活病毒颗粒的荧光标记对于实现病毒侵染宿主细胞过程的实时
实时荧光定量PCR在植物害虫研究中的应用
能性 ；３ （ ）可 以在 很大 浓度 范 围 内（１倍 ） ＞ ０ 进行 定量 ， 有 较 高 的灵敏 度 、 异性 和 精确性 ；ｄ 特 （ ）既可 以做 定 性 分 析又 可 以做 定量 分析 【 ｌ 】 。同时该 技术 也与传 Ｈ
统 的Ｐ 技术 相 比还 有其 不足 之处 ：１ ＣＲ （ ）由于减少 了
第 ３ ４卷第 ２期 ２ ｌ 年 ６月 ０１
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ＪＡＮＧＸＩ ＰＬＡＮＴ ＰＲＯＴＥＣＴＩ Ｉ ＯＮ
实 时荧光 定量 Ｐ Ｒ在 植物 害 虫研 究 中 的应 用 Ｃ
郭庆 ，王忠跃 ，孔繁 芳，武艳 霞
与该模板 的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始
拷 贝数越 多 ，Ｃ值 越 小 。因此 只要 获得 未 知样 品 的 ｔ Ｃ值 ， 即可从 标准 曲线上 得 到该样 品的起始 拷 贝数 ｔ
【ｌ ｌ】
。
荧光也有很大帮助 。
２２ 水解 探针 （ ａ ｎａ ） ． Ｔ ｐ ｌｎ 目前 在实 时荧 光 定量 Ｐ Ｒ技术 中 应川 较 多 的水 Ｃ
了对Ｄ Ａ Ｎ 模板的定量 ， 它具有实时性 、 快速、 灵敏 、
高 通量 、特 异 性强 、 自动化 程度 高 、重 复 性好 、准 确 定量 等特 点 。
敏感、产率高、快速、简便、重复性好 、易 自动化 等突出优点，被广泛应用于基础研究，成为分子生 物 学、鉴别遗传疾病和快速检测病毒和病菌感染必
关 键词：实时荧光 定量Ｐ Ｒ；Ｃ ；植物 害虫；荧光阈值；荧光探针 Ｃ ｔ
中图分 类号：￥ ６ － ７ ３３
文献标识码 ：Ａ
备战2023年高考生物全国通用母题题源解密16 转基因生物,从基因工程中溯源(原卷版)
专题16 转基因生物，从基因工程中溯源考向一基因工程【母题来源】2022年全国乙卷【母题题文】(2022·全国·高考真题)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。
回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT-PCR法。
这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是______，再通过PCR技术扩增相应的DNA 片段。
根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的______来进行。
PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明______(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明______。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。
已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。
为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。
基因工程的基本操作流程是______。
【试题解析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；过程：①高温变性：DNA 解旋过程(PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开)；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
(1)分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶(反转录酶)。
(2)PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性(90-95℃)、复性(55-60℃)、延伸(70-75℃)，故其中温度最低的一步是复性(或退火)。
病毒颗粒的功能主治与用量
病毒颗粒的功能主治与用量1. 病毒颗粒的概述病毒颗粒是一种微小的生物颗粒，由病毒核酸和蛋白质组成。
它们是病毒的组成部分，负责传播病毒并感染宿主细胞。
病毒颗粒具有多种功能，包括识别宿主细胞、侵入细胞、复制自身等。
了解病毒颗粒的功能和用量对于研究病毒性疾病以及开发疫苗和药物具有重要意义。
2. 病毒颗粒的功能病毒颗粒具有多种功能，主要包括以下几个方面：•识别宿主细胞：病毒颗粒表面的蛋白质可以与宿主细胞表面的受体结合，从而识别并选择特定的细胞进行感染。
•侵入细胞：病毒颗粒通过与宿主细胞膜融合或通过细胞内吞作用进入宿主细胞内部，将其病毒核酸释放到细胞质中。
