高产纤溶酶菌株的筛选及鉴定 (1)
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高产纤溶酶菌株的筛选及鉴定
作者：林芬， 谢和， 姚玉萍， 张仁正， LIN Fen， XIE He， YAO Yu-ping， ZHANG Ren-zheng 作者单位：贵州大学生命科学学院,贵州,贵阳,550025
刊名：
贵州农业科学
英文刊名：GUIZHOU AGRICULTURAL SCIENCES
年，卷(期)：2010,38(6)
被引用次数：1次
参考文献(9条)
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本文读者也读过(10条)
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3.隋玉杰.黄颖.曹岩.郑永晨纤溶酶产生菌的分离筛选与鉴定[期刊论文]-中国实验诊断学2009,13(8)
4.王开敏.赵敏.Wang Kaimin.Zhao Min产纤溶酶菌株的分离和鉴定及纤溶酶基因在酿酒酵母中的表达[期刊论文]-中国食品学报2009,9(2)
5.费尚芬.张萍萍.李宝库.张晓妍.FEI Shang-fen.ZHANG Ping-ping.LI Bao-ku.ZHANG Xiao-yan产纤溶酶菌株的发酵条件优化[期刊论文]-河北大学学报（自然科学版）2006,26(3)
6.刘慧娟.郭晓军.郭妍妍.朱宝成.LIU Hui-juan.GUO Xiao-jun.GUO Yan-yan.ZHU Bao-cheng假蕈状芽孢杆菌
34kDa纤溶酶成熟肽基因的原核表达、纯化及活性分析[期刊论文]-华北农学报2011,26(2)
7.吴思方.向梅.王伟平.杨荆树豆豉纤溶酶产生菌的筛选及菌种鉴定[期刊论文]-湖北工学院学报2004,19(6)
8.陈慧珍.梁秀霞.邱鹏新.陈家树.CHEN Hui-zhen.LIANG Xiu-xia.QIU Peng-xin.CHEN Jia-shu缅甸蝰蛇毒纤溶酶FⅡaa的分离及生物活性[期刊论文]-中山大学学报（医学科学版）2010,31(4)
9.朱春节.汤祝华.谢秀祯一株新的豆豉纤溶酶产生菌的研究[期刊论文]-基因组学与应用生物学2011,30(1)
10.张杏泉.范清宇.王成琪.张惠中.裘秀春组织型纤溶酶原激活物cDNA克隆及其真核表达载体的构建[期刊论文]-第四军医大学学报1999,20(12)
引证文献(1条)
1.张雪琴.康冀川.文庭池.何劲.雷帮星一株来自蚯蚓的产纤溶酶蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus的筛选及鉴定[期刊论文]-微生物学通报 2011(6)
引用本文格式：林芬.谢和.姚玉萍.张仁正.LIN Fen.XIE He.YAO Yu-ping.ZHANG Ren-zheng高产纤溶酶菌株的筛选及鉴定[期刊论文]-贵州农业科学 2010(6)
微生物的诱变育种
微生物的诱变育种 作者：佚名来源：生物秀时间：2008-4-18 实验仪器大全实验试剂大全 一、实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。 内容：1．对米曲霉(Aspergills oryzae )出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2．用紫外线进行诱变处理。 3．用平板透明圈法进行两次初筛。 4．用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、实验材料和用具 米曲霉斜面菌种； 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白； 三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、操作步骤 (一)出发菌株的选择及菌悬液制备 1．出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2. 菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中，30℃培养3～5d 活化。然后孢子洗至装有1mL 0.lmol/L pH6.0 的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜)，30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成把子悬液，调其浓度为106～108 个/mL，冷冻保藏备用。 (二)诱变处理 用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。 1．紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1～2h 然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。 2．稀释菌悬液按10 倍稀释至10-6，从10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。 (三)优良菌株的筛选 1. 初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40～50 个，作为复筛菌株。 2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8 等份，1～7 份中点种初筛菌株，第8 份点种原始菌株，作为对照。培养48h 后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进大摇瓶复筛阶段。3．摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦秩85g，
