脂肪酶高产菌株筛选材料方法
产脂肪酶的菌株筛选方法的研究
产脂肪酶的菌株筛选方法的研究近年来，随着植物油和动物油在食品、医药、农药以及其他行业的广泛使用，脂肪酶的需求量逐渐增加。
脂肪酶是一种具有多种功能的酶，它可以分解脂肪和油脂，用来制造食品添加剂、医药中间体以及其他有用的产品。
发酵技术是获得脂肪酶的重要方法之一，而发酵菌株的筛选是发酵技术的基础和关键步骤，其目的是从微生物资源中筛选出对脂肪酶产生量有明显提高的菌株（颜永涛，2018）。
一般而言，菌株的筛选标准主要有两个，一是筛选的菌株能有效的产出脂肪酶，二是筛选的菌株能兼顾发酵条件的优化。
因此，要求筛选出高产脂肪酶的菌株，必须考虑到发酵条件与产物形成之间的关系。
筛选高产脂肪酶的菌株一般包括多种筛选方法，其中比较常见的是两种：一种是培养基筛选方法，另一种是固定化筛选方法。
培养基筛选方法是在最佳培养基中，根据育种材料的不同（如不同的液体培养基或固体培养基），采用基础发酵条件对菌株进行培养，以获得高产脂肪酶的菌株。
优势在于，培养基筛选方法易于操作，能够及时获得结果，且价格低廉，但这种方法受发酵条件的限制，在某些情况下，成果不太满意。
固定化筛选方法是在发酵过程中，将发酵菌株通过固定化技术（如表面层析法、膜层流法、筛选电泳法）进行筛选，然后再根据筛选出来的菌株的表现和性状，以及细胞高分子量蛋白或细胞酶活性，来识别和分离出高产脂肪酶的菌株。
相比培养基筛选方法，固定化筛选方法更加精确，能够准确识别出高产脂肪酶的菌株，但操作复杂，费时费力，存在技术操作的难度。
另外，结合培养基筛选方法和固定化筛选方法也可以进行脂肪酶菌株的筛选。
例如，采用柔性发酵条件，针对不同的育种材料经过培养基的筛选，从中获得脂肪酶合成量提高明显的发酵菌株，再利用固定化筛选方法进一步筛选出脂肪酶合成量更高的菌株（张静，2019）。
综上所述，要筛选高产脂肪酶的菌株，可以采用培养基筛选方法、固定化筛选方法，也可以结合培养基筛选方法和固定化筛选方法进行操作，以达到所需的目标。
产脂肪酶乳酸菌的筛选及其对奶酪风味的影响
产脂肪酶乳酸菌的筛选及其对奶酪风味的影响产脂肪酶乳酸菌的筛选及其对奶酪风味的影响引言：奶酪作为一种受人们喜爱的乳制品，其独特的风味是由其中的乳酸菌发酵产生的。
然而，乳酸菌中只有少数能产生脂肪酶。
脂肪酶可将乳中的脂肪水解为脂肪酸，这些脂肪酸为奶酪提供了特殊的风味。
本文将探讨产脂肪酶乳酸菌的筛选方法以及其对奶酪风味的影响。
第一部分：产脂肪酶乳酸菌的筛选方法脂肪酶乳酸菌的筛选是探索奶酪风味的关键。
以下是一些常见的筛选方法：1. 纸片法：在培养基上涂布脂肪酶底物，如乳脂肪酸甘油酯，然后在此基础上观察细菌的产酶能力。
产脂肪酶菌株会在纸片上出现透明圈，表示底物被水解。
2. 红雪藻酪蛋白平板法：添加红雪藻酪蛋白的平板培养基，利用产酶细菌使平板发生透明区带来判断。
3. 紫外线灭菌法：在试管中加入产酶菌株和乳脂肪酸甘油酯，利用UV-C紫外线灭菌使菌株破裂释放的酶作用对乳脂肪酸甘油酯进行水解，并观察产酶能力。
第二部分：产脂肪酶乳酸菌对奶酪风味的影响脂肪酶的存在对奶酪的风味影响巨大。
乳脂肪酸通过脂肪酶的作用被水解，产生了多种风味物质，如酸乳、酯类和醛类。
这些物质不仅为奶酪增添了复杂的香味，同时也能够增强奶酪的口感和风味。
此外，酯类化合物还能够产生脂肪感，使奶酪口感更为丰富。
因此，产脂肪酶的乳酸菌对奶酪的风味有着明显的影响。
此外，不同菌株产生的脂肪酶种类和酶活性也有所不同，这将进一步影响奶酪的风味。
因此，在奶酪生产中，选择合适的产脂肪酶乳酸菌菌株是非常重要的。
结论：产脂肪酶的乳酸菌在奶酪生产中起着重要的作用。
通过合理的筛选方法，我们可以获得高效产酶的菌株。
这些乳酸菌通过水解乳脂肪酸产生不同风味物质，丰富了奶酪的风味和口感。
因此，我们应该重视产脂肪酶乳酸菌的筛选与利用，以提高奶酪的质量和口感。
注意：本文为人工智能生成内容，仅供学术参考和个人用途，请勿直接传播和抄袭通过紫外线灭菌法观察产酶能力，可以判断乳酸菌是否具有产脂肪酶的能力。
产脂肪酶菌株的筛选鉴定及响应面法
摘要本文开展了产脂肪酶菌株的筛选鉴定及响应面法优化发酵工艺试验,确定得到的高产脂肪酶菌株为Youzh-1,对其进行16S rRNA 测序分析,确定其为荧光假单胞菌,在单因素试验的基础上采用响应面法对Youzh-1的发酵工艺进行进一步优化设计,得到最佳发酵工艺为葡萄糖添加量18.825g/L 、牛肉膏添加量25.98g/L 、温度41℃、pH 值6。
在此条件下测得脂肪酶活力为79.87U/mL ,较理论值87.19U/mL 减少了8.39%,证明模型可靠。
关键词脂肪酶;菌株;筛选;鉴定;响应面法;发酵工艺;优化中图分类号TQ925.6文献标识码A 文章编号1007-5739(2022)12-0165-06DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2022.12.046开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Screening and Identification of Lipase-producing Strain and Optimization of FermentationProcess by Response Surface MethodologyQIN Hao LIU Kai DENG Wenxi LI Shan YU Shuping WANG Mengyuan GUO Donghui *(College of Life Sciences,Shandong First Medical University,Tai ′an Shandong 271016)Abstract In this paper,the screening and identification of lipase -producing strain and the optimization of fermentation process by response surface methodology were researched.The obtained high lipase-producing strain was Youzh-1,which was determined to be Pseudomonas fluorescens by 16S rRNA sequencing analysis.On the basis of the single factor experiment,the response surface methodology was used to further optimize the fermentation process of