双水相体系萃取(精)
双水相萃取详细资料
三步两水相萃取酶的流程：
细胞匀浆液
第一步双水相萃取
+PEG +盐（或是葡聚糖）
分离机
下相 ） 细胞碎片
杂蛋白 （核酸、多糖）
上 相（PEG相
（目标产物）如prot、E +盐
第二步双水相萃取 静置分层
下 相（盐相） 核酸多糖
上 相（PEG相） 目标产物
杂蛋白
（亲水性较强）
+盐
第三步双水相萃取 静置分层
分子间作用力与熵增加相比占主导地位。
➢ 作用力为斥力：形成两个水相，两种高聚物分 别富集于上、下两相。
➢ 作用力为引力：也形成两个水相，但两种高聚 物都分配于一相，另一相几乎为溶剂。
➢ 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
优点：1.与固定床反应器相比，不需载体，不存在多孔载体中的 扩散阻力，故反应速度快，生产能力较高；2.生物催化剂在两水 相系统中教稳定；3.两相间表面张力低，轻微搅拌即能形成高度 分散的系统，分散相液滴在10μm一下，有很大的表面积，有利于 底物和产物的传递。
PEG系统中细胞碎片分配到下相中较容易 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐（有时也可 加入适量的PEG），尽兴第二次双水相萃取，以除去多 糖和核酸，它们的亲水相较强因而容易分配在盐相中， 而蛋白质就留在了PEG相中；在第三步萃取中，应该使 蛋白质分配在盐相中（例如：调节pH），以使和主体 PEG分离。色素由于其疏水性，通常分配在上相。主体 PEG可循环使用，而盐相蛋白质则可用超滤方法去除残 余的PEG以提高产品的纯度。
双水相萃取技术在分离_纯化中的应用(精)
第39卷第8期化工技术与开发 V ol.39 No.8 2010年8月 Technology & Development of Chemical Industry Aug.2010综述与进展双水相萃取技术在分离、纯化中的应用谭志坚,李芬芳,邢健敏(中南大学化学化工学院,湖南长沙 410083摘要:双水相技术是一种新型的液-液萃取技术,由于其条件温和、易操作等特点,目前已广泛应用于物质的分离、纯化。
本文综述了双水相形成原理、工艺流程和特点、体系类别、影响双水相分配的因素及其在分离纯化中的应用,并针对其未来发展趋势进行了展望。
关键词:双水相萃取;分离纯化;应用中图分类号:TQ 028.32 文献标识码:A 文章编号:1671-9905(201008-0029-07基金项目:国家自然科学基金(项目编号:20956001通讯联系人:李芬芳(1964,女,湖南邵阳人,教授,博士生导师,研究方向:植物活性成分提取及分离纯代,E-mail:lfflgg@收稿日期:2010-03-30与传统的分离技术相比,双水相技术作为一种新型的分离技术,因其体积小,处理能力强,成相时间短,适合大规模化操作等特点[1],已经越来越受到人们的重视。
Beijeronck 在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合,发现了双水相现象。
双水相萃取(Aqueous two-phase extraction, ATPE技术真正应用是在20世纪60年代,1956 年瑞典伦德大学的 Albertsson 将双水相体系成功用于分离叶绿素,这解决了蛋白质变性和沉淀的问题[2]。
1979年德国Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物酶的分离,为以后双水相在应用生物蛋白质、酶分离纯化奠定了基础[3]。
迄今为止,被成功应用于生物医药工程,天然产物分离纯化,金属离子分离等方面[4~6]。
因其广泛的应用性,已经发展成为一种相对成熟的技术,但仍有很大潜在的价值等待我们去开发。
双水相萃取(精选双水相萃取PPT,超级有用)
基本流程
3.2.1 目的产物的萃取
原料匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然 后进入分离器分相。 通过选择合适的双水相组成，一般使目标蛋白质 分配到上相（PEG相），而细胞碎片、核酸、多 糖和杂蛋白等分配到下相（富盐相）。 第二步萃取是将目标蛋白质转入富盐相，方法是 在上相中加入盐，形成新的双水相体系，从而将 蛋白质与PEG分离，以利于使用超滤或透析将 PEG回收利用和目的产物进一步加工处理。
K= ct/ cb
其中ct 、cb 分别代表溶质在上相、下相中的浓度
基本原理
系统固定时, 分配系数为一常数, 与 溶质的浓度无关。当目标物质进入双水 相体系后, 在上相和下相间进行选择性 分配, 这种分配关系与常规的萃取分配 关系相比, 表现出更大或更小的分配系 数。如各种类型的细胞粒子、噬菌体的 分配系数都大于100或者小于0101, 因此 为物质分离提供了可能[7]。
[7] 严希康,俞俊棠. 生化分离工程[M]. 北京: 化学工业出版社, 2001.1692187.
