4第四章 酶活力的测定
酶活测定方法
、酶活测定方法还原法酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。
在此反应体系中添加化学试剂,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。
通过在特定的波长下比色,即可求出还原产物的含量,从而计算出酶活力的大小。
色原底物法通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。
该底物与酶发生反应后,生色基团可被释放出来,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后,即可求出待测酶的活力。
粘度法该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。
木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大为降低。
基于Poiseuille定律我们知道,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法酶与其底物在特定的条件下充分反应后,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法常用于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法、免疫凝胶扩散法。
这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。
免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法将酶作用的底物与琼脂混合熔融后,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。
用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径的小孔。
在点加酶样并培养24h以后,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。
蛋白酶活力测定法本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
酶活力测定
酶活力测定
酶是一种能够催化生物体内化学反应的蛋白质，广泛存在于动植物、微生物、真菌等
生物体内。
酶在生理代谢、免疫系统、消化系统等方面扮演着重要的角色。
因此，对于酶
的活力测定十分重要。
下面将详细介绍酶活力测定方法。
酶活力测定的基本原理是通过测定一个给定反应体系下酶所催化的底物转化速度来确
定酶的活力。
酶活力的测定通常采用标准曲线法、比色法、荧光法、放射性同位素标记法、酶电极法等多种方法。
其中，比色法和荧光法是最为常用的两种方法。
二、比色法
比色法是通过反应体系中某一底物和产物的比色反应来测定酶的活力。
常用的比色反
应有蛋白质和氨基酸比色法、尿素酶测定法等。
以蛋白质和氨基酸比色法为例，其测定步骤如下：
1. 选定底物，例如眼镜蛇毒素，反应物为酸性的巴氏液
2. 选定测定时点，例如反应20分钟之后
3. 加入颜色试剂，例如Folin验液，使反应产生深色络合体
4. 测定吸光度，根据标准曲线计算出反应深度，从而计算出酶的活力值
三、荧光法
荧光法是通过酶催化的底物转化产生的荧光信号来测定酶活力。
荧光法具有高灵敏度、高精度、高速度、低误差等优点，越来越受到人们的关注。
1. 选择荧光素为底物，荧光素在激发光的作用下会发出荧光信号
2. 酶催化荧光素转化为羟基荧光素，生产出更强的荧光信号
四、注意事项
酶活力测定的过程中需要注意以下几个方面：
1. 选择适当的反应体系、底物和试剂
2. 在测定前保持合适的反应条件（例如pH、温度等）
3. 为了获得比较准确的测定结果，需要进行多次测定
4. 保证测定设备和试剂的质量和准确性。
酶活力测定的原理和方法
B 电化学法
• 很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中， 最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液 的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一 原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定 酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参 与反应的酶的活力。
C 量气法
• 在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通 过测量反应系统中气相的体积或压力的改变， 计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和 时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的 气 体 测 量 仪 为 瓦 （ 勃 ） 氏 测 压 仪 （ Warburg manometric apparatus ）。用测压仪测定酶活 力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶 反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较 光谱吸收法低。
切勿反復 凍結-解凍。
酵素失活的原因
• • • • • 可歸類成如下的物理性或化學性原因。 (1) 蛋白質 變性： (2) 酵素 活性區 破壞： (3) 蛋白脢 水解： (4) 酵素 抑制劑：
酶反应速度曲线
产 物 浓 度 斜率＝浓度/时间＝V 时间
酶反应速度可以通过单位时间内，单位体积中底物的减少量 或产物的增加量来表示。
酶活力的测定
• 酶活力的测定就会是测定酶促反应速度。 • 必须测定酶反应的初速度。 • 底物浓度必须足够的大，至少为Km的10 倍。 • 酶浓度必须适合。
1、化学法
• 化学法是利用化学反应使产物变成一个 可用某种物理方法测定的化合物。如根 据比色、酸碱滴定、量热、量气法等来 计算酶的活性。
2、放射性化学法
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
酶活性的测定
式中
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L旳KMnO4相当于
紫外分光光度法:
H化测2O氢量2在，吸2使光40反率nm应旳波溶变长液化下吸速有光度强度即烈可(吸A测2收40出)，随过过反氧氧应化化时氢氢间酶酶而旳能降活分低性解。。过根氧据 以1min内A240降低0.1旳酶量为1个酶活单位（u）。
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。
试验环节：
计算措施：
每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时相应 旳SOD 量为一种SOD 活力单位（U），待测 样品中旳SOD 活力由下式计算：
SOD克制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）
据此，可根据H2O2旳消耗量或O2旳生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）旳H2O2溶液，经酶促反 应后，用原则高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出旳H2O2
。
即可求出消耗旳H2O2旳量。
酶表活达性 ：用每克鲜重样品1min内分解H2O2旳毫克数
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
测定茶树鲜叶APX活性旳最佳条件
