蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量实验报告
酶_DNS比色法测定酵母海藻糖的研究
第32卷第2期 2002年6月工业微生物Industrial M icrobiologyVol.32No.2June 2002*天津市自然科学基金资助项目(编号:013609711)酶 DNS 比色法测定酵母海藻糖的研究*王 兰, 肖冬光, 张 正(天津轻工业学院,天津300222)摘 要 确定了以酶 DNS 比色法定量测定酵母海藻糖的方法,并对可能影响测定的因素进行了研究。
结果表明,酶 DNS 比色法无设备条件要求限制,且快速、准确、特异性强。
关键词:海藻糖; 酶法分析; DNS 比色法; 酵母 海藻糖是一种广泛存在于自然界的由二个葡萄糖分子经a,a 1,1糖苷键结合而成的非还原性双糖,它的结构稳定,化学惰性,无毒性。
因它对膜及蛋白质具有独特的保护作用而引起了人们的高度重视,目前已在医药、食品、化妆品、农业等方面具有广泛的应用价值,成为了一项极有应用和开发前景的产品[1~3]。
目前最普遍采用的海藻糖分析方法是蒽酮比色法,它有费用低、操作简便等优点,但由于极易受到能同蒽酮反应的物质的干扰,所以其测定结果往往重现性不好易产生波动[4]。
近几年来又发展起了酶法及H PLC 法。
酶法即是利用海藻糖特异性的分解酶对海藻糖进行分解,使其转化为二分子葡萄糖,然后再利用葡萄糖氧化酶及过氧化物酶测定所产生的葡萄糖[5~7]。
这种方法虽然比蒽酮法精确,但使用酶类及影响因素较多,不易控制。
HPLC 法是目前最为精确的海藻糖定性、定量方法[4],但这种方法的推广不仅会受到设备条件的限制,而且因对样品的纯度要求高,无法对提取过程中的中间试样进行测定,给研究工作带来了一定的困难。
因此,找到一种既准确又简便的海藻糖测定方法已成为目前研究工作的当务之急。
本实验首先利用对海藻糖具有特异性分解作用的海藻糖分解酶将一分子海藻糖分解成二分子葡萄糖[8],然后再利用二硝基水杨酸法测定所产生的葡萄糖,从而定量测定海藻糖。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种面包酵母BY 11(本实验室保存)1.1.2 主要试剂标准海藻糖(Sig ma 公司生产),TREHALASE (Sigma 公司生产),3,5-二硝基水杨酸。
实验一总糖的测定-蒽酮比色法
实验一总糖的测定-蒽酮比色法一、实验目的（1）学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。
（2）学习723型分光光度计的原理和操作方法。
二、实验原理总糖是指样品中的还原糖及在本法测定条件下水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。
蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。
其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糠醛衍生物后与蒽酮（C14H10O）缩合成蓝色化合物。
溶液含糖量在每毫升150微克以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。
蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接起作用，样品不必经过水解。
三、实验材料、器材与试剂1、材料白薯。
2、器材（1）试管（或具塞试管）及试管架；（2）吸量管；（3）沸水浴；（4）冰浴；（5）723型分光光度计。
2、试剂（1）蒽酮试剂：称取100mg蒽酮溶于100mL98%硫酸溶液（A.R）中，用时配制。
（2）葡萄糖标准溶液（100μg/mL）:精确称取100mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定容至1000mL。
（3）样品溶液：称取500g市售白薯，洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4层纱布压滤、弃滤液留渣，将渣放入烘箱内80℃～85℃烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细，过筛区100目筛下物为待测样品。
（也可用市售红薯面粉代替）取样品在烘箱内150烘干，恒重后，精确称取1～5g，置于锥形瓶中，加入80mL沸蒸馏水，放入沸水浴。
不时摇动，提取半小时。
取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤，合并滤液。
冷却至室温，用蒸馏水定容至100mL。
四、实验方法(1)制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，编号后按下表操作。
每管加入葡萄糖标准液和谁后立即混匀，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂后，同时置于沸水浴中，准确加热7分钟，立即取出置于冰浴中迅速冷却。
