胎儿染色体非整倍体产前诊断中的应用

关键词 染色体畸变； 原位杂交，荧光； 染色体非整倍体； 产前诊断； 羊水
传统的羊水细胞遗传学诊断具有许多无法克 服 的 局 限 性 ，如 培 养 耗 时 长 （１０ ～ １４ ｄ），技 术 稳 定 性差等， 尤其是对染色体的嵌合现象很难作出解 释，这是因为中期分裂相的数目较少，往往不能提 供足够的分析信息。 荧光原位杂交（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， ＦＩＳＨ） 技 术 ， 将 分 子 生 物 学 和 细 胞遗传学技术相结合， 可以很好地克服上述局限 性，将其应用于未培养的羊水间期细胞，分析大量 的细胞以获得足够的信息，可于羊膜腔穿刺后 ２４ ｈ 内 快 速 诊 断 胎 儿 染 色 体 数 目 异 常 ［１］。 本 研 究 采 用
传统的羊水细胞遗传学诊断有许多无法克服 的局限性。 核型分析需要经过细胞培养，且制片过 程 繁 杂 ，存 在 培 养 、显 带 失 败 等 可 能 ； 至 少 要 １０ ～ １４ ｄ 出报告。 ＦＩＳＨ 只需 ５ ｍＬ 羊水，无需培养，２４ ｈ 即可出结 果 ，步 骤 操 作 简 便 ，结 果 清 晰 易 辨 。 ＦＩＳＨ 对于细胞的分裂周期没有特殊的要求，标本来源丰 富，可以用于细胞分裂中期和间期的细胞，无需细 胞培养，不存在培养失败的问题。 本研究应用 ＦＩＳＨ 技术，对 ２７５ 例未培养的羊水间期细胞进行染色体 数目异常的产前诊断，与传统的羊水细胞培养染色 体核型分析结果对照，一致性为 １００％，这与国内外 文献报道的 ＦＩＳＨ 在染色体非整倍体的检测中有高 特异性和灵敏性是相一致的 ［５］。
实 用 医 学 杂 志 ２０１２ 年 第 ２８ 卷 第 １ 期
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ａｒｔｅｒｙ ｆｉｓｔｕｌａｓ ｉｎ Ｔｕｒｋｉｓｈ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｃａｒｄｉａｃ ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ， ２００３，５７（２）：２８０－２８３． ［３］ Ｉａｄａｎｚａ Ａ， ｄｅｌ Ｐａｓｑｕａ Ａ， Ｆｉｎｅｓｃｈｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｒｅｅ鄄ｖｅｓｓｅｌ ｌｅｆｔｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｉｃｒｏｆｉｓｔｕｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ： ａ ｒａｒｅ ｃａｓｅ ｏｆ ａｎｇｉｎａ ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ， ２００４，９６（１）：１０９－１１１． ［４］ Ｕｍａｎａ Ｅ， Ｍａｓｓｅｙ Ｃ Ｖ， Ｐａｉｎｔｅｒ Ｊ Ａ． Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｏ ａ ｌａｒｇｅ ｃｏｒｏｎａｒｙ鄄ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｓｔｕｌａ［Ｊ］． Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ， ２００２，５３（３）：３５３－３５７． ［５］ Ｆｕｊｉｍｏｔｏ Ｎ， Ｏｎｉｓｈｉ Ｋ， Ｔａｎａｂｅ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｔｗｏ ｃａｓｅｓ ｏｆ ｇｉａｎｔ ａｎｅｕｒｙｓｍ ｉｎ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｆｉｓｔｕｌａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｃｈａｎｇｅ ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ，２００４，９７ （４）：５７７－ ５７８． ［６］ Ｇｏｗｄａ Ｒ Ｍ， Ｖａｓａｖａｄａ Ｂ Ｃ， Ｋｈａｎ Ｉ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｆｉｓｔｕｌａｓ： ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ， ２００６，１０７（１）：７－１０． ［７］ Ｋｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙ Ｋ Ｍ， Ｒａｏ Ｓ． Ｔｒａｎｓｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉｏｖｅｎｏｕｓ ｆｉｓｔｕｌａ ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ
胎 儿 和 新 生 儿 最 常 见 的 染 色 体 异 常 为 Ｘ、Ｙ 染 色 体 以 及 １３ 号 、１８ 号 和 ２１ 号 染 色 体 的 数 目 异 常（占全部异常的 ９５％以上），染色体结构异常仅占
万方数据
极 少 数 ， 故 用 １８ 号 、Ｘ、Ｙ 染 色 体 着 丝 粒 探 针 以 及 １３ｑ１４ 和 ２１ｑ２２ 特异性探针，对 未 培 养 的 羊 水 间 期 细胞进行 ＦＩＳＨ， 即可发现大多数胎儿的染色体异 常 ［３］。 目前，国内 已 广 泛 开 展 了 孕 中 期 母 血 清 生 化 标志物筛查唐氏综合征及 １８ 三体综合征， 筛查阳 性 率 约 为 ５％ 左 右 ［４］，对 高 危 孕 妇 应 用 上 述 ５ 种 探 针进行 ＦＩＳＨ 检测可以达到确诊的目的， 避免患儿 出生，对提高人口素质，降低出生缺陷率具有重要 意义。
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１ ５００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １１ ｍｉｎ，去上清，用 ５ ｍＬ 胶原酶 Ｂ （０．００５ ｇ ／ ５ ｍＬ Ｈａｎｋ′ｓ ＢＳＳ） 重 新 吹 打 悬 浮 细 胞 ， ３７℃水浴 ３０ ｍｉｎ。 常规低渗固 定 后 滴 片 ，５６℃老 化 玻片 ３０ ｍｉｎ。 （２）杂交：采用北京金菩嘉公司的 １８ 号、Ｘ、Ｙ 染色体着丝粒探针以及 １３ｑ１４ 和 ２１ｑ２２ 特 异性探针进行杂交［２］。 ３７℃水浴中 ＲＮａｓｅ Ａ 处理玻 片 １５ ｍｉｎ，２ × ＳＳＣ 漂洗 ２ 次。 ０．１ ｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＨＣｌ 中 浸泡玻片 １０ ｍｉｎ，２ × ＳＳＣ 漂洗 ２ 次。 ３７℃水浴中胃 蛋白酶作用 １０ ｍｉｎ，２ × ＳＳＣ 漂洗 ２ 次。 －２０℃预冷 的 ７０％乙 醇 、８５％乙 醇 中 各 ２ ｍｉｎ 脱 水 ，１００％ 乙 醇 中室温 浸 泡 １０ ｍｉｎ，自 然 干 燥 玻 片 后 加 热 至 ５６℃。 将 玻 片 置 于 ７３℃ 变 性 液 中 ５ ｍｉｎ。 －２０℃ 预 冷 的 ７０％乙醇、８５％乙醇、１００％乙醇中各 ３ ｍｉｎ 脱 水 ，自 然干燥玻片后加热至 ４６℃。 探针置于 ７３℃水 浴 中 变性 ５ ｍｉｎ。 加探针，盖上盖玻片，胶封片，４２℃湿盒 ２ ｈ。 杂交完毕后洗去 非 特 异 信 号 。 （３） 镜 检 ：加 ＤＡＰＩ 复染后 在 Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ鄄５１ 荧 光 显 微 镜 下 观 察 信 号 ，其 中 １３ｑ１４ 和 ２１ｑ２２ 两 种 探 针 为 一 组 ，对 应 的荧光信号分别为绿色和红色；１８ 号、Ｘ、Ｙ 染色体 着丝粒探针为一组， 对应的荧光信号分别为蓝色， 绿色和红色。 １．２．３ ＦＩＳＨ 结 果 分 析 每 个 ＤＮＡ 探 针 至 少 随 机 计数 ５０ 个细胞。 （１）如果 ＞ ９０％的细胞核显示为正 常信号则为正常核型；（２） 如果 ＞ ６０％的细胞核显 示 为 异 常 信 号 则 为 异 常 核 型 ；（３ ）如 果 无 法 判 读 ， 扩 大计数 １００ 个细胞，以判断最后结果；（４）如果非整 倍体信号为 １０％～６０％，则表明可能存在嵌合型，则 须扩大计数 ２００ 个细胞，且对大量中期分裂相做进 一步细胞遗传学分析。 １．２．４ 羊水细胞培养及收获 取 ２０ ｍＬ 羊水离心， 取沉淀物 ０．５ ｍＬ 加入 ４．５ ｍＬ 张氏培养液， 在培养 瓶内混匀， 放入 ３７℃， ５％ ＣＯ２ 培养箱内培养，５ ｄ 后隔天观察换液，１０ ～ １２ ｄ 传代培养， 用 ＥＤＴＡ 胰 酶洗脱细胞后再加入培养液培养过夜，按常规收获 细胞。 羊水细胞 Ｇ 带染色体制备按常规进行。 ２ 结果
２７５ 例产前诊断者羊水染色体检测中， 胎儿 染 色 体 数 目 正 常 者 ２６６ 例 （ 其 中 ４６，ＸＸ １３０ 例 ， ４６，ＸＹ １３６ 例）， 染色体数目异常者 ９ 例， 其中 ２１ 三体 ７ 例，４７，ＸＸＸ １ 例，４７，ＸＹＹ １ 例。 所有 ＦＩＳＨ 结果均与培养后的羊水染色体核型分析结果吻合， ２１ 三体引产后经脐血细胞染色体核型分析证实。 ３ 讨论