_大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选
第33卷第2期2014年 4月 大豆科学SOYBEAN SCIENCE Vol．33No．2Apr． 2014 大豆根瘤菌剂载体的选择及最佳施用浓度筛选 刘庆莉1，王金生1，刘丽君1，林蔚刚1，王红蕾2，张俐俐3，吴俊江 1 （1．黑龙江省农业科学院大豆研究所，黑龙江哈尔滨150086；2．黑龙江省农业科学院信息中心，黑龙江哈尔滨150086；3．黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086） 摘要：为筛选出适宜根瘤菌吸附且能促进大豆生长、提高产量的优质载体，并且在优质载体的条件下，筛选出大豆 根瘤菌液的最佳使用浓度，通过3种载体吸附不同浓度根瘤菌液拌种大豆盆栽播种后，对大豆的生物量、结瘤及产量的对比发现：不同载体介入、大豆接入根瘤菌后均对大豆的生物量及结瘤产生一定的促进作用。根瘤菌以草炭和蛭石为载体，更有利于促使大豆植株生长，积累更多的干物质；草炭的促进结瘤作用持续效果时间较长，液体的持续效果时间最短，而蛭石的持续效果时间相对比较居中；以草炭和蛭石作为根瘤菌载体，低浓度的根瘤菌液接入更能发挥其提高产量的作用，以液体作为根瘤菌载体，根瘤菌接入浓度较高才能发挥其提高产量的作用。结合生产成本来看， 草炭土更适宜作为自主研发根瘤菌剂的载体，同时推荐根瘤菌使用浓度为1．4?108 菌细胞 ·mL －1。关键词：大豆根瘤菌；结瘤；载体 中图分类号：S565．1文献标识码：A 文章编号：1000- 9841（2014）02-0207-04收稿日期：2013-10-11基金项目：国家“十二五”科技支撑计划（2012BAD14B06）；现代农业产业技术体系（CAＲS-004）；黑龙江省自然科学基金（C201104）；哈尔滨市科技创新人才研究专项资金（2013ＲFXYJ043）。 第一作者简介：刘庆莉（1971-），女，技师，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：liuqingli1971@126．com 。通讯作者：吴俊江（1970-），男，博士， 研究员，主要从事大豆耕作与栽培研究。E-mail ：nkywujj@163．com 。Chosen of Soybean Ｒhizobia Carrier and Screening of the Best Concentration LIU Qing-li 1，WANG Jin-sheng 1，LIU Li-jun 1，LIN Wei-gang 1，WANG Hong-lei 2，ZHANG Li-li 3，WU Jun-jiang 1 （1．Soybean Ｒesearch Institute ，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；2．Information Center of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ；3．Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences ，Harbin 150086，China ） Abstract ：In order to screen the carrier that was more appropriate for the absorption of rhizobia ，improving yield and quality of inoculated soybean ，and screen the best soybean rhizobia bacterial concentration at levels of quality carrier ，three carriers ab-sorbed different soybean rhizobia bacterial concentration with seed dressing were performed according to the biomass ，nodular rate and yields of soybean plant by soil pot experiments．The results showed that different carriers and inoculating soybean rhi-zobia could improve the biomass and nodular rate of soybean plant．Peat and vermiculite were used as carriers of rhizobia could remarkably promote the growth of soybean plant and enhance dry matter accumulation ；thus the lasting effect of nodular was the longest ，followed by vermiculite and liquid．