载体左边界的片段的长度;杂合突变体植株(heterozygous lines, HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA 插入，所以PCR 扩增后可同时得到两种产物(如图1所示)。
图1. “三引物法”鉴定突变体的原理(/tdnaprimers.html) a: T-DNA 插入目的基因编码序列的方式、位置以及PCR 鉴定反应所需引物。
LP、RP：与目的基因片段互补的特异引物；插入T-DNA 片段的特异引物；N：T-DNA 的实际插入位点与侧翼序列之间的距离(通常为0~300 bp)。
b：3 种可能的基因型植株PCR 产物的差异。
WT ：野生型植株；HZ ：杂合突变体植株；HM ：纯合突变体植株。
2)AtbZIP1转录因子的研究进展在对植物逆境信号传导的研究中发现，转录因子是一个很关键的因素，在胁迫刺激下它们不断合成，并将信号传递和放大，调控下游基因的表达，从而引起植物生理生化的改变。
bZIP类转录因子是植物中比较重要的转录因子家族，参与众多的生理生化反应。
而最近发现，其在植物抗非生物胁迫反应中也起到一定的作用。
植物体内存在大量的转录因子，拟南芥(Arabidopsis thaliana)中就有5.6%的基因是编码转录因子的。
典型的转录因子含有DNA结合区(DNA-binding domain)、转录激活区(activation domain)、寡聚化位点(oligomerization site)以及核定位信号区(nuclear localization signal)等4个主要的功能区域，这些功能区域决定转录因子的功能和特性。
根据转录因子表达的特点可以将其分为两类，一类是组成型转录因子，无论在逆境还是正常状况下基因都表达。
另一类是诱导型转录因子，只有在逆境下基因才会表达，绝大部分的转录因子都是这种自身的反馈调节。
bZIP类转录因子是植物中一类很大的转录因子家族，其共同特点是：含有与特异DNA序列相结合的碱性结构域；参与寡聚化作用的亮氨酸拉链区与碱性区紧密相连；转录因子的N-末端含有酸性激活区；以二聚体形式结合DNA，肽链N-末端的碱性区与DNA直接结合。
bZIP类转录因子中有两类成员和植物非生物胁迫应答密切相关，一类是TGA/OBF 蛋白，D-亚家族的成员。
它们可以结合到as-1/ocs 类顺式元件上，在植物非生物胁迫应答及发育中起重要作用。
另一类转录因子是ABF/ABRE蛋白，A-亚家族的大多数成员属于此类蛋白。
该类转录因子可以识别ABRE类顺式作用元件（CACGTG），在盐胁迫和干旱胁迫中起重要作用[7]。
利用酵母单杂交的方法从拟南芥中分离出逆境诱导的4种bZIP蛋白，属于ABRE 结合因子（ABRE binding factors，ABFs）/ABRE结合蛋白（ABA-responsive element binding, AREB），分别是ABF1、ABF2/AREB1、ABF3和ABF4/AREB2。
在干旱、盐胁迫和ABA处理条件下这4种转录因子大量表达，诱导ABA的过敏感以及其他表现型，使植物体内的糖积累，内源ABA 合成，耐盐和耐旱等诸多抗性相关基因的表达增强。
参考文献[1]陈丽. (1999) 植物转录因子的结构与功能. 植物生理学通讯, 33:401~409.[2]Yamaguchi S K, Shinozaki K. (1994) A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsivenessto drought, low-temperature or high-salt stress. Plant Cell, 6:251~264.[3]Liu Qiang, Zhang Gui-You, Chen Shou-Yi. (2001) Structure and regulatory function of plant transcription factors.Chinese Science Bulletin, 46(4):271～278.[4]Liu L, White MJ, MacRae TH. (1999) Transcription factors and their genes in higher plantsfunctional domains, evolution and regulation. Eur J Biochem, 262:247~257.3.创新点1）利用“三引物法”对拟南芥突变体进行插入T-DNA纯合鉴定；2）通过RT-PCR在转录水平上进一步鉴定突变体。
二、项目主要研究内容、目标与技术经济指标1．项目主要研究内容本研究利用植物生物工程研究室已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。
2．目标与主要技术经济指标（1）建立一套通用的植物突变体鉴定的方法；（2）获得AtbZIP1基因的拟南芥插入纯合突变体10株；（3）发表学术论文1篇。
三、项目研究方法与技术路线1． 项目研究方法（1） 种植拟南芥突变体；（2） 提取拟南芥的DNA ，利用“三引物法”鉴定插入纯合；（3） 提取拟南芥的RNA ，消除基因组DNA ；（4） 对提取得拟南芥RNA 进行反转录；（5） 用RT-PCR 鉴定AtbZIP1基因是否表达。
2． 技术路线四、项目前期研究基础、实验条件1．项目前期研究基础 本研究所依托的植物生物工程研究室长期从事植物基因工程的研究，近五年完成和在研科研项目19项，其中“973”前期、“948”项目和国家转基因专项和国家自然科学基金等。
研究室具有丰富的研究经验和基因资源。
本研究已购买了拟南芥突变体，为实验的进行提供了研究材料。
本组成员由于对科学研究的共同爱好自由组合。
目前已完成大学一年的学习任务；掌握了有关的基础知识；在课下学习了基因工程的有关理论知识；阅读了有关基因工程和植物生理相关拟南芥突变体种植确认拟南芥突变体“三引物法”鉴定纯合体 拟南芥DNA 提取 拟南芥RNA 提取“三引物法”鉴定插入 RNA 反转录RT-PCR 鉴定的书籍；查阅了关于突变体鉴定的相关文献，及PCR和RT-PCR的相关实验技术资料。
在实验能力方面，通过大一一年的实验课的训练，已掌握了基本的实验技能；课下学习了植物基因组DNA, RNA 提取以及PCR检测的实验及方法，能够独立进行研究中的有关操作。
2．实验条件本研究所依托的植物生物工程研究室建立了植物基因组DNA, RNA 提取以及PCR 检测平台，并拥有大量分子生物学研究的仪器设备。
五、经费预算（实验材料费、资料费等）1．实验材料费植物材料处理费200元PCR 引物合成费200元2．仪器使用费使用食品中心开放实验室仪器，仪器使用费600元申请经费总额1000元。
六、年度研究计划及预期进展2008年11月~2009年1月（1）拟南芥突变体的种植（2）拟南芥基因组DNA的提取2009年2月（1）“三引物法”鉴定插入纯合的PCR反应体系及条件探讨（2）利用“三引物法”鉴定纯合体（3）对纯合体进行T-DNA插入鉴定2009年3月~2009年5月（1）拟南芥总RNA的提取（2）拟南芥总RNA的反转录2009年6月~2009年7月（1）拟南芥内参基因RT-PCR（2）A tbZIP1基因At5g49540的反转录PCR鉴定（3）分析整理数据。