•复制自身：病毒颗粒内的病毒核酸可以利用宿主细胞的复制机制合成新的病毒核酸和蛋白质，从而复制自身。
•组装和释放：新合成的病毒核酸和蛋白质在细胞内组装成新的病毒颗粒，随后通过细胞膜融合或细胞溶解等方式释放到外界，继续感染其他细胞。
3. 病毒颗粒的主治由于病毒颗粒具有多种功能，它们在医学研究和临床应用中具有广泛的主治作用。
以下列举了一些常见的病毒颗粒的主治：•疫苗研究与开发：病毒颗粒作为病毒疫苗的载体或衍生物，可以用于疫苗研究和开发。
通过将目标病毒的关键蛋白质基因插入病毒颗粒中，可以激发免疫反应，培养抗体，从而提供对特定病毒的免疫防御。
•疾病诊断：病毒颗粒中的特定蛋白质或核酸序列可以被用来作为诊断特定病毒感染的标志物。
通过检测患者体液中的病毒颗粒特异性蛋白质或核酸，可以确定病毒感染的类型和严重程度。
•药物研发：病毒颗粒可以用于药物研发，通过研究病毒颗粒的结构和功能，可以发现抑制病毒复制和感染的药物靶点，并开发出相应的抗病毒药物。
•基础生物学研究：病毒颗粒作为一种典型的生物纳米颗粒，被广泛应用于基础生物学研究领域。
通过对病毒颗粒的研究，可以深入理解病毒感染机制、细胞内生物合成等基本生物学过程。
4. 病毒颗粒的用量病毒颗粒的用量在病毒研究和临床应用中具有重要意义，正确的用量可以确保研究和应用的有效性和可重复性。
病毒学检验知到章节答案智慧树2023年山东第一医科大学
病毒学检验知到章节测试答案智慧树2023年最新山东第一医科大学绪论单元测试1.病毒是一种专性细胞内寄生的非细胞型微生物。
（）参考答案:对2.病毒的种类较多，其中可以感染细菌的病毒我们称之为（）。
参考答案:噬菌体3.病毒学检验的一般原则包括（）。
参考答案:质量控制原则;足够的硬件设施;生物安全原则;标本的采集原则4.下列属于病毒直接检测方法的是（）。
参考答案:细胞病理学检测;病毒蛋白检测;电子显微镜技术;病毒核酸检测5.下列选项中，属于病毒学检验应用范围的是（）。
参考答案:病毒性传染病的的检验与检疫;新发病毒性疾病的病原和防治研究;病毒感染和病毒性疾病的诊断;病毒变异的研究6.新发传染病多是动物源性病毒性传染病。
（）参考答案:对7.病毒的变异类型包括遗传漂变（genetic drift）和遗传转移（genetic shift）两种类型。
（）参考答案:对8.下列因素中能够影响新发传染病发生与传播的有（）。
参考答案:病毒变异;国际旅行和商务;气候变化;公共卫生投入不足9.使用分子生物学检测新病毒核算室，需要用到非序列依赖性的方法，下列属于上述方法的是（）。
参考答案:病毒宏基因组学;随机引物PCR;简并PCR;非序列依赖性单引物扩增技术第一章测试1.在细胞培养系统中，培养一代细胞需要经过四个阶段，下列不属于这这四个阶段的是（）参考答案:游离期2.细胞在冻存时要掌握的原则是（）参考答案:慢冻快融3.常作为细胞培养液的指示剂是（）参考答案:0.4％的酚红溶液4.因为细胞培养液的营养丰富，更易于发生微生物污染，如细菌、真菌、支原体等，加（）可控制支原体的污染.参考答案:卡那霉素5.实验室器材的清洗过程正确的是（）参考答案:浸泡→刷洗→酸浸→冲洗6.从组织分离的原代细胞是一群对原有组织有较好代表性的细胞，但细胞间存在异质性，即差异性。
（）参考答案:对7.用胰蛋白酶做消化液时，浓度越大作用越强，对细胞的培养越有利。
2024版笔记分享微生物逆转录病毒(下)
01定义02分类逆转录病毒是一类RNA病毒，其基因组为RNA，但在其生命周期中，RNA会被逆转录成DNA，并整合到宿主细胞的基因组中。
根据国际病毒分类委员会（ICTV）的分类，逆转录病毒属于逆转录病毒科（Retroviridae），包括多个属和种，如人类免疫缺陷病毒（HIV）、鼠白血病病毒（MLV）等。
定义与分类VS逆转录病毒粒子通常由核心蛋白、逆转录酶、整合酶和包膜蛋白等组成。
核心蛋白包裹病毒RNA 基因组，逆转录酶和整合酶则参与病毒基因组的复制和整合过程，包膜蛋白则与病毒粒子的组装和释放有关。
生命周期逆转录病毒的生命周期包括吸附、注入、逆转录、整合、表达、组装和释放等步骤。
在吸附和注入过程中，病毒粒子与宿主细胞结合，并将病毒RNA 注入细胞。
随后，逆转录酶将病毒RNA 逆转录成cDNA ，并在整合酶的帮助下将cDNA 整合到宿主细胞的基因组中。
在表达阶段，宿主细胞会转录并翻译整合的病毒基因，产生新的病毒蛋白。
最后，新合成的病毒蛋白和基因组RNA 组装成新的病毒粒子，并从宿主细胞中释放。
结构结构与生命周期宿主范围与感染方式宿主范围逆转录病毒的宿主范围广泛，可以感染包括人类、动物、植物和真菌在内的多种生物。
不同种类的逆转录病毒具有不同的宿主特异性，例如HIV主要感染人类免疫细胞，而MLV则主要感染小鼠细胞。
感染方式逆转录病毒的感染方式多样，可以通过直接接触、血液传播、性传播等途径感染宿主。
在感染过程中，病毒粒子首先与宿主细胞表面的受体结合，然后通过内吞或膜融合等方式进入细胞内部。