Youzh-1.The optimum fermentation process was obtained as follows:the addition of glucose was 18.825g/L,the addition of beef extract was 25.98g/L,the temperature was 41℃,and the pH value was 6.Under these conditions,the lipase activity was measured to be 79.87U/mL,which was 8.39%lower than the theoretical value (87.19U/mL),which proved that the model was reliable.Keywords lipase;strain;screening;identification;response surface methodology;fermentation process;optimization产脂肪酶菌株的筛选鉴定及响应面法优化发酵工艺秦昊刘凯邓文玺李珊于淑萍王梦圆郭东会*(山东第一医科大学生命科学学院,山东泰安271016)脂肪酶在人们的生产生活中发挥着重要作用[1]。
产脂肪酶菌株的筛选及产酶条件优化
2.3.3 不同起始 pH 对产酶的影响 结果显示，起始 pH 对产酶的影响很大，该菌株产
摘 要：从土壤样本中分离出一株具有较高活力的产脂肪酶菌株，初步确定为假单胞菌属。对该脂肪酶产酶条件进 行优化，最佳碳源为糊精、氮源为硫酸铵，最适发酵温度为 30 ℃，最适起始 pH 为 7.0。 关键词：脂肪酶；假单胞菌属；产酶条件
Screening of Lipase Producing Strains and Optimization of the Lipase Production LI Xin- ling1, SUN Xiao- fei1, MENG Nan1, BU Mei- ling1，LIU Jin2
Abstract: This thesis reports that a lipase- produing bacterial strain was isolated from the oilysoil samples and was identified as pseudomonas. The lipase fermentation condition for the strain was optimized by studying on effect of nitrogen sources, carbon sources and other influence factors. The optimum carbon and nitrogen source was dextrin and ammonium sulfate. The optimum pH was 7.0, and the optimum temperature for fermentation was 30 ℃. Key words: lipase; pseudomonas; optimal lipase- producing condition
产脂肪酶细菌的筛选及发酵培养条件的优化
[收稿日期] 2011-05-16;2011-08-12修回[基金项目] 贵州省科技攻关项目 生物酶法生产生物柴油 [黔科合NY(2006)3031];贵州省科技创新人才团队建设项目 贵州省特色动植物资源保护与可持续利用科技创新人才团队 [黔科合人才团队(2009)4007][作者简介] 洪 鲲(1973-),男,讲师,硕士,从事生物化学研究。
E -mail:ken _hong2004@yah *通讯作者:乙 引(1967-),男,教授,博士,硕士生导师,从事植物生理与生物化学研究。
E -mail:yiyin@gz [文章编号]1001-3601(2011)09-0561-0103-03产脂肪酶细菌的筛选及发酵培养条件的优化洪鲲,张豪,乙引*,张习敏(贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳550001)[摘 要]为给扩大脂肪酶的生产源提供基础资料,对富含油脂的67份土壤样品进行了产脂肪酶细菌的筛选及目标菌株发酵培养条件的优化试验。
结果表明:筛选分离出15株脂肪酶产生菌,经过对其发酵液脂肪酶活力的比较,菌株D9-1发酵液脂肪酶活力最高。
目标菌株D9-1产脂肪酶最佳培养条件:最适氮源为1%蛋白胨,最适碳源为1%橄榄油,表面活性剂为1%OP -10,最适发酵温度30 ,摇床转速为170r/m in,发酵培养时间为24h 。
[关键词]脂肪酶;细菌;筛选;发酵;培养条件[中图分类号]S182;S154[文献标识码]AScreening for Lipase -produ cin g Bacterial Strains andOptimization of the Fermentation Con ditionsH ONG Kun,ZH A NG H ao,YI Yin *,ZH ANG X-i min(School of Lif e Sciences ,Guizhou Normal U niversity ,Guiy ang,Guizhou 550001,China)Abstract:15lipase -pr oducing bacterial strains w ere isolated fr om 27soil samples rich in oil and D9-1w as selected as the mo st potential lipase -producing strain through comparing the lipase activity in fermentation broths o f these strains.T he results show ed that the o ptimum nitrog en source is peptone,optimum carbon source is 1%o liv e oil,optimum surfactant is 1%OP -10,optimum temperature is 30 ,and w hen the rotating speed w as 170r/min,the lipase activity in ferm entation broth r eached the highest after 24h.Key words:lipase;bacter ium;screening;ferm entation;fermentation conditio ns 脂肪酶广泛存在于动植物、细菌、真菌和霉菌体内[1-2],具有催化三脂酰甘油及其他一些水不溶性脂类的转酯、水解、酯化、醇解及酯类逆向合成的特性。
