LD50序贯法
传统霍恩氏法计算LD50替代方法概述
特点如下
固定剂量法设固定剂量以观察动物的试验反应, 观察指标是“明显毒性” ( clear sign on toxicity ) , 不以死亡为依据, 而是按毒性症状来判断受试物质的毒性, 故结果不是具体的LD50 值。 结果判定分为高毒、有毒、有害和毒性未分类等。
毒性等级法
1、背景 毒性等级法(Acute toxic class method)最初由Samiey 于1990 年提出, 用于危害评估危害分类以及危 险度评价, 它是以动物死亡作为实验终点的分阶段试验法。OECD于1992年采用了ATC，2001年更 新列为指南TG423，欧盟指令67/548/EEC附录V列为B.1tris。 2、原理 该法每次只选用3 个设定剂量( 25, 200, 2000 mg/kg) 之一, 单性别3 只动物进行试验, 根据上一个 步骤有无死亡以及死亡的动物数, 决定下一步的试验。根据预先设计好的判别表格进行毒性分级。 有3 种可能的结局: (1)无需进一步试验即可分级；(2)同一剂量水平再做3只动物； (3)在高一级或低一级剂量水平另做3只动物。
特点如下
大大减少实验动物的使用，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信限。 适用于动物染毒后1d~2d内死亡的受试物，对预期染毒死亡延迟至5d以上(含5d)的受试物不适用。
固定剂量法
1、背景 固定剂量法(fixed dose procedure, FDP),英国毒理学会于1984 年正式提出。 OECD于1992年采用了FDP，欧盟指令67/548/EEC附录V列为B.1bis, OECD 于2001年作为指南TG420。 2008年我国采用该方法为国家标准。 2、原理 使用一组固定的剂量( 5, 50, 500或2000 mg/kg), 分预试验与主试验两个阶段进行。 预试验采用单性别1只动物循序进行, 一般用雌性, 除非有资料和指征提示雄性更敏感。如受试剂 量无中毒表现, 而高一档剂量有动物死亡, 则需在其间插入剂量。 主试验根据预试验结果, 一般只需一个剂量, 雄雌动物各5 只。观察出现“明显毒性”, 实验终止; 不出现中毒表现, 需提高一档剂量试验; 出现死亡, 需降低一档剂量试验; 如2000 mg/kg预试验和 主试验都不出现中毒体征, 试验终止。结果以不出现与受试化学物相关死亡的最高剂量表示。
序贯法测定半数致死量
3. 观察注射不同剂量的药品时小 白鼠所产生的急性毒性反应、
出现反应的时间以及死亡情况。
实验材料
2.实验仪器
实验原理
序贯法：选择一系列按等比级数排列的药物 剂量，将动物一只一只序贯地进行试验。
先选择一个近50%反应率的剂量，当动物出 现阴性反应时就选用较高一级的剂量给予下 一只动物； 当出现阴性反应时，就选用较低一级的剂量 给予下一只动物。
序贯法测定半数致死量（������������������������）
目录
1. 实验目的
2. 实验材料
3. 实 结果讨论与分析
1.基本掌握半数致死量 (������������50)的测定方法
4.加深理解 ������������50的意义。
实验目的
2.学习小鼠 的基本实验 技术
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实验方法
随机取鼠
腹腔注射 0.2mL/10g
观察 10min
阳性：降低一级药 物浓度注射下一只
阴性：增加一级药 物浓度注射下一只
记录数据
计算
实验结果
结果讨论
1.随着药物剂量的增加，小鼠的反应如何？ 2.本实验测出的LD50与书本上的是否相同？ 为什么？有哪些因素影响了实验结果？ 3.LD50的测定有何意义？
药理学实验课讲义（24学时）-1
药理学实验课讲义（24学时）-1实验一：不同给药途径对药物作用的影响【目的】1．掌握硫酸镁的药理作用。
2．掌握小鼠灌胃给药及腹腔注射的方法。