Ｃａｒｄｉｏｌ， ２００４，９６（２）：２８１－２８３． ［８］ Ｆａｒｏｏｋｉ Ａ Ｑ， Ｎｏｗｌｅｎ Ｔ， Ｈａｋｉｍｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ
ａｒｔｅｒｙ ｆｉｓｔｕｌａｅ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ １８ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｌｏｓｕｒｅ ［Ｊ］． Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃａｒｄｉｏｌ， １９９３，１４ （２）：２０８ － ２１３． ［９］ Ｊａｆｆｅ Ｒ Ｂ， Ｇｌａｎｃｙ Ｄ Ｌ， Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｓ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉａｌ鄄 ｒｉｇｈｔ ｈｅａｒｔ ｆｉｓｔｕｌａｅ． Ｌｏｎｇ鄄ｔｅｒｍ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｖｅｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ［Ｊ］． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， １９７３，４７（２）：１３３－１４３． ［１０］ Ｋａｍｉｙａ Ｈ， Ｙａｓｕｄａ Ｔ， Ｎａｇａｍｉｎｅ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｓｕｒｇｉｃａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｆｉｓｔｕｌａｓ： ２７ ｙｅａｒｓ′ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ａｎｄ ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ［Ｊ］． Ｊ Ｃａｒｄ Ｓｕｒｇ， ２００２，１７（２）：１７３－ １７７． ［１１］ Ｓａｉｄ Ｓ Ａ， Ｌａｍ Ｊ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｅｒｆ Ｔ． Ｓｏｌｉｔａｒｙ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｆｉｓｔｕｌａｓ： ａ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｎｏｍａｌｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ． Ａ ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ ｒｅｖｉｅｗ ［Ｊ］． Ｃｏｎｇｅｎｉｔ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓ， ２００６，１（３）：６３－ ７６．
ｄｏｉ：１０．３９６９ ／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００６鄄５７２５.201２.０１．0４７ 基金项目：湖北省卫生厅青年科技人才基金资助项目（编号： ＱＪＸ２００８－１３） 作 者 单 位 ：４３００７０ 武 汉 市 ，湖 北 省 妇 幼 保 健 院 产 前 诊 断 中 心
万方数据
１８号、Ｘ、Ｙ 染色体着丝粒探针以及 １３ｑ１４ 和 ２１ｑ２２ 特异性探针， 将 ＦＩＳＨ 应用于未培养的羊水间期细 胞进行胎儿染色体非整倍体的产前诊断，现报告如 下。 １ 对象与方法 １．１ 研究对象 选择 ２００９ 年 １ 月至 ２０１０ 年 １２月 经我院遗传咨询门诊接诊后认为需进行产前诊断 者 ２７５ 例 ，年 龄 １９ ～ ４８ 岁 ， 孕 １８ ～ ２３ 周 ， 产 前 诊 断 指 征 包 括 孕 妇 年 龄 大 于 ３５ 岁 ４８ 例 ， 唐 筛 高 危 ２０２ 例，不良孕产史 １５ 例，Ｂ 超异常 １０ 例。 １．２ 研究方法 １．２．１ 羊水采集［２］ 在 Ｂ 超引导下，用 ２１Ｇ ＰＴＣ 穿 刺 针 经 腹 抽 取 羊 水 ２５ ｍＬ，置 于 无 菌 离 心 管 中 ， 其 中 ５ ｍＬ 用于 ＦＩＳＨ 检测，２０ ｍＬ 用于细胞培养。 １．２．２ 羊 水 细 胞 ＦＩＳＨ 检 测 （１）制 片 ：５ ｍＬ 羊 水