高产脂肪酶菌株的筛选及酶学性质的研究的开题报告
高产脂肪酶菌株的筛选及酶学性质的研究的开题报告
一、选题背景及意义
脂肪酶作为一种广泛存在于细菌、真菌和动植物中的酶类，在脂肪水解、饮食营养、生物转化等方面具有重要的作用。
因此，筛选高产脂肪酶的菌株具有重要的研究意义。
目前，虽然已有许多脂肪酶菌株被发现，但其产酶能力参差不齐，产酶量较少，对于一些实际应用仍然存在着不足。
因此，筛选高产脂肪酶的菌株并进行酶学性质的研究，对于进一步了解脂肪酶的生产和应用具有重大意义。
二、研究内容
1.从自然界中筛选高产脂肪酶的菌株，利用液体发酵和固体发酵技术进行发酵，并对产酶量进行分析和比较；
2.对高产脂肪酶菌株的生长条件进行研究，包括温度、pH值、培养基成分等因素对其生长和产酶能力的影响；
3.从高产脂肪酶菌株的菌体中提取酶液，进行酶学性质的研究，包括酶的催化性质、热稳定性、抗离子等性质的分析和比较；
4.开展脂肪酶的应用研究，包括对脂肪水解和饮食营养的实际应用研究。
三、研究方法和步骤
1.从自然界中筛选高产脂肪酶的菌株，采用液体和固体发酵技术进行发酵，并对产酶量进行分析和比较；
2.对高产脂肪酶菌株的生长条件进行研究，包括温度、pH值、培养基成分等因素对其生长和产酶能力的影响；
3.从高产脂肪酶菌株的菌体中提取酶液，进行酶学性质的研究，包括酶的催化性质、热稳定性、抗离子等性质的分析和比较；
4.开展脂肪酶的应用研究，包括对脂肪水解和饮食营养的实际应用研究。
四、预期研究结果和意义
通过筛选高产脂肪酶的菌株，并研究其生长条件和酶学性质，有望发现一些具有高产酶量、高催化效率、热稳定性好等优良性状的脂肪酶菌株。
这些研究成果将有助于推进脂肪酶的生产和应用，为提高脂肪水解和饮食营养等方面做出贡献。
脂肪酶高产菌株筛选、产酶条件优化及脂肪酶大量纯化研究
华中科技大学硕士学位论文脂肪酶高产菌株筛选、产酶条件优化及脂肪酶大量纯化研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：生物化工指导教师：刘曼西;闫云君20050323摘要从武汉襄樊十堰等地采集含油污土样208份经平板粗筛摇瓶复筛得到酶活力在5.0U/mL以上菌株6株其中Aspergillus sp.F044酶活最高达到11.18U/mL 应用逐因子试验Seriatim-Factorial Experiment Plackett-Burrman反应面法Response Surface Methodology, RSM和单因子试验Monofactorial Experiment分析对曲霉Aspergillus sp.F044产脂肪酶发酵条件进行了快速优化首先应用逐因子试验确定Aspergillus sp.F044产脂肪酶最适碳源和最适氮源分别为麦芽糖和牛肉膏在此基础上通过Plackett-Burrman设计对八个影响其产酶相关因素进行评估并筛选出具有显著效应的橄榄油乳化液浓度牛肉膏浓度硫酸镁浓度三个因子然后拟合三个因子关于发酵液酶活力的一阶线性模型再沿着一阶模型指定的路径进行最速上升试验在上升最高点处由中心组合试验和反应面法确定其最优培养基组成最后通过单因子试验确定最适发酵温度和最适摇床转速得到优化培养条件为麦芽糖1.5硫酸铵7‰磷酸氢二钾1‰牛肉膏1.25硫酸镁2.11‰橄榄油乳化液1.41自然pH250r/min和30培养72h后酶活达到32.15U/mL与初始11.18U/mL相比酶活提高了2.88倍在此基础上研究了Aspergillus sp.F044脂肪酶在双水相Aqueous Two PhaseSystem ATPS中分配平衡选择影响较大的五个参数如PEG平均相对分子质量PEG浓度磷酸盐浓度pH和NaCl浓度研究其对分配平衡的影响试验得到最优纯化条件为:PEG相对分子质量为600浓度17.5w/w,磷酸盐浓度12.5w/w , NaCl浓度0.5w/w pH7.0在此条件下脂肪酶分配系数达到7.1纯化系数达到4.7回收率达到0.91微生物脂肪酶在工业应用中具有重要经济价值目前我国在这方面尚处于起步阶段本课题目的是在酶法生产生物柴油技术工艺以及脂肪酶规模化生产等方面的一些瓶颈问题做一些有益探索因此具有重要意义关键词脂肪酶 Plackett-Burrman设计RSM试验设计双水相纯化AbstractTwo hundred and eight oil-stained soil samples were collected from Xiangfan city Shiyan city and Wuhan city. By primary plate screening with bromothymol blue as indicator and second flask assay, six strains with high ability of lipases production were obtained, and the catalytic activity of the lipases were more than 5.0U/mL, among which the one from Aspergillus sp.F044 ranked the first and reached 11.18U/mL.Lipase production condition of Aspergillus sp. F044 was fleetly optimized using seriatim-factorial experiment Plackett-Burrman design, response surface methodology(RSM) and Monofactorial experiment. The optimum carbon source and the optimum nitrogen source for Aspergillus sp.F044 screened through seriatim-factorial experiment were maltose and bovine extract, respectively. By Plackett-Burrman design eight process factors related to lipase production were evaluated, among which three factors, concentrations of olive, bovine extract and bitter salt were found to have