3．观察硫酸镁不同给药途径产生的药理作用是否相同。
【原理】硫酸镁是一个典型的不同给药途径产生不同药理作用的药物，其口服在胃肠道形成高渗透压，使肠腔外水份向肠腔内渗透，最终导致肠容积增大，对肠壁刺激增加，导致肠蠕动加快，出现泻下作用。
静脉注射硫酸镁主要作用有：抑制中枢神经系统、扩张血管降低血压、阻断神经肌肉接头产生肌松作用等。
【材料】1. 动物小白鼠6只2. 药品 15%硫酸镁3. 器材小鼠灌胃器、注射器、针头、小天平【方法】1. 小白鼠标号、称重、分组。
2．Ⅰ组 i.p. 15%MgSO4溶液 0.2ml/10gⅡ组 i.g. 15%MgSO4溶液 0.2ml/10g3．以存活或死亡观察小鼠灌胃及腹腔注射等量硫酸镁所致药物效应不同。
【思考题】1．给药途径不同，为什么会影响药物作用？2．比较各种给药途径的优缺点？实验二：有机磷农药中毒与解救【目的】观察有机磷农药中毒的症状及阿托品、解磷定二药对有机磷农药中毒的解救效果，初步分析其解救原理。
【实验原理】有机磷农药能与胆碱酯酶牢固结合，使之失去水解Ach的活性，造成突触间隙Ach大量堆积而产生一系列中毒症状（M样、N样症状等）。
阿托品是M受体阻断药、氯磷啶是胆碱脂酶复活药，可不同程度的解救其中毒症状。
如阿托品解除M样症状，但对肌震颤无效；解磷定可使胆碱酯酶复活，对肌震颤有效。
【材料】1．动物：家兔2．药品：10%敌百虫溶液、0.1%硫酸阿托品溶液、2.5%解磷定溶液3．器材：兔箱、注射器、5#针头、台式磅秤、瞳孔尺【方法】1．取家兔1只，称重后分别观察下列各项指标：全身状况、活动情况、呼吸（次数、有无呼吸困难、呼吸道有无分泌等），瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌张力及有无肌震颤等，记录在表内。
2．耳缘静脉注射10%敌百虫溶液1ml/kg，密切观察上述的各项指标。
【医学超级全之药理机能实验】序贯法测定LD50(精)
药理学教研室
一、原理
LD50概念：使群体动物50％死亡的剂量 群体动物最小致死量的几何均数
二、实验方法
【实验目的】 【实验材料】 实验药品：普鲁卡因 实验动物：小鼠 【实验步骤】 ⒈ 预先拟定剂量分组； ⒉ 选取任一剂量组，按0.2ml/kg对小鼠腹 腔注射，观察动物死亡与否（10min）； ⒊ 根据上一动物死亡情况确定下一动物剂 量，依次进行至最后一只动物。
1 2 3 4
＋
－ ＋ ＋ － ＋ － － － ×
5
6
－
【实验结果计算】
剂量 (D) mg/kg 1 2 3 4 5 6 lgD (X)
实验结果
S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 F r X*r
＋ － ＋
＋
－
－
＋
＋ ＋ ×
—
LD50 lg 1
X r r
序贯法测定LD50操作示意图
剂量 (D) lgD (X)
实验结果
S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 F r X*r
1 2 3
＋ － ＋ －剂量单位为mg/kg；本例仅为模式图
特殊情况处理
剂量 (D)
lgD (X)
实验结果
S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 F r X*r
【医学超级全之药理机能实验】序贯法测定LD50
1 2 3 4
＋
－ ＋ ＋ － ＋ － － － ×
5
6
－
【实验结果计算】
剂量 (D) mg/kg 1 2 3 4 5 6 lgD (X)
实验结果
S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 F r X*r＋ － ＋＋来自－－＋
＋ ＋ ×
—
LD 50 lg
1
X r r
序贯法测定序贯法测定ld50ld50操作示意图操作示意图剂量1011特殊情况处理特殊情况处理剂量1011实验结果计算实验结果计算剂量mgkglgd101150lg