一旦进入细胞，逆转录病毒会利用宿主细胞的资源进行复制和增殖，最终导致细胞病变或死亡。
03逆转录病毒无法独立生存，需要寄生在微生物细胞内，利用微生物的代谢系统进行复制和增殖。
微生物为逆转录病毒提供生存环境一些逆转录病毒可以通过感染微生物，进而通过微生物的传播途径扩散到更广泛的宿主中。
微生物作为传播媒介微生物可以通过自身的免疫系统和代谢途径对逆转录病毒进行调控，限制其复制和增殖，从而维持自身稳态。
EB病毒进入B淋巴细胞与上皮细胞的机制-病毒学论文-生物学论文
EB病毒进入B淋巴细胞与上皮细胞的机制-病毒学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)属于疱疹病毒亚科,能够感染全球90%的人类,是最早被发现与肿瘤相关的病毒。
它与多种人类疾病尤其是恶性肿瘤相关,其中包括单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、霍奇金病和鼻咽癌。
二十世纪九十年代,有研究表明EBV还与胃癌和乳腺癌相关。
而EBV是如何侵入宿主细胞,如何与宿主细胞相互作用,进而影响疾病发生发展,这都是研究者一直关注和研究的。
EBV侵入细胞是其感染宿主细胞以致发生作用的第一步。
这一步一般包括病毒到细胞表面的附着和病毒包膜与细胞膜的融合。
由于淋巴细胞表面具有EBV感染的受体,EBV能直接感染侵入B淋巴细胞并使其永生化。
研究发现,在多种上皮细胞肿瘤中,有EBV的感染,而上皮细胞缺少像B淋巴细胞上的受体。
因此,了解EBV是如何感染进入宿主细胞,尤其是上皮细胞,有利于在体外建立合适的细胞模型及深入研究EBV相关肿瘤发生发展的机理。
尽管对EBV侵入各类细胞的认识仍不全面,但研究者也提出了EBV进入细胞的几种机制,并确定许多该过程的主要参与者。
这里主要阐述EBV进入B淋巴细胞与上皮细胞的机制。
1B淋巴细胞EBV原发性感染通常发生在童年时期,没有明显的临床症状,然而年纪较大的孩子以及青少年在感染EBV后,就有可能导致传染性单核细胞增多症,这是一种自我限制性的淋巴组织增生性疾病。
静止期的人类B淋巴细胞是EBV在体内和体外都能感染的初始靶细胞。
在被感染之后,病毒能够终生潜伏在B淋巴细胞中。
那么,EBV是如何进入B细胞的?多年研究发现,EBV感染B淋巴细胞的机制主要涉及病毒包膜糖蛋白gp350/220与B细胞表面受体CR2的相互作用以及另外几种病毒糖蛋白gp42、gB、gH和gL的相互作用。
EBV附着于B淋巴细胞,主要依赖于EBV表面包膜糖蛋白gp350/220与B淋巴细胞膜上表达丰富的CR2结合,但它并不是绝对的。
蛋白标签-基因克隆载体上的蛋白标签-齐全的各种常用标签
蛋白标签-基因克隆载体上的蛋白标签-齐全的各种常用标签蛋白标签蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。
蛋白表达载体按照表达宿主的不同新推出3类，分别为表达宿主为大肠杆菌，哺乳动物细胞的，以及慢病毒载体。
除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体分别按照功能标签的不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下：His6：His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。
当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。
组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。
使用His-tag有下面优点：1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；3.His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；4.His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体；5.可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；6.可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。
Flag:Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。
FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：1.FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。
病毒与宿主细胞的相互作用和致病机制