prominent effect on lipase production. Then the first-order model about the factors was conducted to direct steepset ascent experiment. Under the optimum condition central-composite design and response surface analysis were exercised to estimate optimum culture medium composition. Optimum fermentation temperature and optimum agitation speed of rocking incubator were determined by Monofactorial experiment. The composition of the optimum cultureHPO4,medium was 1.5w/v maltose , 7‰w/v ammonium sulfate1‰w/v K1.25w/v bovine extract,2.11‰w/v bitter salt, 1.41v/v emulsified-olive,nature pH, and the optimum fermentation temperature and the optimum agitation speed were 30and 250r/min, respectively. After 72h incubation with the optimum medium under the condition of 250r/min and 30, a maximum lipase yield 32.15U/mL wasobtained, which was 2.88-fold higher than that under beginning culture mediums.The partition behaviors of the lipase from Aspergillus sp.F044 were also studied inAqueous Two Phase System ATPS. The results showed that relative molecular weight of polyethylene glycol, concentration of polyethylene glycol, concentration of phosphate salt, pH value and concentration of NaCl greatly influenced on the partition equilibrium of the lipase in ATPS. The optimized purification condition of Aspergillus sp.F044 lipase was: 17.5 PEG600, 12.5 phosphate salt, 0.5 NaCl and pH7.0. Under the optimalcondition partition coefficient of the lipase was 7.1, purification fold was 4.7, and lipase yield was 0.91.Microbial lipases possess great economical potential in industrial applications, and it is just on the first phase for lipase applied in industry in China at present. The main purpose of this subject is to research the problems in lipases industrial production and biodiesel-synthesis, so this study is of great significance.Keywords: lipase Plackett-Burrman design Response Surface Methodology Two Aqueous Phase System purification独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果近我所知除文中已标明引用的内容外本论文不包含任何其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担学位论文作者签名陈晖日期2005年3月30日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留使用学位论文的规定即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版允许论文被查阅和借阅本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文保密在______年解密后适用本授权数本论文属于不保密请在以上方框内打学位论文作者签名陈晖指导教师签名闫云君刘曼西日期2005年3月30日日期2005年3月30日1 文献综述引言随着石油等传统矿产能源日益枯竭以及燃烧矿产燃料产生的环境污染问题日益严重迫使人们开始寻找清洁可持续利用的替代能源生物柴油作为可再生清洁能源受到日益广泛关注生物柴油是指由动植物油与短链醇甲醇或乙醇进行酯交换反应所制备的脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯目前采用的化学合成法具有工艺复杂能耗高产品色泽深以及污染环境等缺点用脂肪酶法催化合成生物柴油可以解决上述问题是新型能源工业重要发展方向但酶法也有其不足1酶的制备成本相对较高2反应底物短链醇对脂肪酶具有失活作用因此获得大量高活力耐受性强的脂肪酶是酶法生产生物柴油的关键所在目前国际国内尚没有很好地解决这一技术难题所以脂肪酶具有重要研究和开发价值脂肪酶Lipase, EC3.1.1.3是一类重要的甘油酯键水解酶可以在油水界面上催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油以及中间产物甘油一酯和甘油二酯[1-3]脂肪酶广泛存在于动物组织植物种子和微生物中商业化的脂肪酶主要来源于微生物[4]由于微生物脂肪酶种类多具有比动物脂肪酶更宽的反应pH适宜温度范围和更强的底物专一性便于进行工业生产获取高纯度制剂因而得到广泛研究[5]目前工业上采用微生物发酵制备和提取脂肪酶并将其应用于食品医药洗涤皮革造纸等行业领域[6]近年来因其可催化各类化学选择性区域选择性立体结构选择性转化反应以及不催化副反应且一般不需要辅助因子等特点促使脂肪酶在有机合成中得到广泛应用[78]矿化石油资源枯竭和人们生态环境保护意识的提高使得脂肪酶催化合成生物柴油作为可再生替代环保燃料为世人瞩目 [912]随着分子生物学和生物技术的快速发展脂肪酶细胞表面展示[13]基因表达调控[14]特异脂肪酶的高通量分子筛选[15]等已成为人们的关注焦点并将逐步替代传统菌株筛选产酶条件优化等试验方法更好的为工业应用提供支持1.1 脂肪酶性质1.1.1 脂肪酶理化特性目前已发现的脂肪酶相对分子质量大多在30kDa40kDa之间等电点在3.79.7之间酶蛋白分子含有一到几个亚基脂肪酶最适作用温度最适pH pH稳定性以及耐热性因不同来源而异Staphylococcus simulans组成性分泌脂肪酶由四个相对分子质量约40KDa脂肪酶亚分子聚集而成分子质量160kDa最适温度和最适pH分别是37°C和pH8.5在60°C保温几分钟酶即失活对Ca2无依赖[16]来源于Bacillusthermoleovorans ID-1嗜热脂肪酶相对分子质量34kDa最适温度和最适pH分别是70 75°C和pH7.5在60°C保温一小时或70°C保温半小时仍保持50的初始活力 Ca2或Zn2对其有激活作用[17]某些微生物可产两种或两种以上的脂肪酶如Ophiostoma piliferum可分泌两种脂肪酶相对分子质量分别为60kDa和52kDa等电点分别为3.79和3.6[18]总体上微生物脂肪酶最适pH大多为中性最适pH范围与微生物种属无明显相关性真菌脂肪酶最适作用温度相对较低而细菌脂肪酶则比较耐热虽然不同来源的脂肪酶相对分子质量相差很大一级结构同源性程度较底但三级结构之间却含有相似的α/β模体结构[19]这些保守的α螺旋和β折叠形成空洞空洞中含有高度保守的丝氨酸组氨酸天冬氨酸三合体结构三合体相互作用使得空洞变成活性氧洞成为脂肪酶分子催化活性中心空洞外有一个由表面环和螺旋结构构成的亲水性盖子使得氧洞不会直接暴露出来[20]一些真菌来源的脂肪酶肽链上连接有糖基但不直接决定酶活力如切除Rhizpous niveus型脂肪酶的糖基型酶转变成型但酶活并不降低[21]脂肪酶具有界面催化特性其催化脂肪酸油脂水解反应需在油水界面上进行[22]且需要一定量的活性水[23]金属离子对脂肪酶催化能力也有影响Chartrain等发现1mM Zn2+可以抑制P.aeruginosa MB5001脂肪酶94的酶活力而加入10mMCa2+可重新将酶激活[24]P.pseudoalcaligenes F-111脂肪酶能够在301mM Fe3中保温1h被抑制60的酶活但1mM Ca2+Hg2+Zn2+Mn2Cu2+Mg2+Co2+Cd2Pb2等在同样条件下对酶活没有显著性影响[25]笔者研究的Aspergillus sp.F044脂肪酶可以被Ca2+激活脂肪酶是一类剪切力低耐受性蛋白质在反应过程中机械搅拌反应体系可以增大油水界面但搅拌所带来的液液以及气液界面间的剪切应力可能会使脂肪酶变性解开折叠但酶蛋白不会裂解成多肽链随着温度升高变性作用加剧[26]1.1.2 脂肪酶催化机理脂肪酶必须和底物结合才能起催化反应但酶是水溶性的而底物是不溶于水的因此水解反应必须发生在油水界面上这种反应的机制尚不清楚但Brockerhoff于1974年提出脂肪酶在油水界面上定位假说[27]该假说认为脂肪酶只能与一种不同于一般底物的超底物结合超底物比酶分子大的多超底物中包埋有反应底物脂肪酶在水溶液中作热运动碰到超底物时脂肪酶亲水性盖子定位到超底物表面此时超底物内部疏水作用力推开脂肪酶亲水性盖子促使脂肪酶发生构象改变暴露出疏水性活性中心使得底物疏水性头部进入活性中心近年来脂肪酶的结构和催化机理有不少报道有Pseudomonas cepaica,Pseudomonas.sp Staphylo-coccushyicus,金黄色葡萄球菌, Geotrichumcan-didum,Caudida cylindracea Rhizomucormiehei RML和人胰脂肪酶HPL虽然不同来源的脂肪酶氨基酸序列有较大的差异但它们却有相似的折叠方式和活性中心有着非常相似的立体结构一般来说脂肪酶的多肽链折叠成两个结构域即N末端和C末端结构域N末端的活性部位有一条可结合长链脂肪酸的疏水性通道该通道从催化部位的Ser直到分子的表面[28]几乎所有的脂肪酶的活性部位都由组氨酸His色氨酸Ser天冬氨酸Asp组成, 但也有一些脂肪酶的活性部位为组氨酸色氨酸和谷氨酸Glu三合体结构通常情况下脂肪酶的活性部位被一个螺旋片断所掩盖在底物存在的情况下酶的构象发生变化盖子打开含有活性部位的疏水部分就暴露出来盖子中α螺旋的双亲性会影响脂肪酶与底物在油水界面上的结合能力其双亲性的减弱将会导致脂肪酶活性的降低盖子的外表面相对亲水而其面向催化部位的内表面则相对疏水由于脂肪酶与油/水界面的缔合作用使盖子打开活性部位得以暴露这使得底物与脂肪酶的结合能力增强此时底物就容易进入疏水性的通道而于活性部位结合三合体结构中三个氨基酸残基相互作用使得活性部位形成活性氧区活性氧亲和进攻酯键形成酶底物复合物[29]酯键打开生成水溶性脂肪酸和甘油1.1.3 反应类型总体上脂肪酶可催化酯合成酯水解酯交换和氨/胺解四种反应具有反应条件温和化学选择性强高度立体结构专一性副产物少等优点酯合成反应如方程式所示在脂肪酶作用下羧基化合物和醇缩合脱去一分子水生成酯类近年来脂肪酶催化合成光学不对称化合物发展迅速正逐渐替代常规的有机合成途径通过假丝酵母脂肪酶选择性地催化外消旋体2甲基羧酸和醇酯化获得S2甲基羧酸酯而R 型不会被酯化, 如方程式所示酯水解反应如方程式中逆反应脂肪酶催化酯键水解生成羧酸和醇由于脂肪酶具有高度立体结构专一性因此该反应被广泛应用于光学化合物的拆分R-HPBE 是合成多种血管紧张素转化酶的抑制剂的重要中间体如合成抗高血压药西拉普利Cilazapril用脂肪酶催化水解外消旋的HPBE 可以得到光学纯的RROOH +OH OHOHRR R OO O O OO+OH 2方程式 脂肪酶催化酯合成反应Equation Esters synthesis catalyzed by lipasesCH 3COOHCH 3CH2n+CH 3CH2nOH环己烷CH 3CH2n +OC H 3CH 3CH2nO CH2nCH32甲基羧酸外消旋RS方程式S 2甲基脂肪羧酸酯的合成 EquationS2methylcarboxylate synthesisHPBE和S HPBA[30]其过程如方程式所示OOHO CH3 (?）HPBE+3OOHOH(S)HPBA方程式脂肪酶手性拆分HPBEEquation