PVPP旳加入量为鲜叶重旳1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
注意事项：
（1）因为测定反应是经过加液量控制在60s内，使产生旳A290光值下 降呈良好旳线性关系。
1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液
(pH8.2
酶活力测定方法
空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。返回练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
第四章 酶法分析
优点：
不需要特殊复杂的设备和仪器 灵敏度高 重复性好 对健康无害
应用前景
食品卫生 环境污染生化 指标 临床医学
“瘦肉精”快速检测新技术 ——竞争酶标免疫法
“瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的 作用于β —肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气 肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的5—10倍时， 可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦 肉精”。
应用时应考虑两个问题，即工具酶的用 量与反应的平衡点。
终点法要操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反 应于1级反应水平。因为这样可以使反应迅速 达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反 应；减少工具酶的用员。 (2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物 反应的另一底物应具有足够高的浓度。 (3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到 终点。
底物？ pH？ 温度？ 样品？
二、测定中应注意的问题 1.初速度
底物浓度对酶速的影响
浓度选择： a） [s]>=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。
作用于待测酶产物的其它酶；
（如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。
三、酶标免疫分析法
Enzyme Immunoassay (EIA)
在70年代初，从放射免疫分析发展起 来的一种称为“酶标免疫”的分析方法， 它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能 力有机地结合在一起，建立的一种高度特 异、灵敏的分析方法。
放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是用放射 性同位素标记抗原Ag*，该抗原与未标记抗原Ag竞 争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应 生成的Ag*-Ab复合物与Ag的量呈负相关。Ag*-Ab的 生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知 浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度， 这种分析方法称为放射免疫分析。
实验四蛋白酶活力的测定
实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。
2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。
4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。
将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
三支试管中反应液用滤纸过滤。
另取三支试管（一支空白。
两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。
以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。
5.数据处理。
实验四蛋白酶活力的测定
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号
1
2
3
100g/ml Tyr (ml)
0
水（ml)
1.0
0.2
0.4
0.8
0.6
以酪氨酸的浓度（μg/ml）为
横坐标， A680nm为纵坐标，作 出标准曲线。
样品、对
4
5
6
照滤液 （各2支
试管）
0.6
0.8
1.0
每支管加 1ml
3．用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含 量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。
4. 蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水 解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂
可见光分光光度计 水浴锅 Folin –酚试剂 0.5% 酪蛋白 100 g/ml Tyr 溶液 三氯醋酸
样品管
1
对照管
1
2
----浴准确保3 Nhomakorabea-------
温10分钟
----
3
------
2
40℃水浴保温10 分钟，过滤得滤 液
2、蛋白酶活力的测定
按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。
管号
1′号 (样品) 2 ′号 (对照)
酶液 （ml）
1
1
酪蛋白 （ml）
2
----
三氯 醋酸 （ml）
----
3. 酶活力计算
胰酶活力定义： 40 ℃ ， pH7.5 ，反应10min，每分 钟水解酪蛋白产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。
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二、酶活力的测定
由于分光光度法有其独特的优点，因此可以把一些 原来没有光吸收变化的酶反应通过与一些能引起光吸 收变化的酶反应偶联，使第一个酶反应的产物转变成 为第二个酶的具有光吸收变化的产物来进行测量。这 种方法称为酶偶联测定法。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
2.荧光法
二、酶活力的测定
选择底物 配制底物溶液 ① 底物 ② 反应条件 酶活力 的测定步骤
准确计时并终止反应 确定酶促反应条件： 确定酶促反应条件： pH、温度等 pH、
③ 反应时间 ④ 底物或产物 变化量
运用各种检测技术， 运用各种检测技术， 快速、简便、 快速、简便、准确的 测定变化量
张晓静 2009.09
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
要求酶活力的测定方法：快速、简便、准确。 要求酶活力的测定方法：快速、简便、准确。 1.酶活力的测定步骤 酶活力的测定步骤 酶活力测定均包括两个阶段：首先要在一定的 条件下，酶与其作用底物反应一段时间，然后 再测定反应液中底物或产物变化的量。
张晓静 2009.09
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