病毒与宿主细胞的相互作用和致病机制病毒是一类微生物，它们不能自行生长繁殖，需要寄生于宿主细胞内进行繁殖。
病毒在寄生于宿主细胞的过程中和宿主细胞之间会发生很多复杂的相互作用，这些相互作用直接决定了病毒的寄生效率、复制率、致病能力等等，也直接影响着宿主细胞的生长、代谢、逃逸反应能力等等。
本文将主要探讨病毒和宿主细胞之间的相互作用和致病机制。
病毒与宿主细胞的相互作用当病毒感染宿主细胞时，它们首先会通过病毒上的受体结合膜上受体分子，然后通过针对宿主细胞的信号转导机制使其进入宿主细胞内部。
在宿主细胞的内部，病毒立即开始复制和繁殖。
由于病毒不能自主进行生物合成，因此在宿主细胞内部它们需要利用宿主细胞的生物合成机制合成病毒蛋白、RNA等，并且需要占用宿主细胞的能量、糖类、氨基酸等代谢物质完成它们自身的合成。
此时病毒与宿主细胞开始了一种复杂的相互作用。
首先宿主细胞会感知病毒的存在，并启动对病毒的防御机制，例如识别病毒RNA当中的非自身RNA并将它们降解、启动炎症反应、调控宿主细胞的自噬途径等等。
而病毒为了对抗宿主细胞的防御机制则会通过不同方式避免被宿主细胞识别、降解。
例如在病毒RNA的3'端或5'端加入修饰结构可以使其免遭宿主细胞的RNA降解酶的攻击、隐藏在宿主细胞的某些内质网体系中以保护自己免受被宿主细胞的免疫识别等等。
除此之外，病毒还可能会借助宿主细胞的自身生理学过程来达到它们自身的复制和繁殖。
例如病毒在宿主细胞内逃避自噬的同时通过利用宿主细胞的高表达的mTOR（调控细胞生长和代谢的关键调节元件）使得自己的复制效率升高等等。
病毒的致病机制病毒感染宿主细胞不同于细菌感染宿主机体，病毒的危害在于它们在寄生于宿主细胞时占用了宿主细胞的生物合成机制，从而对宿主细胞的组织结构、生理功能等等造成了诸多破坏。
此外，感染病毒可能会直接或间接地导致宿主机体出现各种病理变化。
一方面，病毒感染宿主细胞时可能直接破坏宿主细胞的细胞膜或其他细胞器使得宿主细胞死亡。
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췍N E W S 4图1 活细胞内活病毒标记示意图武汉大学化学与分子科学学院何治柯教授课题组与中国科学院武汉病毒研究所王汉中研究员课题组合作,在德国‘应用化学“和美国‘分析化学“发表了多篇研究论文㊂他们率先提出了一种多色荧光标记活细胞内活病毒颗粒的新方法,相关成果发表在Angew.Chem.Int.Ed.,2012,51,670~674(见图1)㊂活病毒颗粒的荧光标记对于实现病毒侵染宿主细胞过程的实时跟踪,深入理解病毒致病机制以及病毒性疾病的早期诊疗都具有十分重要的意义㊂病毒感染宿主细胞是一个极其复杂的动态过程,采用常用的基因工程手段难以标记病毒核酸及示踪病毒与细胞膜融合后病毒核酸的定向移动,该关键信息的丢失极大地限制了研究者对病毒致病机理的正确认识㊂因此,对病毒颗粒的多色荧光标记,特别是对病毒核酸的标记一直是相关领域的热点问题㊂所提出的方法利用基因工程手段标记蛋白及通过病毒扩增过程中金属钌配合物与核酸的相互作用标记重组病毒核酸,不仅实现了病毒包膜和病毒核酸的同时荧光标记,而且不影响标记病毒的感染能力,具有标记效率高㊁荧光信号稳定㊁普适性强等优点;监测到母代病毒感染宿主的可视化过程,需几十个小时,而监测子代病毒感染仅需几分钟(如图1所示)㊂该研究成果对于活病毒标记及可视化研究具有重要的推动作用㊂具体步骤如下:1.借助病毒展示系统,将绿色荧光蛋白(EGFP )与杆状病毒囊膜蛋白GP64融合表达,构建出GP64上带有绿色荧光蛋白的重组杆状病毒㊂2.金属配合物[Ru (phen )2(dppz )]2+溶液加入到培养基中培养宿主细胞SF9;将重组病毒加入到培养的宿主细胞中进行病毒感染与增殖㊂3.收集㊁纯化双色标记的子代病毒颗粒,得到的子代病毒通过透射电镜(TEM ),电感耦合等离子体质谱(ICP -MS )和激光扫描共聚焦显微镜(laser confocal scanning micro - 图2 亚钌配合物及量子点双色荧光标记检测EV71示意图scope ,LSCM )表征其结构,测量单颗病毒金属配合物[Ru (phen )2(dppz )]2+含量及展示其单颗病毒的双荧光信号㊂4.将纯化双色标记的子代病毒颗粒用于宿主细胞SF9的侵染示踪研究㊂此外,基于亚钌配合物及量子点双色荧光检测人体肠道病毒EV71(手足口病)的研究成果发表在Anal.Chem.,2011,83,7316(见图2),基于石墨烯猝灭量子点荧光同时检测人体肠道病毒EV71和柯萨奇B3病毒CVB3的成果已在Anal.Chem.,/10.1021/ac203172x 在线发表(见图3)
㊂图3 石墨烯猝灭量子点荧光同时检测EV71和CVB3示意图(上)及可视化检测结果(下)第40卷
2012年6月 分析化学(FENXI HUAXUE ) NEWS Chinese Journal of Analytical Chemistry 第6期973。