Low level bacterial concentration could remarkably increased soybean yield and quality with peat and vermiculite as carriers ，however the opposite when used liquid as carriers．In conclusion ，in view of the cost ，peat was more appropriate for soybean rhizobia ，and the best bacterial concentration was 1．4?108 cells ·mL －1．Key words ：Soybean rhizobia ；Nodulation ；Carrier 施用根瘤菌菌剂能促进大豆结瘤， 有效提高豆科植物的产量，减少生产中的化肥使用量，降低生产成本，而且可以提高土壤肥力，同时，由于根瘤菌剂耐污染能力强［1］ ，还可以减少因长期使用化肥对 环境的破坏 ［2-3］ ，对无公害大豆生产以及降低农民 投人， 保护环境等具有十分重要的作用［4-5］ 。因此 引起了人们的极大兴趣和广泛关注，已成为豆科植 物增产的主要研究方向。 近年来随着新技术特别是分子生物学技术的发展，各种高效菌种不断被选育或改造，制备菌剂的工艺、保藏菌剂的方法也不断完善和发展，配制成的菌剂的效果越来越好，在农业生产中得到了广泛利用。与此同时，诸如发酵水平低、保质期短和 技术不成熟、质量不过关等问题限制了根瘤菌剂的产业化和大面积推广应用。其中，菌种质量的高低一直是影响其应用效果的一个突出问题；载体也是大豆根瘤菌肥料质量控制的一个关键因素 ［6］ 。作 为根瘤菌的载体很多， 如草炭、蛭石、珍珠岩、煤炭、草炭、膨润土和高岭土等。草炭、蛭石由于其营养与pH 适中，表面积比较大和吸附性好，有利于根瘤菌的存活及菌剂保存，是理想的载体 ［7-9］ 。另外，草 炭和蛭石等资源丰富，价格低廉，适合于在根瘤菌剂生产中应用推广，已成为当代根瘤菌类肥料的主要类型。 本文的研究目的是筛选出适宜根瘤菌吸附且接种大豆能促进大豆生长、提高产量的优质载体，
青霉素高产菌株的理性筛选
遗传育种与生物合成 文章编号:1001-8689(2007)07-0403-02 青霉素高产菌株的理性筛选 娄忻 张莉 刘靓 张玉莲 陈丽华 刘静 贺建功 (华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心, 石家庄050015) 摘要: 以青霉素生产菌种87117#为出发菌种,采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法,结合限氧条件下的摇瓶筛选,从177支前体抗性株中筛出XY -137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8.8%,且遗传特性稳定,单位菌丝产物合成能力强。XY -137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证,其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。 关键词: 紫外诱变; 动态后处理; 理性筛选; 青霉素高产菌株中图分类号:T Q 465.1 文献标识码:A Rational screening of penicillin high producing strain Lo u Xin, Zhang Li, Liu Liang, Zhang Yu-lian, Chen Li-hua, Liu Jing and H e Jian-g ong (N ew Dr ug R&D Co.,L td of N or th China Phar macentical Co rp., N ational Eng ineering Resear ch Center of M icro bial M edicine , Shijiazhuang 050015) ABSTRACT U sing Penicillium chry sogenum #87117as starting strain ,a penicillin high yield str ain #XY-137w as obtained by U V irr adiation com bined w ith precurso r-resistant strain in shake flask selection metho d under lim ited o xyg en.Penicillin potency of strain #XY-137w as increased by 8.8%cultured in shaking flasks.Average pr oductivity o f about 100batches ferm entation level w as increased by 2.69%～5.66%than that of strain #87117in 100-ton ferm entor . KEY WORDS U V m utagenesis; Dynamic po st-treatment; Rational screening ; Penicillin high-pr oducing strain 收稿日期:2007-03-15 修回日期:2007-05-08 作者简介:娄忻,女,生于1963年,高级工程师。主要从事微生物药物产生菌的遗传育种研究。 由于青霉素原料的后加工与半合成领域愈来愈广泛,世界青霉素市场竞争十分激烈。