待各管溶液达室温后，用1cm厚度的比色皿，以第一管为空白，在620nm处迅速测其余各管的光吸收值。
然后以第2～7管溶液含糖量μg数为横坐标，吸光度（A620nm）为纵坐标，画出含糖量与A620nm 的相关标准曲线。
蒽酮法测还原糖
总糖的含量的测定（蒽酮法）一、实验目的掌握蒽酮比色法测定糖的原理与方法。
二、实验原理蒽酮比色法是一个快速而简便的测定糖方法。
蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基、戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620 nm 处有最大吸收。
蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。
当样品中存有含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈红色。
对于以上特定的糖类反应较稳定。
三、实验器材1.吸管2.试管3.分光光度计4.水浴锅5.电炉6.电子分析天平四、实验试剂1．蒽酮试剂：取2 g蒽酮溶于1000 ml体积分数为80 %的硫酸中，当时配制使用。
2．标准葡萄糖溶液（0.1 mg/ml）：100 mg葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000 ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。
3． 6 mol/l HCl溶液。
4．10 % NaOH溶液：称取10 g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100 ml。
五、实验操作1.制作标准曲线取干净试管7支，按下表进行操作。
表蒽酮比色法测定糖含量的标准曲线制作2.样品的处理（见实验四）取上述实验四的水解液，冷却后用10 % NaOH溶液中和至pH呈中性，然后用蒸馏水定容至100 ml，过滤，取滤液10 ml，用蒸馏水定容于100 ml成稀释1000倍的总糖水解液，用于糖含量的测定。
测定时取1 ml总糖水解液测定还原糖的含量（同标准曲线）。
样品中糖含量的计算：w —糖的质量分数（%）；C —从标准曲线上查出的糖质量浓度(mg/ml)； V —样品稀释后的体积（ml ）；m —样品的质量（mg ）。
ｗ＝ CVｍ ×100%。
实验十蒽酮比色法测定植物组织中总糖和可溶性糖的含量
实验十蒽酮比色法测定植物组织中总糖和可溶性糖的含量一、实验目的掌握蒽酮法测定总糖和可溶性糖含量的原理和方法。
二、实验原理蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。
酸可使糖类（如已糖基，戊醛糖及已糖醛酸）脱水生成糠醛，生成的糠醛或烃甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在620nm处有最大光吸收值。
在10~100ug范围内其他颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。
当存在含有较多色氨酸蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。
而对于上述特定的糖类物质，反映较稳定。
多糖和寡糖可用酸水解成单塘和蒽酮试剂反应，因此利用蒽酮法可测组织中总糖和可溶性糖。
这一种方法具有很高的灵敏度，糖含量在30ug左右时就能进行测定，所以可作为微量测糖之用。
一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
三、仪器，试剂和材料1．仪器（1）分光光度计；（6）漏斗，漏斗架个6个（2）电子天平；（7）容量瓶：50ml2个；（3）三角瓶：50ml2个（8）移液管；（4）刻度具塞试管；10ml13支；（9）水浴锅。
（5）试管架，试管夹各2个；2．试剂（1）葡萄糖标准液：100ug/ml；（2）浓硫酸；（3）蒽酮试剂：0.2g蒽酮，溶于100ml浓流酸中，现当日配制使用。
3．材料小麦幼苗分蕖节或其植物的幼嫩组织（大白菜心）。
四、操作步骤1．葡萄糖标准曲线的制作取7支试管，按下表配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液；管号1234567葡萄糖标准液/mL00.10.20.30.40.50.6蒸馏水/mL 1.00.90.80.70.60.70.8葡萄糖含量/ug0102030405060在每支试管中，加入蒽酮试剂4.0ml，迅速浸入冰水浴中冷却。
各加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。
自水浴重新煮沸起，准确煮沸10min取出，用流水冷却，室温放置10min，在620nm波长下比色。
以标准葡萄糖含量（ug）做横坐标，以吸光值作纵坐标，做出标准曲线。