三、双水相萃系分类
双水相体系主要有以下几种： （1）高聚物/高聚物双水相体系 （2）高聚物/无机盐双水相体系 （3）低分子有机物/无机盐双水相体系 （4）表面活性剂双水相体系
发展历程 Kula教授研究小组对双水相的应用，工艺流程、 操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研 究，在应用上获得成功。1978年首先将双水相萃 取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工 业装置，达到20Kg/h的处理能力，分离纯化了几 十种酶，也应用于基因工程产品的分离[3,4]。 双水相萃取可分离多肽，蛋白质、酶、核酸、病 毒、细胞、细胞器、细胞组织、以及重金属离子 等，近年来，还应用于一些小分子，如抗生素， 氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。
实验二双水相萃取α淀粉酶分配平衡(精)
实验二双水相萃取α-淀粉酶的分配平衡实验一、实验目的与要求1掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。
2了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。
3掌握熟悉聚乙二醇(PEG /硫酸铵体系双水相萃取实验操作。
4明确 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和添加 NaCl 等因素对α-淀粉酶分配系数的影响。
二、实验器材和试剂1. 实验器材 :低速离心机;酸度计;涡流混合器;分光光度计2. 实验试剂 :PEG :(分子量分别为 1000、 2000、 4000、 6000、 8000 、硫酸铵、α-淀粉酶、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、考马斯亮蓝 G-250 三、实验原理双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛,最常采用的双水相体系是 PEG/Dex 或 PEG/低分子盐系统, 其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。
PEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。
T 为上相浓度, B 为下相浓度 , C 为系统临界点, TCB 为临界线或双节线,双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。
因此两相浓度要足够高才可以形成两相。
双水相萃取分配系数 K=Ct /Cb ,为上相和下相的浓度比。
双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、 pH 等,以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。
利用双水相技术可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。
相图中 TMB 为系线,其长度由相组成的总浓度决定,表征两相差异程度。
在临界点附近系线长度趋近于零,表示上相和下相的组成相同,因此分配系数应为 1。
随着 PEG 、硫酸铵和盐浓度增大,系线长度增加,上相和下相相对组成的差别就增加,酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。
本实验采用 PEG/硫酸铵双水相体系研究α-淀粉酶的分配,具体研究 PEG 分子量、硫酸铵浓度、 pH 和添加 NaCl 浓度对α-淀粉酶分配系数的影响。
双水相萃取
2.2％的葡聚糖水溶液
0.72％甲基纤维素钠的水 ％ 溶液 葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系
{
发现, 早在1896年,Beijerinck发现 当明胶与琼 年 发现 脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个 混浊不透明的溶液，随之分为两相,上相富含 明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称 聚合物的不相溶性（ 为聚合物的不相溶性（incompatibility） 聚合物的不相溶性 ） 从而产生了双水相体系(Aqueous two phase 双水相体系(Aqueous 双水相体系 ATPS)。 system, ATPS)。
当两种高聚物水溶液相互混合时， 当两种高聚物水溶液相互混合时， 它们之间的相互作用分为三类： 它们之间的相互作用分为三类： 互不相溶(imcompatibiliy) 互不相溶 复合凝聚(complex coacervation) 完全互溶(complete miscibility)
2.2 双水相体系的组成
pH影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋 影响蛋白质中可离解基团的离解度，而改变蛋
白质所带电荷和分配系数。
离子环境也有影响。
5.3 疏水反应的影响 疏水反应的影响
消除电化学效应后， 消除电化学效应后，粒子表面的疏 水性占主要地位。 水性占主要地位。如被分配的蛋白 质具有疏水性的表面，则其分配 可以改变。 系数可以改变。