生产厂家唯有不断地提高生产水平,降低生产成本以增强企业的竞争力,而优质高产菌种的选育和应用是其中的基础和关键。 随着青霉素菌种生产能力的提高,传统育种方法的局限性越来越明显。理性化筛选是应用遗传学和生物化学的原理,根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构,设计筛选方法,定向选出有效的性状突变株。我们依据理性育种的理念,参照现有生产条件设立基本筛选模型,采用紫外辐射震动工业生产菌种稳定的遗传结构,再辅以限氧条件下耐前体突变株的筛选,达到选育高产菌株的目的。1 材料与方法1.1 出发菌种 青霉素生产菌种P enicillium chry sogenum 87117#。 1.2 培养基 (1)分离及斜面培养基 蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl 、CaSO 4、微量元素、琼脂。(2)种子培养基 以蔗糖、玉米浆为碳、氮源。 (3)发酵培养基 以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源,加无机盐类组成。1.3 菌种诱变与筛选 (1)紫外诱变 将出发菌株的单孢子悬液置紫外灯下40cm 处照射90s 。 (2)前体动态后处理 定量吸取经过紫外线照射后的孢子液,分别加入含有不同剂量的前体(苯乙酸胺)的种子培养基试管中,使每支试管的前体终浓度在0～4.8%之间。将上述试管置25℃恒温振荡培养18h 左右,然后稀释分离在固体培养基平板上。 (3)前体抗性菌落检出 平板置25℃恒温培养 ? 403?中国抗生素杂志2007年7月第32卷第7期
利用不同的方法筛选和鉴定转化子
生物工程上游技术实验综合实验设计 利用不同的方法筛选和鉴定转化子 生命科学学院 生工121 指导老师: 田长恩、周玉萍 摘要 本次实验我们小组通过含Amp的培养基初步筛选出转化子、菌落直接PCR、摇菌培养观察细菌表达形态等一系列实验方法，从6个转化子中筛选出了2个目的重组子.，从而达到实
验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。 关键词 筛选、菌落直接PCR、摇菌培养、电泳 引言 在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，摇菌培养观察菌株表达形态。 通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。 通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP荧光蛋白。 三、使用仪器、材料 1、材料：实验九准备好的菌株。 2、实验仪器及设备:PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。 3、主要试剂：10×PCR buffer 、dNTP mixture 、前向引物(P1) 、反向引物r(P2) 、 rTaq 酶、灭菌蒸馏水、LB液体培养基： 四、实验步骤 1、转化子筛选：在实验九含有Amp的筛选培养基中长出的菌落中挑选出6个白色单菌 落，并做好标记，这6个单菌落即为转化子。 2、菌落直接PCR：用无菌牙签把6个白色单菌落，先在编好号的6支PCR反应管中的 底部分别涂擦，然后在PCR管中配制60μL反应体系.并按每管9μL分装好反应体系。反应体系如下: DNA template buffer （用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹） 10×PCR buffer 6μL
(完整word版)菌种筛选方法
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化 反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图5.6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。 4) 生长圈法利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。
自生固氮菌微生物的筛选与生物学特征的研究1
自生固氮菌微生物的筛选与生物学特征的研究 引言 氮元素是农作物生长必不可少的一种元素，而它作为农肥的主要成分之一，能提高农作物产量，使作物在贫瘠的土壤上也能获得丰硕的成果。然而，工业固氮的成功使得人们忽略了原本更加天然的固氮方式-使用固氮菌。在全球人口呈现爆炸上升趋势的同时，人们需要。农业生产提供大量的粮食以满足温饱，这就导致工业固氮产业的蓬勃发展。但谁也没想到大量使用氮肥正威胁着人类赖以生存的地球环境：高浓度的氮氧化物是产生颗粒物和地面大气臭氧的重要原因。红潮等的多次出现，杀死数以万计的鱼类，都是由于许多农作土壤也呈氮肥饱和趋势，多余的活性氮肥都被排进湖海之中，最终导致富营养化。 为了达到科学而且环保的目的，只有利用固氮生物进行绿色氮肥的生产，这样不仅可以节省生产氮肥的成本而且还不会造成活性氮流失事实上，许多试验都证明在某些环境状态下，接种的固氮菌对植物田有很大的帮助作用，这是由于固氮菌能在常温常压条件下，通过其体内固氮酶的作用，把空气中的氮固定下来形成氨，进一步变成植物可利用的氨素，从而让土壤中固定的氮元素增加，本实验主要是对自生固氮菌的筛选以及其生物学特征的研究。 1.