反应时间： ③反应时间：在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶 液混合均匀，适时记下反应开始的时间。反应到一定时 间及时终止反应。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、 反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。常用： 加热、添加酶变性剂、加入酸液或碱液、冰浴等。 底物或产物的变化量： ④底物或产物的变化量：反应到一定时间，取出适量的 反应液，运用各种生化检测技术，测定产物增加量或底 物的减少量。为了准确地反应酶促反应的结果，应尽量 采用快速、简便、准确的方法测出结果。
二、酶活力的测定
1.分光光度法
分光光度法主要利用底物和产物在紫外光或可见光 分光光度法 部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反 应过程中反应进行的情况。其优点是简便、节省时间 和样品，可检测到nmol/L水平的变化。该方法可以连 续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测 定中一种重要的方法之一。几乎所有的氧化还原酶都 可以用此法测定。
张晓静 2009.09
教材及参考书（第四章） 教材及参考书（第四章）
张晓静 2009.09
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
3.同位素测定法
用带有放射性同位素标记的底物经酶作用后得到产 物，通过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出 酶的活力单位。 已知六大类酶几乎都可以用此方法测定。 通常用于底物标记的同位素有3H、14C、32P、35S和 131I等。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
荧光法主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测 荧光法 定。由于荧光方法的灵敏度往往比分光光度法要高若干个 数量级，而且荧光强度和激光的光源有关，因此在酶学研 究中越来越多地被采用，特别是一些快速反应的测定方法。 该法缺点：易受其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸 收和发射荧光，这种干扰在紫外区尤为显著，故用荧光法 测定酶活力时，应尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。
张晓静 2009.09
一、酶活力
2.酶活力单位 酶活力单位
酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示, 即酶单位(activity unit，U)。 酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定 酶单位的定义 量的底物转化为产物所需的酶量。这样酶的含量就可 以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表 示，即 “U/g” 或 “U/mL” 。 世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。 同一种酶往往有几种不同的单位。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
在使用离子选择电极法测定某些酶的酶活力时, 用氧电极可以测定一些耗氧的酶反应。如葡萄糖 氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
5.其他方法 除上述方法外，还有一些测定酶活力的方 法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法 等，但这些方法使用范围有限，灵敏度较差, 只是应用于个别酶活力的测定。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
2.酶活力的测定方法 酶活力的测定方法 测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测 法、化学检测法等生化检测技术。 一种酶可能有多种测定方法，要根据实际情况 选用。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
酶 活 力 的 测 定 方 法
4. 5. 法 法 3. 测定法 2.荧光法 1.分光光度法
优点：反应灵敏度极高，可直接用于酶活力的测定， 也可用于体内酶活性测定。特别是适用于低浓度的酶 和底物的测定。 缺点：操作繁琐，样品需分离，反应过程无法连续 跟踪，且同位素对人体有损伤作用。辐射猝灭会引起 测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。
张晓静 2009.09
二、酶活力的测定
4.电化学方法
例如，1IU＝lµmol/min；1Kat = 1mol/s
张晓静 2009.09
一、酶活力
酶活力的测定要在最适条件下进行，即最适温度、 最适pH、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等， 只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力大小。 测定酶活力大小时，通常要求底物浓度足够大， 测定底物浓度的变化在起始浓度的5％以内的速率， 这样可以保证所测定的速率是最初速率。此结果能 比较可靠地反映酶的含量。
张晓静 2009.09
一、酶活力
3.酶的比活力 酶的比活力
酶的比活力代表酶的纯度，通常用下式表示： 酶比活力=[ 酶活力单位数(U) / 蛋白质量 蛋白质量(mg) ] 酶比活力 酶活力单位数 有时也采用每克(g)酶制剂或每毫升(mL)酶制剂含 有多少个活力单位来表示。 比活力的大小可用来比较每单位质量蛋白质的催化 能力。比活力是酶学研究及生产中经常使用的指标。
二、酶活力的测定
底物： ①底物：根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配制成 一定浓度的底物溶液。要求所使用的底物均匀一致，达 到一定的纯度。有些底物溶液要求新鲜配制，有些则可 预先配制后置冰箱保存备用。 ②反应条件：据资料或试验结果，确定酶促反应的温度、 反应条件： pH等条件。温度可选在室温(25℃)、体温(37℃)、酶促 反应最适温度或其他选用的温度，一般在恒温装置内进 行。pH应是酶促反应的最适pH，采用一定浓度和一定 pH的缓冲溶液来保持。反应条件一经确定，在反应过程 中应尽量保持恒定不变。有些酶促反应要求激活剂等其 他条件，应适量添加。
电化学方法包括：pH测定法和离子选择电极法等。 pH测定法最常用的是玻璃电极，配合一高灵敏度的 pH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用pH的变化 来测定酶的反应速率。也可以用恒定pH测定法，在酶 反应过程中，所引起的H+的变化用不断加入碱或酸来 保持其pH恒定，用加入的碱或酸的速率来表示反应速 率。张晓静
第四章 酶活力的测定
主讲：张晓静
第四章
酶活力的测定
第一节 酶的结构与性质(略) 第二节 酶活力测定方法
第二节 酶活力测定方法
一、酶活力 二、酶活力的测定
张晓静 2009.09
一、酶活力
1.概念 概念
酶活力是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力的 酶活力 大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反 应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大， 酶活力越高，反之越低。 酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或 产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测 定产物的增加量为准。 酶活力的测定就是测定酶促反应的初速率。 酶活力的测定就是测定酶促反应的初速率。