(4)分相时间短，自然分相时间一般 5min～15min； 为5min～15min； (5)界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)， (1010-4mN／m)， 有助于两相之间的质量传递； 有助于两相之间的质量传递； 不存在有机溶剂残留问题， (6)不存在有机溶剂残留问题，高 聚物一般是不挥发物质， 聚物一般是不挥发物质，对人体 无害； 无害；
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究(精)
化学与生物工程2006,Vol.23N o.10Ch emistry &B ioengin eerin g7收稿日期:2006-04-17作者简介:郑楠(1982-,女,陕西人,硕士研究生,主要从事生化制药方面的研究。
E -mail:*********************。
双水相萃取技术分离纯化蛋白质的研究郑楠,刘杰(南昌大学环境科学与工程学院,江西南昌330029摘要:阐述了双水相萃取原理,详细分析了影响双水相萃取分离纯化蛋白质的各种因素,探讨了双水相萃取技术在蛋白质分离纯化中的应用并对其前景进行了展望。
关键词:双水相;蛋白质;分离纯化;影响因素中图分类号:T Q 02818 Q 512+11 文献标识码:A 文章编号:1672-5425(200610-0007-03液-液萃取技术是化学工业中普遍采用的分离技术之一,在生物化工中也有广泛的应用。
然而,大部分生物物质是有生物活性的,需要在低温或室温条件下进行分离纯化,而采用传统萃取技术无法完成。
双水相萃取就是考虑到这种现状,基于液-液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型液-液萃取分离技术。
与传统的液-液分离方法相比,双水相萃取技术分离纯化蛋白质具有以下优势:体系含水量高,可达80%以上;蛋白质在其中不易变性;界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递;分相时间短,一般只需5~15min;易于放大和进行连续性操作;萃取环境温和,生物相容性高;聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等。
正是由于双水相萃取技术的诸多优势,现已被广泛用于蛋白质、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。
1 双水相萃取原理双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。
高聚物-高聚物-水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物-盐-水体系一般认为是盐析作用的结果。
双水相体系配制与萃取实验报告
双水相体系配制与萃取实验报告标题：双水相体系配制与萃取实验报告摘要：本文旨在介绍双水相体系的配制和萃取实验，并从多个方面深入探讨双水相体系的原理、优势以及在化学实验中的应用。
通过配制不同体积比例的两相溶液，我们将研究它们在不同环境下的相互作用和分离效果。
本实验对于理解双水相体系的应用潜力以及深入探索其在分离和萃取过程中的优势具有重要意义。
1. 引言在化学实验中，分离和提纯目标物质是一项重要的任务。
传统的溶剂萃取方法虽然广泛应用，但常常存在一些限制，例如有毒有害溶剂的使用、低分离效率以及操作复杂等。
为了克服这些问题，双水相体系应运而生。
双水相体系是指由两种不相溶的水溶液组成的体系，其特点是分子间相互作用较弱，不需要有害溶剂参与，能够更高效地完成分离和提取任务。
2. 双水相体系配制的方法为了成功配制双水相体系，我们需要选择适当的双水相体系成分，并正确调配它们的比例。
在实验中，我们通常使用两种水溶液，例如磷酸盐溶液和盐酸溶液。
在配制过程中，可以采用逐滴法、加水法或溶剂辅助法等方法，以确保两相溶液的水平接触，并形成稳定的双水相体系。
3. 双水相体系的原理和特点双水相体系的形成是由于两相溶液中存在的一些化学成分之间的亲疏性差异所致。
一般来说，一种水相溶液中的一类极性物质与另一种水相溶液中的另一类亲疏性物质之间存在强烈的相互作用。
这种相互作用可以通过水相中所含的盐的类型、浓度以及 pH 值的调整来控制。
与传统的单相溶剂萃取相比，双水相体系具有好的相容性、高的分离效率、可重复使用等特点。
4. 双水相体系在化学实验中的应用双水相体系在化学实验中有着广泛的应用。
它可以用于生物大分子的提取和分离、金属离子的萃取、有机物的净化等。
利用双水相体系的亲疏性差异，我们可以实现对目标物质的高效提取，并能够在分离过程中控制环境条件，如pH 值、温度等，以满足特定实验需求。
此外，双水相体系还可以减少有毒溶剂的使用，减轻对环境的影响。
【生物工程下游技术】第七章双水相萃取(精)
聚合物的分子量越高，相分离 所需的浓度越低 两种聚合物的分子量相差越 大，双节线的形状越不对称。
3、物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数 K表示。 CT K= —— CB Ct、CB——分别代表上相、下相中溶质的浓度 K—与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 1）表面自由能的影响(大分子物质表面性质对K影响很大) 2）表面电荷的影响(盐效应：两相系统中如存在盐,对K影响较大) 3）综合考虑（影响因素很多，单因素定量很困难，最佳操作条件靠实验） 4）影响分配平衡的参数 (1)聚合物的影响； (3)体系PH的影响； (2)体系中无机盐离子的影响； (4)体系温度的影响；
三、 双水相萃取技术的发展
1. PEG衍生物：在PEG上引入亲和基团或离
子基团；
2. 采用多级萃取。
作业：
1.