材料和方法 1.1无氮培养基（富集培养）配方： 葡萄糖10克磷酸二氢钾0.2克硫酸镁0.2克 硫酸钙0.2克氯化钠0.2克碳酸钙 5.0克 琼脂20克蒸馏水1000mL PH 6,5—7..0 瓦克斯曼77号培养基（分离培养） 葡萄糖10克磷酸二氢钾0.5克MgSO4.7H2O 0.2克 1%MnSO4.4H2O溶液2滴1%FeCl3溶液2滴 蒸馏水1000mL 琼脂20克PH 7.0—7.2 1.2自生固氮菌的生态分布 1.2.1土样采集：选定肥沃菜园土采集土样时，先铲去1-4厘米的部分，去5-10厘米深层土样，记录采集土样的时间地点和日期，带回实验室备用。 1.2.2土样备用：将采集的土样放入28摄氏度恒温箱中，不仅可以活化菌，而且还可以干燥土壤，便于土样播撒。 1.2.3自生固氮菌的分离：配制无氮培养基，并将其进行灭菌，冷却至适当温度，倒入灭过菌的培养基中，待凝后地面朝上备用（防止水汽污染）. 将恒温箱中的土样取出，将欲分离的土样均匀地撒在无菌的无氮培养基平板上，每块平板分别撒0.25克，共撒三块平板。在培养基上表明土样号，分离日期，将培养皿倒置。放入28—30摄氏度下培养4-7天。 1.2.4当土粒周围长出浑浊，半透明的胶状菌落时，对菌落特征进行观察，计数和编号。 1.3自生固氮菌的纯化： 1.3.1将融化的改良瓦克斯曼77号培养基倒入无菌平板中，凝固后将平板放入65~70摄氏度的烤箱中烘烤15~20min，以除去平板表面的水分。将土样或加富后的土粒样品用无菌水分别稀释至0.1，0.001，0.0001稀释度，并将各稀释度的菌落0.1mL加在平板上，用无菌刮铲涂匀后，放在28~30摄氏度恒温箱中培养7天，经过一周后长出的菌落既为好气性自生固氮菌。 1.3.2挑菌培养并保存
克隆的筛选和快速鉴定
实验六克隆的筛选和快速鉴定 一、目的 掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA；和菌落PCR快速鉴定克隆。 二、原理 在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA和RNA蛋白，将含有质粒DNA的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA，不同大小的质粒DNA和RNA，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。 或者用设计好的引物，做菌落PCR快速鉴定克隆。 三、试剂与仪器 （一）试剂 1．破碎细胞缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、1% SDS、2mmol/L EDTA、400mmol/L 蔗糖和0.01%溴酚蓝。 配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10ml 20% SDS 10ml 250mmol/L EDTA 1.6ml 蔗糖27.2g 1.2%溴酚蓝 1.67ml 加ddH2O至200ml 2．10mg/ml 溴乙啶 3．TBE电泳缓冲液（5×） 4．Taq DNA聚合酶(5U/μl) 5．10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2） 6．dNTP 7．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。 （二）仪器 1．电泳仪2．1.5ml 离心管3．Tip 4．培养皿5．PCR扩增仪6．台式离心机 7．紫外分析仪8．恒温水浴 四、操作步骤 （一）快速细胞破碎法测定 1．取1.5ml离心管编号码，每管加入50μl破碎细胞缓冲液。 2 3．待转化的细菌菌落长到2mm时
根瘤菌及其应用
根瘤菌与豆科植物及其应用 摘要：自贝叶林克1888年首次从豆科植物根瘤中分离获得根瘤菌以来，国内外的许多学者都为揭开这一大自然的奥秘进行着孜孜不倦的研究，成为生命科学最为活跃的领域之一。人们从生物学，生态学，生理生化，分类和遗传等方面对根瘤菌进行了广泛研究，在根瘤菌和根瘤的形态结构，固氮酶的结构和功能，固氮机理和作用调件，根瘤菌在细菌分类学中的地位直到固氮基因，结瘤基因，固氮生态等应用方面都有着较快发展，20世纪90年代共生固氮体系已进入分子水平，研究转入根瘤菌与宿主豆目植物植物的相互识别和信息传递以及根瘤菌群体感应等方面。 关键词：根瘤菌生物固氮根瘤菌应用 一．根瘤菌的生物学特征 根瘤菌：根瘤菌主要指与豆类作物根部共生形成根瘤并能固氮的细菌，一般指根瘤菌属和慢生根瘤菌属；两属都属于根瘤菌目。根瘤菌侵入寄主根内，刺激根部皮层和中柱鞘的某些细胞，引起这些细胞的强烈和生长，使根的局部膨大形成根瘤；根瘤菌在根内定居，植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供氮素养料，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现共生现象。 根瘤菌的形态特征：根瘤菌是短杆状细菌，因生活环境和发育阶段的不同，在形态上有显著变化.根瘤菌在固体培养基上和土壤中呈杆状，端生或周生鞭毛能运动，革兰氏染色阴性，无芽孢，培养较久
