将玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因转入到枯草芽孢杆菌内表达的实验步骤

将玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因转入到枯草芽孢杆菌内表达的实验步骤
1，在GenBank中查出玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因序列
ATGC GCACTCGCAG CACAATCTCG ACCCCGAATG GCATCACCTG GTACTATGAG CAGGAGGGTA CTGGACCCGA CGTTGTCCTC GTTCCCGATG GCCTCGGAGA ATGCCAGATG TTTGACAGCT CCGTGTCGCA GATTGCTGCT CAAGGCTTGA GGGTCACTAC GTTTGATATG CCCGGAATGA
CCCGGTCTGC CAAGGCACCA CCCGAGACCT ACACTGTCAT CTCCGTCCTG GATGCTCTTG
ACATCAAGCA CGCTACTGTC TGGGGCTGCA GCTCAGGAGC TTCCACCGTC GTGGCGCTGT
TGCTCGGTTA CCCCGACAGG ATACGCAACG CCATGTGCCA CGAACTGCCA ACAAAGCTAC
TGGACCACCT TTCAAACACC GCTGTGCTCG AAGACGAGGA AATCTCAAAG ATCCTGGCCA
ATGTAATGTT GAACGACGTG TCTGGAGGCT CGGAGGCGTG GCAAGCCATG
2，设计引物???
3，蜡样芽胞杆菌的培养基，选用营养肉汤培养基（蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g,PH为7.2± 0.2加热溶解于1000ml 蒸馏水中,分装三角瓶或试管, 121℃高压灭菌 15分钟备用）。

蜡样芽胞杆菌的生态习性：兼性好氧。

生长温度范围20～45℃，10℃以下生长缓慢或不生长。

存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。

在葡萄糖肉汤中厌氧培养产酸，从阿拉伯糖、甘露醇、木糖不产酸，分解碳水化合物不产气。

大多数菌株还原硝酸盐，50℃时不生长。

在100℃下加热20min可破坏这类菌。

4，
①、取蜡样芽胞杆菌的培养液4ml，用Trizol试剂对其进行裂解：提取细胞RNA 时，先离心沉淀细胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；
②、将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温15~30℃下放置5分钟；
③、在上述EP管中，按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15~30℃）放置2~3分钟后，12000g（2~8℃）离心15分钟；
④、去上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30℃）放置10分钟后，12000g（2~8℃）离心10分钟；
⑤、弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g （2~8℃）离心5分钟，弃上清；
⑥、让沉淀的RNA在室温在自然干燥；
⑦、用Rnase-free water （去核糖核酸酶水）溶解RNA沉淀。

加RNA抑制剂存于-80度冰箱备用
5，以上述步骤提取的mRNA为模板用反转录试剂盒合成cDNA.反转录体系：？？？？
6，以反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增。

PCR反应体系：
10 ×Buffer (不含M g离子) 4 uL ，M gC12(25 m m ol ／L )2.5 uL ，dNTP (2 m m ol／L ) 4 uL ，引物(3 m m ol／L )各1 uL，DNA 聚合酶(5U ／uL) 1uL ，模板DNA (5ng ) ，用无菌双蒸水补足至40uL ，PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 m in ；(94 ℃1 m in ，54 ℃45 S，68 ℃1 m in ) 共30 个循环，68 ℃10 m i n ，4 ℃保温。

反应结束后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测
7、枯草芽孢杆菌重组表达载体的构建
8，枯草芽孢杆菌的感受态细胞的制备
培养基，选用GM培养基
枯草芽抱杆菌感受态制备用培养基
(1)10 mL GM I 1 mL 10 X Sp izizen salts 0. 1 mL 10%酵母粉，0. 25 mL 20%葡萄糖，0. 2 mL 1%水解酪蛋白，0. 2mL 0. 25%所需氨基酸，补充灭菌蒸馏水至总体积10 ml
(2)10 mLGM2 1 mL 10 X Sp izizen salts 0. OS mL10%酵母粉，0. 25 mL 20%葡萄糖，0. 04 mL 1%水解酪蛋白，0.2mL 0.25%所需氨基酸，0. OS mL 0. 1mol/L CaCl2, 1 mL 25 mmol/LMgCl2，补充灭菌蒸馏水至总体积10 ml
挑取一新鲜培养的枯草芽抱杆菌单菌落接种于2.5mLGM I培养基中，30度130-150 r/min振荡培养过夜;将过夜培养物按10%接种量接种于2. 5 mL新鲜的GM I中，37度200-230 r/min振荡培养3. 5h再将培养物进行第二次传代，接种于5mLGM2培养基中，按5%接种量进行第二次传代，37度200-230 r/min 振荡培养90 min取1 mL培养物，5 000 r/min室温离心5min用1 /10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽抱杆菌感受态细胞。

9，转化子的PCR检测
将转化过的枯草芽孢杆菌的总DNA 提取，以提取的重组菌株的染色体D N A 为模板，用获得相应片段的引物对进行PCR 检测。

10，重组枯草芽孢杆菌的诱导表达
11，检测玉米赤霉烯酮降解酶活性。