第七章 双水相萃取
普通的溶剂萃取法不适宜分离提纯蛋白质，其原因是： (1) ;(2) 2. 生物工程中常用的双水相体系主要 有： ， 等体系。 3. 聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）体系的相图是一条双节 线。双节线 下方为 ，双节线上方即 为 ，两相分别有不同的组成和密度恒压条件下，影响物质在聚乙二醇（PEG）/葡聚糖 （Dex）双水相体系中分配的因素有哪些?分配系数K分别怎 样变化? 5. 请自行设计双水相提取胞内酶的操作流程及操作要点。
保持生物活性和强化相际间的质量传递 ② 分相时间短(特别是聚合物/ 盐系统) ,自然分相时间一般 只有5～15min。 ③ 双水相萃取技术易于连续化操作。 ④ 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产物
有较高的收率。
⑤ 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液 分离方法相比,双水相萃取技术可省去1～2 个分离步骤,使 整个分离过程更经济。 ⑥ 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。
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双水相萃取技术
早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液,随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉,这种现象被称为聚合物的不相溶性(incompatibility,从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system,ATPS。
传统的双水相体系是指双高聚物双水相体系,其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用,相互无法渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,在一定条件下即可分为二相。
一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异,混合时就可发生相分离,且憎水程度相差越大,相分离的倾向也就越大。
可形成双水相体系的聚合物有很多,典型的聚合物双水相体系有聚乙二醇(polyethylene glycol,略作PEG/葡聚糖(dextran,聚丙二醇(polypropylene glycol/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose/葡聚糖等。
另一类双水相体系是由聚合物/盐构成的。
此类双水相体系一般采用聚乙二醇(polyethylene glycol作为其中一相成相物质,而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。
萃取原理
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。
当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示:
K= C上/ C下
其中K为分配系数,C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。
分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
其分配情况服从分配定律,即,“在一定温度一定压强下,如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里,达到平衡后,该物质在两相中浓度比等于常数”,分离效果由分配系数来表征。
由于溶质在双水相系统两相间的分配时至少有四类物质在两个不同相系统共存,要分配的物质和各相组分之间的相互作用是个复杂的现象,它涉及到氢键、电荷相互作用、范德华力、疏水性相互作用以及空间效应等,因此,可以预料到溶质在双水相系统中两相间的分配取决于许多因素,它既与构成双水相系统组成化合物的分子量和化学特性有关,也与要分配物质的大小、化学特性和生物特性相关。
大量研究表明,生物分子在双水相系统中的实际分配是生物分子与双水相系统间静电作用、疏水作用、生物亲和作用等共同作用的结果,形式上可以将分配系数的对数值分解为几项:
InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc
式中,Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献;
Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献;
Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献;
Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献;
Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献;
Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。
值得指出的是,这些因素中虽然没有一个因素完全独立于其它因素,但一般来说,这些不同的因素或多或少是独立存在的。
影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等。
双水相的优势
A TPE作为一种新型的分离技术,对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势:
(1含水量高(70%--90%,在接近生理环境的体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性;
(2可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质(或者酶,还能不经过破碎直接提取细胞内酶,省略了破碎或过滤等步骤;
(3分相时间短,自然分相时间一般为5min~15 min;
(4界面张力小(10-7~10-4mN/m,有助于两相之间的质量传递,界面与试管壁形成的接触角几乎是直角;
(5不存在有机溶剂残留问题,高聚物一般是不挥发物质,对人体无害;
(6大量杂质可与固体物质一同除去;
(7易于工艺放大和连续操作,与后续提纯工序可直接相连接,无需进行特殊处理;
(8操作条件温和,整个操作过程在常温常压下进行;
(9亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
虽然该技术在应用方面已经取得了很大的进展,但几乎都是建立在实验的基础上,到目前为止还没能完全清楚地从理论上解释双水相系统的形成机理以及生物分子在系统中的分配机理。
应用
双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域,并取得了许多成功的范例,主要是分离蛋白质,酶,病毒,脊髓病毒和线病毒的纯化,核酸, DNA的分离,干扰素,细胞组织,抗生素,多糖,色素,抗体等。
此外双水相还可用于稀有金属/贵金属分离,传统的稀有金属/贵金属溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境,对人体有害,运行成本高,工艺复杂等缺点。
双水相技术萃取技术引入到该领域,无疑是金属分离的一种新技术。
目前,用此法来提纯的酶已达数十种,其分离过程也达到相当规模,I-Horng Pan等人利用PEG1500/ NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化β-木糖苷酶,该酶主要分配在下相,下相酶活回收率96.3%,纯化倍数33;
双水相体系分类
高聚物/高聚物双水相体系
高聚物/无机盐双水相体系
低分子有机物/无机盐双水相体系
表面活性剂双水相体系。