序贯法测定LD50
药理学教研室
一、原理
LD50概念：使群体动物50％死亡的剂量 群体动物最小致死量的几何均数
二、实验方法
【实验目的】 【实验材料】 实验药品：普鲁卡因 实验动物：小鼠 【实验步骤】 ⒈ 预先拟定剂量分组； ⒉ 选取任一剂量组，按0.2ml/kg对小鼠腹 腔注射，观察动物死亡与否（10min）； ⒊ 根据上一动物死亡情况确定下一动物剂 量，依次进行至最后一只动物。
序贯法测定LD50操作示意图
剂量 (D) lgD (X)
实验结果
S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 F r X*r
1 2 3
＋ － ＋ － － ＋ ＋ ＋ ＋ － ×
4
5 6
注：剂量单位为mg/kg；本例仅为模式图
特殊情况处理
剂量 (D)
lgD (X)
实验结果
S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 F r X*r
药理学实验指导
实验一 半数致死量的测定
半数致死量（LD50）是药物、毒物及病原微生物等毒力水平的一个标志。它表示能使 全部实验对象死亡半数的剂量或浓度。由于生物间存在个体差异性，因此 LD50 需用一批 相当数量的实验对象进行实验方能测得，并且每种药物对不同实验对象的 LD50 值不同。
【实验目的】 1. 掌握半数致死量测定的基本方法和寇氏法的适用条件。 2. 熟悉动物的常用分组方法。 3. 了解寇氏法公式的推导过程。 【实验条件】 寇氏法（Kärbar 氏法） 测定 LD50 的方法有很多，如目测机率单位法、直线回归法、累计法、序贯法以及 Bliss 法等。其中 Bliss 法为最经典、最准确的方法，但需要用计算机和相应软件来完成。由 于寇氏法较常用，并有计算简便，结果较准确等特点，故专门介绍之。 【实验条件】 1. 剂量必须按等比级数（剂量对数按等差级数）分组。 2. 各组动物数应相等。 3. “反应”应大致呈正态分布。最小剂量组的死亡率（Pn）应为 0％，最大剂量组 的死亡率（Pm）应为 100％；如果 Pn < 20% 或 Pm > 80% 需用校正公式计算；如 Pn > 20% 或 Pm < 80% 则不能用此法计算。 【实验动物】 小白鼠 【实验药品】 不同浓度敌百虫、苦味酸 【实验器材】 鼠笼、动物天平、1ml 注射器、电子计算器 【实验步骤】 １．预备实验 ①摸索上下限：即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最小剂量（Dm）和一个 动物也不死亡的最大剂量(Dn)。方法是据经验或文献定出一个估计量， 观察 2～3 只动 物的死亡情况。如全死，则降低剂量；如全不死，则加大剂量再行摸索，直到找出 Pm = 100 % 和 Pn = 0% 的剂量，此两量分别为上下限。
⑷计算注意事项：①发令后开始计算；时间到，立即停止计算。 ②实验开始后，一定尽全力进行计算。③中间对计算结果不能修改，否则统计时按 错误计算。
药物半数致死量LD测定
n=实验动物数+1
表2 尼可刹米的LD50实验用表
剂量(mg/kg)
实验结果
F S R X*R
1430
1000 +① +③
20 2 6
- 700
+④ +⑥ +⑩ 3 1 4 11.38
② 490
- - +
+ 1 2 4 10.76
343
⑤ - ⑨ ⑦
0 1 1 2.535
⑧ LD50=lg-1( C/n )
药物半数致死量 （LD50）的测定
实验要求
▪掌握测定药物LD50和ED50的药理学 意义和方法（改进寇氏法） ▪熟悉序贯法的特点、实验方法和计 算方法
【相关知识】 ED50(median effective dose)： 在一定的实验条件下,一定数量的动物 用药后，约半数实验动物出现疗效的药 物剂量。
LD50(median lethal dose)：