Enzymatic resolution of chiral compound-HPBE脂肪酶催化酯交换反应类型类似于酯合成总体上包括狭义酯交换反应醇解和氨/胺解解随着能源危机的到来和环保意识的提高脂肪酶催化合成生物柴油成为当前科学应用研究的热点领域如反应方程式所示此外脂肪酶被广泛应用于制备光活性药物S-1-叠氮-3-芳氧基-2-丙醇是合成β-抗肾上腺素的中间体可以从(CH2)nCH2(CH2)nCH2(CH2)nCH2OOOOOOCHCH3CHCH3CHCH3天然油脂(n14)+CH3OH脂肪酶CH3(CH2)nCH2OOCH2脂肪酸甲酯生物柴油方程式脂肪酶催化合成生物柴油Equation Biodiesel synthesis catalyzed by lipasesO N3OH+CH2OO CH3CH3脂肪酶O N3OHAr3(s)醇(R)酯()1-叠氮-3-芳氧基-2-丙醇方程式脂肪酶催化选择性醇解反应Equation Resolution reaction by lipase catalyzed enantoselective acetylation其外消旋体拆分获得以乙酸异丙烯酯为酰化剂在南极假丝酵母脂肪酶催化下外消旋体1-叠氮-3-芳氧基-2-丙醇选择性地转化为相应的S -醇和R -酯[31]反应过程如方程式脂肪酶具有较低的酰胺酶活性能够催化胺氨的酰化酶法氨解反应和酯交换反应的区别在于酰基供体不同被活化的酯在脂肪酶作用下和胺发生酰化反应O OHOEtCH 3NH 3OOHOEtC3+2H 3(R)氨基酯3-羟基戊二酸二甲酯方程式 脂肪酶催化氨解反应Equation Ammonolysis reaction catalyzed by lipases被活化的酯常用于氨解反应以Candida Antarctica lipase B CAL-B 为催化剂3-羟基戊二酸二甲酯和胺或氨发生反应可以得到对映体纯的氨基酯在溶液中前体R酯发生亲核反应生成R氨基酯[32]反应过程如方程式所示1.1.4 底物特异性脂肪酶对底物具有化学和空间结构选择性根据脂肪酶来源不同其底物特异性也有所差异人们对这一点已有非常深入的认识如上面提到的通过脂肪酶实现对HPBE 1-叠氮-3-芳氧基-2-丙醇3-羟基戊二酸二甲酯等光学拆分以得到光学纯的反应产物又如2芳氧基丙酸是一类重要的除草剂目前市面上多数是外消旋体而研究表明只有R -型异构体具有除草活性外消旋2芳氧基丙酸乙烯酯在黑曲霉脂肪酶催化下与甲醇进行酯交换反应可选择性得到光活性R2芳氧基丙酸乙烯酯和S -2芳氧基丙酸甲酯且收率高达46[33]Alford 曾比较了23种不同的微生物脂肪酶发现大多数脂肪酶作用于三酯酰甘油的13位酯键Aspergillus terrus 专一性地作用于13位酯键对猪油和落花生油表现了较高地活性[34]总体上脂肪酶表现出对醇链上羟基比脂肪酸链上酰基更强的立体结构专一性但目前对于这一专一性的分子机理知之甚少[35]Rogalska 等通过研究脂肪酶被脂滴功能性吸附表明底物物理化学状态如表面张力和表面特性将会影响脂肪酶活力和特异性[36]部分融合一级结构有86同源性但底物特异性不同的两种白地霉脂肪酶Geotrichum candidum lipase GCL-和GCL-的氮末端和碳末端发现GCL-349到406位的58个氨基酸残基决定其对cisΔ-9不饱和脂肪酸酯特异性催化进一步研究发现其中有十四个氨基酸残基处于脂肪酶分子的表面它们可能参与进行底物识别[37-38]通过建立褶皱酵母脂肪酶与手性底物结合模型研究发现脂肪酶识别特异性光学底物可能与手性底物结合模型的自由能有关自由能越低识别作用越强烈[39-40]1.2 菌株筛选和酶活测定1.2.1 野生菌株很多微生物都产脂肪酶包括细菌放线菌真菌和酵母共计约65个属的微生物产脂肪酶[6]而实际上可能更多我国微生物脂肪酶研究起步较晚1967年中科院微生物所筛选到解脂假丝酵母Candida lipolytica AS2.1203并于1969年制成酶制剂供应市场国内产脂肪酶微生物概况见表1.1常见的商品化的脂肪酶产生菌见表1.2表1.2 常见的商品脂肪酶Table 1.2 Some familiar commercial lipases菌株缩写生产厂商Amano Candida cylindracea CCL Sigma,Fluka Aspergillus niger ANL Amano,Rhizopus delemar RDL AmanoNovo Humicola lanuginose HLL Amano, Mucor Miehei MML Novo,Gist-Brocades Horse-Liver esterase HLE Sigma, Fluka, Amano1.2.2 筛选方法筛选脂肪酶高产菌的方法常见的是采用含甘油三酯琼脂平板法首先采集含油污土壤样品或其它杂物如油垢废油布等无菌水梯度稀释样品涂平板培养观察平板上菌落周围透明圈或通过在培养基中添加指示剂如罗丹明B溴甲酚紫维多利亚蓝等作为筛选标记观察变色圈的大小透明圈和变色圈的有无与大小说明菌株产脂肪酶能力即透明圈和变色圈越大菌株产脂肪酶能力可能越大例如C ardena等以三丁酸甘油酯为底物通过观察菌落周围的透明圈筛选得到六株脂肪酶高产菌[59]我国高修功等以橄榄油乳化液为底物通过观察透明圈筛选得到一株高酶活假单胞菌[56]李春华粗筛以维多利亚蓝B为指示剂以罗丹明B为复筛指示剂筛选得到一株耐热碱性芽孢杆菌[51]作者所在实验室分别以溴甲酚紫和罗丹明B为指示剂筛选得到多株高酶活菌株有些研究则以吐温为底物如Mohd以吐温80为底物分别在筛选平板中添加维多利亚蓝甲基红和罗丹明B作为筛选标记发现脂肪酶活力与三种指示剂的变色圈大小和颜色深浅成正比[60]又如Ionita以G.Y.P.