菌体粗大，染色不均。 生存习性：根瘤菌与植物的共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根瘤细胞，继续繁殖，根瘤中含有根瘤菌的细胞群构成含菌组织。 根瘤菌进入这些宿主细胞后被一层膜套包围，有些菌在膜套内能继续繁殖，大量增加根瘤内的根瘤菌数，以后停止增殖，成为成熟的类菌体；宿主细胞与根瘤菌共同合成豆血红蛋白，分布在膜套内外，作为氧的载体，调节膜套内外的氧量。 类菌体执行固氮功能，将分子氮还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。与宿主的共生关系是宿主为根瘤菌提供良好的居住环境、碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养。 二．根瘤菌与豆科植物 根瘤菌(root nodule bacteria)是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。已知全世界豆科植物近两万种。根瘤菌是通过豆科植物根毛、侧根杈口(如花生)或其他部位侵入，形成侵入线，进到根的皮层，刺激宿主皮层细胞分裂，形成根瘤，根瘤菌从侵入线进到根
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定
营养缺陷型菌株的筛选和鉴定 mutugenesis and isolation of auxotroph 细菌革兰氏染色法 gram stain 酵母菌的形态结构观察 yeast morphology 培养基的配制和灭菌 types of mddia and sterlization 菌种保藏 preservation of cultures 细胞计数法 conting of cell 凝集反应 agglutination reactions 相差显微镜 phase contrast microscope 细胞融合 cell fusion 质粒DNA的提取 isolation of plasmid DNA 植物DNA的提取 isolation of plant DNA 多肽的末端分析 analysis of terminal of polypeptide PCR扩增DNA PCR amplify DNA fragment SDS-聚丙烯凝胶电泳 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 蛋白质的性质 properties of protein 植物组织培养 plant tissue culture BL-410生物机能实验系统简介 the introduction of BL-410 biofunctional experiment system 青蛙坐骨神经-腓肠肌标本的制备 preparation methods for nerve-muscle specimen of frog 人ABO血型的鉴定 Identification of humankind ABO blood group
青霉素高产菌株的理性筛选
作者：娄忻张莉刘靓张玉莲陈丽华刘静贺建功 【摘要】以青霉素生产菌种87117#为出发菌种，采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法，结合限氧条件下的摇瓶筛选，从177支前体抗性株中筛出xy-137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8.8%,且遗传特性稳定，单位菌丝产物合成能力强。xy-137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证，其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。 【关键词】紫外诱变；动态后处理；理性筛选；青霉素高产菌株 由于青霉素原料的后加工与半合成领域愈来愈广泛，世界青霉素市场竞争十分激烈。生产厂家唯有不断地提高生产水平，降低生产成本以增强企业的竞争力，而优质高产菌种的选育和应用是其中的基础和关键。 随着青霉素菌种生产能力的提高，传统育种方法的局限性越来越明显。理性化筛选是应用遗传学和生物化学的原理，根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构，设计筛选方法，定向选出有效的性状突变株。我们依据理性育种的理念，参照现有生产条件设立基本筛选模型，采用紫外辐射震动工业生产菌种稳定的遗传结构，再辅以限氧条件下耐前体突变株的筛选，达到选育高产菌株的目的。 1 材料与方法 1.1 出发菌种 青霉素生产菌种penicillium chrysogenum 87117#。1.2 培养基 (1)分离及斜面培养基蔗糖、甘油、酵母粉、nacl、caso4、微量元素、琼脂。 (2)种子培养基以蔗糖、玉米浆为碳、氮源。 (3)发酵培养基以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源，加无机盐类组成。 1.3 菌种诱变与筛选 (1)紫外诱变将出发菌株的单孢子悬液置紫外灯下40cm处照射90s。 (2)前体动态后处理定量吸取经过紫外线照射后的孢子液，分别加入含有不同剂量的前体(苯乙酸胺)的种子培养基试管中，使每支试管的前体终浓度在0～4.8%之间。将上述试管置25℃恒温振荡培养18h左右，然后稀释分离在固体培养基平板上。 (3)前体抗性菌落检出平板置25℃恒温培养8d。从耐受不同浓度前体处理后长出的抗性菌落中挑选孢子相对丰富、组织比较致密的菌落进行斜面传代培养，以备摇瓶筛选。 (4)摇瓶定向筛选低氧耗、低菌丝量的高产菌株将摇瓶机转速由通常的220r/min降至160r/min，在低通气条件下进行摇瓶筛选。后续的高产株特性考察和工艺优化均在此条件下进行。 摇瓶筛选考察指标为发酵效价和菌丝生长量(packed mycelial volume,pmv)。 1.4 样品检测 2 结果 2.1 xy-137#高产突变株的选育 出发菌株87117#先经过两次自然选育，然后采用紫外线复合前体动态后处理，挑取177支抗性株，在限氧条件下进行摇瓶筛选。于3.84%前体耐受浓度下获得xy-137#高产突变株，以87117#为对照，其5d和7d摇瓶相对效价分别为107.4%和110.3%，摇瓶效价平均提高了8.8%。