治疗指数(therapeutic index TI)： LD50和ED50的比值，药物安全性指
标。
安全范围(margin of safety)：
LD5/ED95的值或 LD5 ~ ED95之间的距离。
LD50 、ED50的意 义
▪ 反映药物急性毒性大小和药理作用的强弱
生理科学实验的实验设计
医学实验研究的基本程序 实验设计的三大要素 实验设计的三大原则 实验设计的纲要
医学实验研究的基本程序
⑴立题 ⑵建立假说 ⑶实验设计 ⑷实验准备
医学实验研究的基本程序
⑸预备实验 ⑹正式实验 ⑺结果的分析处理 ⑻撰写论文
1.立题
医学科 学研究
在医学实践中暴露出来的矛盾，一些想解 释又无法解释的现象，想解决又无法解决的问 题，都是医学研究的课题。
药理实验半数致死量专家讲座
一、寇氏法 寇氏法是Kaeber（1931年）提出，又称平均法
它是依据对数剂量与致死百分数呈S形曲线， 由S形曲线包含面积推导出致死百分率为50%相 当剂量。
药理实验半数致死量专家讲座
第九章 半数致死量
药理实验半数致死量专家讲座
第1页
本章重点
✓半数致死量基本概念 ✓寇氏法、目测概率单位法和序贯法等计算半数 致死量方法 ✓半数致死量试验设计方法。
药理实验半数致死量专家讲座
第2页
第一节 半数致死量概述
在动物毒理学和药理学研究中，通惯用试验动 物对某种药品、毒物、细菌及理化刺激等反应来测 定其效力或毒性。
药理实验半数致死量专家讲座
第13页
第二节 半数致死量测定方法
【例】 为了研究铵碘消毒剂对建鲤毒力影响，随机
捞取210尾规格基本一致鲤鱼，放入缸内，每缸30尾，
1组对照，6组处理。以等对数间距设置6个剂量水平
（单位：
）分mL别/ m为3：40.000、47.156、55.592、
65.538、77.262、91.085，量取药液并加入缸内，搅
第29页
第二节 半数致死量测定方法
三、序贯法 序贯法是最能节约试验动物一个方法，又称“上下
法在”确。定因为其L时把D含50计有量很集高中效用率在。50%反应率上下，所以 其普通方法是：依据以前经验选择一个近50%反应
率等比级数剂量组，通惯用4-6个剂量组，然后将动物 一只一只有序地进行试验，当动物出现阴性反应时， 就选取较高一级剂量给予下一只动物，当出现阳性反 应时，就选取较低一级剂量给予下一只动物，直到试 验结束，试验所需动物总数n应在试验开始前决定。
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LD50的意义：
LD50为半数致死浓度或半数致死量，是指以死亡为阳性药效反应、能使半数细胞或者动物死亡的浓度或者剂量。
作为反映毒力的定量指标，按理说应以该药能使细胞或者动物刚好致死的剂量的平均值最有代表性。
已有大样本动物实验证实，LD50相当于最小致死量。
由此可知，LD50以下的浓度或剂量为试验用药的安全浓度或安全剂量
药物浓度实验设计
我认为最实用的是“序贯法” 将细胞等量分组序贯地进行预实验，这时不用非要按照等比序列稀释药物。
选定大致致死量时，常配成10倍稀释或2倍稀释的一系列药液。
先用某一剂量，如不能致死动物则下一次用高一级剂量；如使动物死亡，则用低一级剂量。
如此序贯进行，当分组较细时，可以测得LD50，此法适用于短期内能判断死活的实验，个人认为比较适合测定药物细胞毒性。
在新药测定LD50时可用序贯法找寻致死量的大致范围。
当然，也可以先按照10倍稀释寻找大致范围，然后进一步按照2倍稀释来确定最终的LD50，这也就是所谓的“两步法”寻找药物致死的范围。
孙瑞元点斜法公式：这个计算方法是最简单实用的一种。
LD50=log-1【Xm-i（∑p-0.5）+i/4*(1-Pm-Pn)】
如果含有0%及100%死亡率时
LD50= log-1Xm-i（∑p-0.5）
备注：Xm为最大对数剂量；i为组距，组距要相等，即剂量或浓度成等比数列，例如：等比数列的比值为1：0.7，则i=log(1/0.7)=0.155; Pm为最高死亡率；Pn为最低死亡率。