组成w/v:葡萄糖2.0酵母膏0.5蛋白胨0.5琼脂2.0为基本培养基然后在其中添加0.1CaCl 2和1.0吐温80脂肪酶作用在平板上形成不透明的皂化钙圈计算皂化钙圈与菌落圈的比值可以近似估计菌株产脂肪酶能力[61]这种方法屏蔽了因橄榄油不溶于水乳化液不稳定从而造成底物在平板中分布不均匀以及三丁酸甘油酯作为底物时透明圈不明显的缺点但以吐温80为底物最大缺陷是不能区分酯酶和脂肪酶另外一些产脂肪酶菌可以寄生在动植物组织中如Abbas等从棕榈果实中分离得到一株毛霉其发酵酶活达到57U/mL[62],因此有目的从含油动植物组织中分离寄生菌是特殊有效的方法筛选具有特殊性质的脂肪酶如耐酸耐碱耐高温需在极端环境下采集样品然后根据所要得到的酶的性质设计菌株分离方法Lee等在印度尼西亚热带地区采集土样60下土样在含有0.5橄榄油乳化液的液体培养基富集产脂肪酶菌株然后以罗丹明B为指示剂用甘油三酯平板法60下培育分离产脂肪酶菌株分离得到一株耐热芽孢杆菌其脂肪酶最适作用温度为75在60°C保温一小时或70°C保温半小时仍保持50初始酶活 [17]表1.1 国内产脂肪酶微生物概况Table 1.1 The figure of lipases production microorganisms in mainland菌名酶活力U/mL研究机构参考文献微球菌Micrococcus 5.6吉林大学酶工程实验室41根霉菌* Rhodobacter.sp 147Ug-1无锡轻工业学院42华根霉Rhizopus chinensis20 无锡轻工业学院45卡门柏青霉P.camembertii 60中国科学院微生物研究所44根霉Rhizopus.sp 50中国科学院成都生物研究所43类产碱假单胞菌Pseudomonas pseudoalcaligenes 26.5福建师范大学生物工程学院46链霉菌* Streptomyces 596浙江工业大学生物工程系47毛霉Mucor sp.15.5山东大学微生物技术国家重点实验室48铜绿假单胞菌Pseudomonas Stutzeri6 吉林大学分子生物学系49液化沙雷氏菌Serrasia liquejaciens 43南京大学生物科学与技术系50芽孢杆菌* Bacillus 100湖北大学生命科学学院51黑曲霉Aspergillus niger 16.4 云南大学生物系52异常毕赤酵母Pichia ananala 20福建师范大学生物工程学院53扩展青霉* Penicillium expansum 1000福建师范大学生物工程学院54褶皱酵母Candida rugosa 19.5 华南理工大学生55假单胞菌Pseudomonas 11.3 无锡轻工业大学56无花果丝孢酵母Trichosp figueroe 30大连轻工业学院食品工程系57丝孢酵母Trichosporon 55山东大学微生物技术国家重点实验室58*表示酶活测定方法与其它不同酶活数值与表中其它菌株酶活值无可比性此外可以通过物理化学诱变细胞杂交蛋白质定向进化以及转基因技术等筛选特殊性质的高酶活菌株Tan等通过紫外NGTN-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidine诱变快中子辐射筛选得一株Candida sp.其酶活从112U/mL提高到1108U/mL[63]Liebeton 等对铜绿假单胞菌脂肪酶Pseudomouas aeruginosa lipase, PAL进行定向进化使其光学选择性突变至野生型得25倍以上[64]1.2.3 脂肪酶活力测定脂肪酶活力测定分两大类定性检测和定量测定定性检测脂肪酶活力主要采用平板法即在含有底物的平板上打孔将酶液加入到孔内然后根据水解圈或变色圈定性分析脂肪酶活力高低如kouker等于1987年报道了一种脂肪酶平板检测法他们以三油酸甘油为底物罗丹明B为指示剂在平板上比较酶液周围荧光圈大小进而判断脂肪酶活力大小[65]常用的定量测定方法有三种碱滴定法PNPB法[17]皂铜法[17]碱滴定法是以橄榄油或三油酸甘油酯和2聚乙烯醇乳化液为底物以1酚酞为指示剂0.05MNaOH中和反应产生的脂肪酸每产生1μg脂肪酸定义为一个酶活力单位PNPB法不同于碱滴定法它以对硝基苯丁酸酯为底物乙腈为溶剂加入酶液反应15分钟然后在405nm下测定反应产生的对硝基苯的吸光度以反应产生的对硝基苯的量评估酶活力测定前需制作对硝基苯吸光度标准曲线皂铜法是以甘油三酯和阿拉伯胶为底物反应产生的脂肪酸用有机溶剂正己烷抽提然后有机相中加入醋酸铜水溶液生成皂铜最后提取有机相加入染色剂二乙基二硫氨基甲酸混合均匀后在430nm测定二乙基二硫氨基甲酸铜的吸光度反应也需制作吸光度标准曲线三种方法中以碱滴定法最为常用该法简单易行操作方便但试验误差较大而且当总酶量很低或总酶活很低时无法检测PNPB法和皂铜法虽然检测灵敏度高但相对操作繁琐而且PNPB法使用的试剂昂贵因此建议酶量和总酶活较高时可以用碱滴定法而当脂肪酶经过凝胶过滤离子交换层析后总酶活较低可以用PNPB法和皂铜法此外尚有一些其它测定方法如在Beisson等报道了甘油氧化法pH 电极自动滴定法油膜表面张力法等[66]因不常用在此不作介绍1.3 脂肪酶发酵生产1.3.1 发酵影响因素微生物发酵生产脂肪酶因菌株不同发酵生产条件亦不相同作者曾对不同菌株产脂肪酶最优化培养条件进行比较发现差异很大如表1.3所列举总体上微生物产脂肪酶发酵分两类:固体发酵和液体发酵法相对液体发酵法固体发酵生产脂肪酶具有简洁经济的优点Bhushan 等以米糠和麦麸为底料培养酵母生产碱性脂肪酶[69]又如Ikram 在30下用麸皮和磷酸盐培养根霉菌72h 然后用液体抽提液抽提得到脂肪酶[70]影响菌株发酵产脂肪酶的因素有氮源碳源底物诱导剂表面活性剂矿物质pH培养温度摇床转速培养时间接种量等为了解菌株发酵特性和得到最优化培养条件研究人员通常设计各种试验研究各个影响因素或者通过比较找到主要影响产酶因素Tan等分别研究了氮源包括有机氮大豆粉大豆饼粉大表1.3 培养条件之比较Table 1.3 Compare of some microbial cultivation condition菌株 最优培养条件参考文献 假单胞菌Pseudomonas sp.黄豆粉 2.51玉米浆2.74可溶性淀粉1.0K 2HPO 40.87, NaNO 30.5, 起始pH9.032150r/min 67铜绿假单胞菌 Pseudomonas stutzeri 大豆1.5 玉米浸出液 3.0葡萄糖0.5橄榄油0.75初始pH7.028150r/min 49 白地霉Geotrichum sp.玉米浸出液1315橄榄油0.6硝酸氨0.830 68 褶皱酵母Candida rugose葡萄糖0.1橄榄油 4.00.3NH 4NO 30.3, K 2HPO 41.2, MgSO 4.7H 2O 0.4,初始pH6.530180r/min, 60h 55链霉菌 Streptomyces糊精1黄豆粉3尿素1K 2HPO 40.05NaCl0.1AEO 90.05, 初始pH9.526 47。
产脂肪酶菌株的筛选、鉴定及发酵培养基优化
was selected and identified as
. The fermentation medium formula was optimized by single factor and response surface methodology as
follows: tributyrin 2.0% ( / ), glucose 9 g/L and urea 8 g/L. Under the condition, the lipase activity was 4.3 U/ml, which was 16.22% higher than that of