总糖的测定蒽酮比色方法
总糖测定——蒽酮比色法一、原理：单糖类遇浓硫酸时，脱水生成糠醛衍生物，后者可与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物，当含糖量在20～200mg/L范围内时，其呈色强度与溶液中糖的含量成正比，故可比色定量。
二、试剂：1、10～100ppm葡萄糖系列标准溶液：称取1.0000g葡萄糖，用水定容至1000ml，从中吸取1、2、4、6、8、10ml分别移入100ml容量瓶中，用水定容，即得浓度为10、20、40、60、80、100ppm（ug/ml）葡萄糖系列标准溶液。
2、0.1%蒽酮溶液：称取0.1g蒽酮，溶于100ml72%硫酸中，贮存于棕色瓶中，于0～4℃下存放。
3、72%硫酸溶液。
三、测定方法：（一）样品处理：称取适量样品，用100ml水转移至250ml容量瓶，慢慢加入5ml乙酸锌和5ml亚铁氰化钾，沸水浴5～10min，定容，静置至上清，过滤。
根据估计含糖量，去滤液进行稀释，使糖含量在20～80mg/L范围内。
（二）测定吸取系列标准溶液、样品溶液（含糖20～80ppm）、蒸馏水（空白）各2ml，分别加入具塞比色管中，沿管壁各加入蒽酮试剂10ml，立即摇匀，放入沸水浴中准确加热10min，取出，迅速冷却至室温，在暗处放置10min，用1cm比色杯，以零管调仪器零点，在620nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
根据样品溶液的吸光度查标准曲线，得糖含量。
四、结果计算：总糖（以葡萄糖计，%）=c×稀释倍数×10-4式中：c：从标准曲线查得的糖浓度，ppm（ug/ml）；10-4：将ppm换算为%的系数五、说明与讨论1、该法是微量法，适合于含微量碳水化合物的样品，具有灵敏度高，试剂用量少等优点。
2、该法按操作的不同可分为几种，主要差别于蒽酮试剂中硫酸的浓度（66～95%），取样量（1～5ml）、蒽酮试剂用量（5～20ml）、沸水浴中反应时间（6～15min）和显色时间（10～30min）。
这几个操作条件之间是有联系的，不能随意改变其中任何一个，否则将影响分析结果。
蒽酮法实验报告
一、实验目的1. 熟悉蒽酮法检测还原糖的基本原理和方法。
2. 掌握蒽酮试剂的配制和操作步骤。
3. 通过实验，学会运用蒽酮法检测还原糖含量。
二、实验原理蒽酮法是一种检测还原糖的经典方法。
其原理是还原糖在酸性条件下，能与蒽酮发生显色反应，生成红色化合物。
根据溶液颜色的深浅，可以计算出还原糖的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 标准葡萄糖溶液- 样品溶液- 蒽酮试剂- 醋酸- 硫酸- 水浴锅- 移液管- 比色皿- 分光光度计2. 实验仪器：- 实验台- 电子天平- 移液器- 烧杯- 滴定管- 玻璃棒四、实验步骤1. 配制蒽酮试剂：- 称取0.1g蒽酮，加入100mL醋酸溶液，溶解后转移至1000mL容量瓶中，用醋酸溶液定容至刻度。
2. 标准曲线的制作：- 分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL标准葡萄糖溶液于6个试管中，依次加入5mL蒽酮试剂，混匀后放入水浴锅中加热10分钟。
- 取出试管，冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL。
- 使用分光光度计在波长620nm处测定吸光度。
- 以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
3. 样品溶液的制备：- 称取一定量的样品，加入适量的蒸馏水，溶解后定容至100mL。
4. 样品溶液的测定：- 分别吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL样品溶液于6个试管中，依次加入5mL蒽酮试剂，混匀后放入水浴锅中加热10分钟。
- 取出试管，冷却至室温，用蒸馏水定容至10mL。
- 使用分光光度计在波长620nm处测定吸光度。
5. 还原糖含量的计算：- 根据样品溶液的吸光度，从标准曲线中查得相应的葡萄糖浓度。
- 根据样品溶液的体积和浓度，计算还原糖含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：- 标准曲线的线性范围为0.5～2.5mg/mL。
2. 样品溶液的测定：- 样品溶液的吸光度在标准曲线的线性范围内。
3. 还原糖含量的计算：- 样品溶液的还原糖含量为（计算值）mg/mL。
平菇中海藻糖的提取与含量测定
平菇中海藻糖的提取与含量测定作者：李仁茂黄健华来源：《安徽农业科学》2014年第11期摘要 [目的]对平菇中的海藻糖进行定性和定量分析。
[方法]以平菇为试验材料，以热乙醇为抽提液，用纸层析进行定性分析，以蒽酮比色法进行定量测定。
[结果]平菇（含水量为85%）中含有海藻糖，其含量为2.06%，干燥平菇中海藻糖含量则为13.7%。
[结论]该研究可为海藻糖的提取和开发提供依据。