固氮菌筛选及鉴定
固氮菌筛选及鉴定 实验原理 农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。 目的要求 1．初步学会从土壤中分离自生固氮菌的方法。 2．初步学会制作临时涂片的方法。 材料用具 农田的表层土壤(土壤溶液的pH不低于6.5)。 无菌研钵，无菌玻璃棒，接种环，天平，存放有载玻片的酒精缸，盖玻片，显微镜，酒精灯，火柴，镊子，恒温箱，量筒，玻璃铅笔。 灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，结晶紫染液，无菌水。 方法步骤 一、接种 1．接种前，将灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，放在37℃的恒温箱中一两天。随后，选取培养基上没有生长任何微生物的培养皿供实验用。 2．取10g土壤，放在无菌研钵中，注入5mL无菌水，并用无菌玻璃棒搅拌均匀，备用。 3．将接种环放在酒精灯的火焰上灭菌。略微打开培养皿盖，将接种环放在培养基边缘处冷却。然后，用接种环蘸取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上，共点接15～20处(注意：接种时手和衣袖不要碰到火焰，以免烧伤)。 4．接种后，轻轻地盖上培养皿盖，将培养皿放在实验桌上，并在顶盖上写明实验内容、接种人的姓名和接种日期。 二、培养
将接过种的培养皿放入恒温箱内，在28～30℃的温度下培养3～4d。 三、观察 3～4d后，取出培养皿，仔细观察培养基上稀泥浆周围长出的培养物——黏液。黏液初为无色透明，以后为乳白色，最后变成褐色，表明含有自生固氮菌。 四、镜检 1．制作临时涂片 (1)用镊子从存放载玻片的酒精缸中夹取一片载玻片，将载玻片放在酒精灯火焰的上方缓缓烘烤，以便除去上面的酒精。将载玻片放在实验桌上，待载玻片冷却后，在载玻片的中央滴一滴无菌水。 (2)在火焰旁，按照接种的要求，用灭过菌的接种环从培养基上挑取少许黏液，将黏液涂在载玻片上的水滴中，加1滴结晶紫染液，混合均匀，染色1min。 (3)另取一片载玻片作推片。将推片自液滴左侧向右侧移动，使液滴均匀地附着在两片之间。然后，将推片自右向左平稳地推移(两片之间呈30～45°夹角)，推出一层均匀的菌膜。 2．干燥 让临时涂片自然干燥(自生固氮菌的临时涂片不用加热固定，以免破坏荚膜)。 3．在显微镜下观察 依次通过低倍镜和高倍镜观察临时涂片，可以看到染成紫色的自生固氮菌。 结论 通过显微镜能够看到几种自生固氮菌？它们在形态上各有什么特点？将得出的结论写在《实验报告册》上。 讨论 1．为什么盛放无氮培养基的培养皿应当是灭过菌的？ 2．假如黏液中有三种自生固氮菌，你能不能想出一种办法，将这三种细菌分离开来？
固氮菌、解磷菌的分离筛选
固氮菌、解磷菌的分离筛选 一、目的要求: 1、掌握选择培养基的筛选原理。 2、掌握固氮菌、解磷菌的分离方法。 3、学习平板划线分离法。 二、实验原理： 选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理化学抗性而设计的培养基，利用这种培养基可以将所需的微生物从混杂的微生物中分离出来。固氮菌可以利用空气中的氮作为氮源进行自身代谢，根据这一原理可以利用无氮培养基将固氮菌从混合菌中分离出来。解磷菌可以在含有难溶性磷酸盐或有机磷的固体培养基产生溶磷圈，根据这一特性可以分离出解磷菌。同样，可以根据解钾菌的生理特性选择合适的培养基将其分离出来。 在本实验中，分离固氮菌我们采用阿须贝氏（Ashby）培养基，分离解磷菌采用无机磷培养基。 选择培养基的配方如下 Ashby培养基： 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2 g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2 g 氯化钠(NaCl) 0.2 g 碳酸钙(CaCO3) 5.0 g 甘露醇(C6H14O6) 10.0 g 硫酸钙(CaSO4·2H2O) 0.1 g 琼脂 18.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 6.8～7.0 无机磷培养基： 葡萄糖 10.0 g (NH?)?SO? 0.5 g NaCl 0.3 g KCl 0.3 g MgSO??7H?O 0.3 g FeSO??7H?O 0.03 g MnSO?? 4H?O 0.03 g Ca?(PO?)? 10 g 琼脂 18 g 蒸馏水 1000 ml 三、实验材料: 1、试剂及样品：Ashby培养基、无机磷培养基、无菌水、土壤样品（自带）。 2、仪器及其它用具：培养皿、玻璃棒、烧杯、量筒、天平、高压蒸汽灭菌锅、 生化培养箱、超净工作台、接种环、酒精灯、PH试纸等。
诱变育种流程及紫外诱变育种的详细步骤
诱变育种流程及紫外诱变育 种的详细步骤 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
诱变育种的一般步骤： 1.首先是天然菌种的选育： 调查研究及查阅充分的资料 ↓ 设计实验方案 ↓确定采集样品的生态环境 采样 ↓确定特定的增殖条件 增殖培养 确定特殊的选择培养基及可能的 定性或半定量快速检出法 平板分离 ↓ 原种斜面 ↓确定发酵培养基础条件 筛选 ↓ 初筛（1株1瓶） ↓ 复筛（1株3～5瓶） ↓结合初步工艺条件摸索 再复筛（1株3～5瓶） ↓ 3～5株 ↓ 单株纯种分离 生产性能试验 →毒性试验 菌种鉴定 2.诱变菌种：