将采集的样品分别依次进行富集培养、初筛和初始发 酵复筛。样品经过3次富集培养后，分别取50 滋L菌液上清 涂布于罗丹明B培养基平板，罗丹明B能与脂肪酶降解油脂 产生的脂肪酸特异性结合，产酶菌落周围会生成玫红色， 在波长365 nm紫外灯下呈现橙黄色。将罗丹明B平板放在 波长365 nm紫外灯下进行观察，选取橙黄色圈较大的菌株 进行分离培养，镜检至无杂菌后作为出发菌种，接种于初 始发酵培养基中进行复筛，选出脂肪酶高产菌株[15-17]。 1.3.2 菌种鉴定
富集培养基：酵母膏0.2 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二 钠3.5 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，橄榄油 10 mL，用蒸馏水定容至1 000 mL，121 益灭菌20 min。
初筛罗丹明B培养基[14]：硫酸铵0.5 g，氯化钠4 g，磷酸 氢二钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，琼脂粉15 g，三丁酸甘油脂乳 化液100 mL（4% PVA颐三丁酸甘油脂=3颐1，超声乳化），用 蒸馏水定容至1 000 mL，121 益灭菌20 min后，待温度降至 60 益时加入1 mL罗丹明B 溶液（质量浓度＜10 mg/mL），混 匀后倒平板。
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2 脂肪酶高产菌株筛选
2.1 前言
常见的筛选脂肪酶高产菌的方法是含甘油三酯琼脂平板法，我们以橄榄油为底物，溴甲酚紫为指示剂，通过平板法筛选脂肪酶高产菌株。
2.2 材料和方法
2.2.1 土样
从襄樊、武汉、十堰等地的油脂厂、油坊、奶牛场、食堂采集土样208份。
2.2.2 设备与试剂
本试验所用到的药品试剂除橄榄油外均为分析纯；橄榄油为国药集团化学试剂有限公司生产，化学纯。
试验仪器和设备如下：
OHAUS分析天平AR1530 奥豪斯国际贸易有限公司
乳化机CZD3 上海氟鲁克流体机械制造有限公司
磁力搅拌器79-2 金坛市新航仪器厂
灭菌锅YX-400B 上海三申医疗器械有限公司
超净工作台SW-CT-2FD 苏州净化设备有限公司
生化培养箱SPX-150B-Z上海博迅实业有限公司医疗设备厂
2.2.3 溶液配制
2％（w/v）的聚乙烯醇水溶液：称取聚乙烯醇固体20g，倾入1000mL蒸馏水中，然后边加热边搅拌直到聚乙烯醇全部溶解。
静置冷却至室温备用。
若有少量杂质不溶解，可通过滤纸过滤去除杂质。
橄榄油乳化液：分别量取橄榄油25mL和2％聚乙烯醇水溶液75mL，混合，置4℃平衡1h，然后10000r/min乳化三次，每次一分钟。
4℃保存备用。
若高温灭菌后产生分层，可充分振荡至分层现象消失，而无需重新乳化。
2.2.4 筛选培养基
平板粗筛培养基（％）：酵母膏0.1，蛋白胨0.2，硫酸铵0.2，橄榄油乳化液1.2，磷酸氢二钾0.1，氯化钾0.05，硫酸镁0.05，硫酸亚铁0.001，琼脂1.5。
平板复筛培养基组成（％）：蛋白胨1.0，蔗糖0.5，橄榄油乳化液1.2，硫酸铵0.1, 磷酸氢二钾0.1,氯化钾0.1,硫酸亚铁0.001，琼脂1.5。
摇瓶复筛液体培养基（％）:蛋白胨2.0，蔗糖1.0，橄榄油乳化液1.0，硫酸铵0.5，硫酸镁0.05，磷酸氢二钾0.2。
筛选培养基于121℃灭菌20min，平板粗筛培养基和平板复筛培养基从灭菌锅取出后，每升培养基冷却到60℃加入无菌的10mg/mL溴钾酚紫10mL，混匀，趁热倒平板。
2.2.5 筛选方法
平板初筛：称取10g土样，倾入100mL无菌水中，充分振荡10min后，移取1mL梯度稀释至10－6倍浓度，取10－4～10-6稀释液20µL～50µL涂平板，28℃培养72h，挑选有黄色变色圈和透明圈菌落，经划线或无菌水梯度稀释平板培养获得单菌落，PDA试管保藏供平板复筛。
平板复筛：将粗筛菌种穿刺接种在复筛平板上，每平板（d9cm）可接三株，于28℃培养72h。
挑选变色圈和透明圈较大的菌株进行摇瓶复筛。
摇瓶复筛：平板复筛挑选出的菌株进行摇瓶复筛，250mL三角瓶装液50mL,28℃, 200r/min培养72h。
发酵液离心（3000r/min,15min），取上清液测酶活。
脂肪酶活力测定：滴定法测酶活[109]。
酶活力测定以橄榄油乳化液为底物, 底物4mL、Tris·HCl（pH7.20, 50mmol/L）5mL、发酵上清液1mL组成10mL反应体系，31℃水浴反应十分钟，然后加入95％乙醇10mL终止反应。
酶催化水解脂肪酸量通过0.05mol/L NaOH滴定测得，加二滴1％酚酞指示滴定终点。
在上述条件下，水解橄榄
油每分钟产生1µmol游离肪酶酸所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。
2.3 结果和讨论
208份土样经粗筛、平板复筛得产脂肪酶菌79株，然后分别发酵并测酶活，得酶活力在5.0U/mL以上菌6株，结果见表2.1。
其中F044活力最高，为11.18U/mL。
后鉴定为Aspergillus sp.。
表2.1 筛选结果
Table 2.1 The screening results of lipase-prodction microorganisms
K－1－1
3.4.21C40
F044
菌株 4.4.2
T.4.2
酶活（U/mL）7.00 5.25 11.18 8.50 9.05 8.30 分类青霉曲霉黑曲霉根霉毛霉青霉脂肪酶产生菌的筛选工艺相对比较成熟，本文在现有的筛选方法上进行了一些改进，将橄榄油为唯一碳源的粗筛平板改为低营养粗筛平板，在摇瓶复筛前插入富营养油脂平板复筛。
在筛选过程中，发现许多菌株在初筛平板上出现了较大的变色圈，然后进行摇床发酵不能检测出酶活。
原因可能是我们在初筛时以溴甲酚紫为指示剂，而一些菌株产生有机酸，也能够使菌株在平板上出现变色圈，另外，初筛平板碳源以橄榄油为碳源的低营养培养基，一些野生菌株在低营养时为了生长表现出脂肪酶活性，但在富营养的时候可能就不在需要表现出脂肪酶活性。
而作为工业生产所需的菌种既要能够高产脂肪酶，又要具有经济效益，以橄榄油为碳源不仅价格昂贵，而且不能促使菌株很好的生长，生物量不高，故而我们在初筛和复筛间插入平板复筛，一方面从变色圈的有无和是否有透明圈剔除部分产酸菌株和不产脂肪酶菌株，另外一方面由于在初筛平板经过长时间培养，菌株生长情况复杂，会出现菌落间交接、重叠的情况，直接判断其是否产脂肪酶有一定的困难，通过复筛平板在相对简单的情况下比较变色圈和透明圈大小判断菌株酶活有无和高低，易行且可靠，在一定程度上增大了产脂肪酶野生菌株在粗筛平板上出现的概率，另外平板复筛又缩减了后期摇瓶复筛的工作。