关键词平菇；海藻糖；提取；含量；测定中图分类号 S646.1+4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03369-03Abstract [Objective] To make qualitative and quantitative analysis of trehalose in Pleurotus Ostreatus. [Method] The qualitative analysis was performed by paper chromatography， and the quantitative determination was conducted by anthrone spectrophotometry using Pleurotus Ostreatus as experiment material， hot alcohol as extracting reagent. [Results] The results showed that there is trehalose in Pleurotus Ostreatus which contain 85% water， in which the content of trehalose is2.06%， while its content in dry Pleurotus Ostreatus is 13.7%. [Conclusion] This study will provide certain basis for extraction and development of trehalose.Key words Pleurotus Ostreatus； Trehalose； Extraction； Content； Determination海藻糖是蔗糖的同分异构体，基本性质同其他双糖，但海藻糖还有其他不同的功能。
蒽酮比色法[宝典]
![蒽酮比色法[宝典]](https://img.taocdn.com/s3/m/4776734776232f60ddccda38376baf1ffc4fe367.png)
蒽酮比色法蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。
蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。
本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。
蒽酮比色法测糖试验蒽酮比色法测定多糖含量1、蒽酮比色法测糖试验一实验目的掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法二实验原理蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。
三实验器材及试剂马铃薯干粉可调试移液器或移液管可见分光光度计（723型）电子分析天平水浴锅电炉子蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。
标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml 备用。
四、操作1.制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。
以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml ）为横坐标作图得标准曲线。
表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色葡萄糖浓度（mg/ml）2.样品含量的测定样品液的制作：精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出，3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中样品液的测定：（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm 处比色测量各管OD值。
（3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。
3．结果计算：C×Vw = ————×100%m，式中w：糖的质量分数（%）C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml）V：样品稀释后的体积（ml）m：样品的质量（ml）2、蒽酮比色法测定多糖含量一试验原理植物在个体发育的各个时期，代谢活动也发生相应的变化，碳水化合物的代谢也不例外，其含量也随之发生变化。
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4）使用离心机要注意哪几个问题？
两侧必须配平，注意安全。
5）53WB 分光光度计的原理及操作注意事项是什么？ 原理：