出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。 诱变育种应把握的主要原则有以下几点：1)选择简便有效的诱变剂。在选用理化因素作诱变剂时，在同样效果下，应选用最简便的因素；在同样简便的条件下，应选用最高效的因素。2)挑选优良的出发菌株。最好采用生产上已发生自变的菌株，选用对诱变剂敏感的菌株，选取有利于进一步研究或应用性状的菌株。4)处理单细胞或孢子悬液。单细胞悬液应均匀而分散，孢子、芽孢等应稍加萌发。5)选用合适的诱变剂量。一般正变较多出现在低剂量中，负变较多地出现在高剂量中。6)选用高效的筛选方法。 紫外线诱变育种： 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253- 265nm．灯与处理物的距离为30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个 /ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不
信息检索信息搜索、鉴别和筛选
信息检索信息搜索、鉴别和筛选 一提到网络搜索，大家马上会想到谷歌和百度。当然，一遇到问题人们可能最先想到的就是这两大搜索引擎。但是呢，好的信息搜索并不只有这两个，每一种搜索引擎都有各自的利弊，选不对搜索引擎，就像选了不合脚的鞋一样，能走路，但艰辛痛苦，也跑不快走不远。使用搜索引擎首先要了解各种搜索引擎特点，否则你可能浪费大量时间。这次搜索，你应该使用百度还是Yahoo？Google还是百度？分析你的需求，选根据需求找拥有相应功能优势的搜索引擎。这里介绍一些： 1.方向着手 （1）从行业入手查找，比较好用的是“百度产品大全”（点击首页“更多”选项即可）：行业报告——各行业官方报告、评定、专家解读，行业与单个品牌市场综述、分析，行业与单个品牌数据、过往新闻。当然这个不乏广告成分，所以需要鉴别，当心受骗。 （2）寻找特定领域的人了解情况，寻找合适采访对象，如专家学者、老一辈，想熟悉某个领域或了解某个城市、历史、词条……这些比较细致的东西，可以用“百度百科”，网友们集体贡献的智慧是无穷的，而且网友的料也是无穷的，你往往能有意外收获。
另外wikipedia（维基百科）也是巨型资料库，而且更新很快。 （3）Google有一个实用搜索功能是“大学搜索”，要知道现在多数有点名的所谓专家学者都没少在大学挂职，各种研究所、实验室、官方组织的这个那个不少也扎根大学，而大学又是产生思想文化的重要阵地。用这个搜索可以一网打尽和某所大学有关的所有东西。 （4）现在有一些新开发的搜索引擎，它们可以对网页库中的某类专门的信息进行一次整合。有人称之为：元搜索引擎。这种搜索引擎的特点是大大减少了你整合资料的时间。 比如比比猫（Bbmao）。这个搜索引擎的特点是：自动分类、自动去掉重复结果、汇集五大搜索引擎结果。智能分类，你可能在分类中发现一些你不曾想到的东西。 不过元搜索是不是好用，可能仁者见仁智者见智，但是只要适应了这种新方式，会给你带来很多方便。 2.技巧着手 （1）设计关键词：使用搜索引擎要避免大而空的关键词，它不知道你要找啥，就可能返回很多莫名其妙结果。
高效大豆根瘤菌的筛选
高效大豆根瘤菌的筛选 作者：张欣，李玉文转贴自：本站原创 (1．东北林业大学林学院；2．黑龙江省科学院生物肥料研究中心，黑龙江哈尔滨150086) 摘要：将选取的10株大豆根瘤菌菌株(HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN10 05，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，HLJN10010)与在黑龙江省大面积栽培的5 个大豆品种（垦农18号，垦鉴豆25号，合丰25号，疆丰21-1381号，绥农4号）进行最佳共生匹配双瓶筛选试验，测定了大豆植株株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等生物学指标并进行统计分析，从中筛选出共生固氮结瘤能力强的优良菌株HLJN1001和HLJN 1003。 关键词：大豆根瘤菌；大豆品种；共生匹配；筛选 中图分类号：S565.1 文献标识码：A 文章编号：1007—6921(2011)10—0125—03 根瘤菌(Rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，它可以侵染豆科植物根部，形成根瘤，固定空气中的分子态氮形成氨，为植物提供氮素营养。但根瘤菌与豆科植物独立存在时，不能利用大气中的N2，而当根瘤菌侵入豆科植物的根细胞并在其中迅速增殖后，可产生类菌体，并在根瘤内出现豆血红蛋白，同时具备类菌体和豆血红蛋白的根瘤便具有固氮能力。研究表明，不同的根瘤菌与大豆品种间的共生固氮能力存在着较大的差异［1,2］ 。因此，筛选与豆科作物品种匹配、固氮能力好、竞争结瘤能力强的优良菌株，是提高根瘤菌应用效果的重要途径［3］。现选取10株大豆根瘤菌菌株，与5个在黑龙江省大面积栽培的大豆品种进行共生匹配性研究，从中筛选出优良菌株，为大豆育种材料的选择和共生固氮作用的发挥提供依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试菌株 HLJN1001，HLJN1002，HLJN1003，HLJN1004，HLJN1005，HLJN1006，HLJN1007，HLJN1008，HLJN1009，