分光光度计测量的是分子内电子跃迁产生的带状吸收光谱。根据不同的特征峰可以进行
定性测量，根据朗伯比尔定律可以进行定量测量。
注意事项：
溶液必须为均匀溶液，拿放石英皿要轻拿轻放，注意透光侧的光洁。
1.海藻糖含量的计算
舍去偏差较大的第三个数据点，作图如下：
0.9 0.319
Unknown 0.447
吸光度A
吸光度-糖含量标准曲线
0.35 0.3
0.25 0.2
0.15 0.1
0.05 0 0
y = 0.3653 x R²= 0.9812
0.2
0.4
0.6
0.8
1 糖含量ml
图 1. 吸光度-糖含量标准曲线
在拟合直线时选择了固定截距为 0。
标准曲线方程为 y=0.3653x，相关系数 R2=0.9812。
由标准曲线得到 0.447 吸光度对应的糖含量为 1.22ml。
则酵母菌中海藻糖含量为
2.实验结果与讨论
1.22 × 0.95 × 40 × 3
ω=
30
× 100% = 46.36%
第三个实验点出现了较大的偏差，分析可能的原因是试管内还有杂质，导致显色反应程
0
0.3
0.6
0.9
平均值
8. 教师审阅意见：
Unknown
3
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
第二部分：实验报告
二、实验记录
实验现象： 沸水浴加热中溶液由黄色变为绿色，浓度不同则颜色深度不同。 整理后的数据如下：
表三、实验数据整理
糖浓度/mL
0
0.3
0.6
吸光度
0
0.139
1.760
三、实验结果及讨论
称量药品一定要准确 加入蒽酮操作上需要尽快操作，但要确保安全 注意离心机与分光光度计的使用
6. 要采集的数据
温度，压力，湿度（有则记录），糖浓度，吸光度
7. 原始记录表
温度：
压力：
湿度：
5 未知样 1ml
1 8 10
2
糖浓度/mL 吸光度
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
表二、原始实验数据记录
度加剧。
4
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
3.思考题： 1）加蒽酮试剂时为什么盛有样品的试管必须浸入冰水中冷却？ 保证安全，防止过早进行反应。
2）煮沸样品时为什么“准确”煮沸 10min？ 由于蒽酮试剂与糖的显色强度随时间变化，所以要准确控制时间，本实验中 6min 即可。 3）在沸水浴中加热样品，为什么要打开试管盖？ 使得试管内外气压相等，沸水浴的温度即为其恒压沸点的温度。
六、指导教师批阅意见
表四、实验报告评分表
实验预习
实验记录
结果及讨论
自评 总分
实验原 预习思 实验现 原始数 计算举 数据图 结果讨
理
考
象
据
例
表
论
10
10
10
10
10
15
15
20
8
指导教师批阅意见：
5
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
教师签名 日期
6
沸水浴、冰水浴、53WB 分光光度仪器
↓ 称量 30mg 干酵母
↓ 加入 3mlTCAaq
↓ 离心，取上清液稀释 40 倍
↓ 配制蒽酮溶液
↓
1
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
取 5 支编号试管，加如下溶液
↓ 表一、溶液配制组成
编号
1
2
3
4
葡萄糖/ml
0
0.3
2.1 酵母菌中海藻糖→TCAaq
2.2 海藻糖→葡萄糖→糖醛
2.3 糖醛+蒽酮→蓝绿色复合物→分光光度计测量
3. 试剂与仪器
1） 化学试剂
2g/L 蒽酮试剂：称取 0.10g 蒽酮溶于 50ml80%（体积分数）H2SO4 中，0.1g/L 标准葡萄 糖溶液，5g/L 三氯乙酸水溶液（TCA）。
2） 测量仪器
实验 4 蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
化工专业实验报告
第一部分：实验预习
实验名称
蒽酮比色法测定酵母菌中海藻糖含量
一、实验预习
1. 实验目的
1.1 培养安全意识，注意安全；
1.2 掌握用三氯乙酸（TCA）抽提法提取酵母菌中海藻糖的方法；
1.3 掌握用蒽酮比色法测定海藻糖含量的原理和方法。
2. 实验原理
0.6
0.9
蒸馏水/ml
2
1.7
1.4
1.1
蒽酮/ml
8
8
8
8
总计/ml
10
10
10
10
↓ 立即放入冷水中，冷却后拿出混匀，在放入冷水中
↓ 打开试管盖，擦净外壁与试管盖的液体
↓ 沸水浴 6min，观察现象
↓ 放入自来水中冷却
↓ 测量吸光度，处理数据
↓ 整理好实验台 5. 注意事项 注意实验的人身安全与仪器安全
四、自评
这次实验在张老师的带领下收获颇多。首先在实验中老师反复强调了安全的重要性，这
让我加强了自己的安全意识。在实验流程的书写、数据处理的规范上老师也让我了解了正确
的做法，这些均对于我以后的科研生活有着很大的帮助，希望能够在以后的实验中越做越好。
五、参考文献
[1]王保国，化工过程综合实验（第 2 版），清华大学出版社，北京，2009 年 10 月。