传统霍恩氏法计算LD50替代方法概述
特点如下
固定剂量法设固定剂量以观察动物的试验反应, 观察指标是“明显毒性” ( clear sign on toxicity ) , 不以死亡为依据, 而是按毒性症状来判断受试物质的毒性, 故结果不是具体的LD50 值。 结果判定分为高毒、有毒、有害和毒性未分类等。
毒性等级法
1、背景 毒性等级法(Acute toxic class method)最初由Samiey 于1990 年提出, 用于危害评估危害分类以及危 险度评价, 它是以动物死亡作为实验终点的分阶段试验法。OECD于1992年采用了ATC，2001年更 新列为指南TG423，欧盟指令67/548/EEC附录V列为B.1tris。 2、原理 该法每次只选用3 个设定剂量( 25, 200, 2000 mg/kg) 之一, 单性别3 只动物进行试验, 根据上一个 步骤有无死亡以及死亡的动物数, 决定下一步的试验。根据预先设计好的判别表格进行毒性分级。 有3 种可能的结局: (1)无需进一步试验即可分级；(2)同一剂量水平再做3只动物； (3)在高一级或低一级剂量水平另做3只动物。
特点如下
大大减少实验动物的使用，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信限。 适用于动物染毒后1d~2d内死亡的受试物，对预期染毒死亡延迟至5d以上(含5d)的受试物不适用。
固定剂量法
1、背景 固定剂量法(fixed dose procedure, FDP),英国毒理学会于1984 年正式提出。 OECD于1992年采用了FDP，欧盟指令67/548/EEC附录V列为B.1bis, OECD 于2001年作为指南TG420。 2008年我国采用该方法为国家标准。 2、原理 使用一组固定的剂量( 5, 50, 500或2000 mg/kg), 分预试验与主试验两个阶段进行。 预试验采用单性别1只动物循序进行, 一般用雌性, 除非有资料和指征提示雄性更敏感。如受试剂 量无中毒表现, 而高一档剂量有动物死亡, 则需在其间插入剂量。 主试验根据预试验结果, 一般只需一个剂量, 雄雌动物各5 只。观察出现“明显毒性”, 实验终止; 不出现中毒表现, 需提高一档剂量试验; 出现死亡, 需降低一档剂量试验; 如2000 mg/kg预试验和 主试验都不出现中毒体征, 试验终止。结果以不出现与受试化学物相关死亡的最高剂量表示。
上下增减剂量法
替代方法概述
文献
固定剂量法
毒性等级法
固定浓度试验法
霍恩氏法
特点如下
机率单位-对数图解法
特点如下
寇氏法
特点如下
在应用时必须满足 3个条件: ①反应量大致呈正态分布,即最低被度出现反应率 0% (Pn=0) ,最高浓度出現反应率l00% (Pm= 1) ; ②浓度必须按等比级数分布; ③各组动物数相等。 虽有条件限制，但此法简便有敏、易于掌握, 因此仍是最常用的LC50计算方法之一。
本方法是2002 年10 月OECD 对TG403 的最新修订( TG433)。与固定剂量试验法相似, 采用观察试验和主试验。 不同形态物质的固定试验浓度范围不同: 蒸汽是0. 5, 2. 0, 10. 0, 20. 0 mg/kg, 烟、尘是0. 05, 0. 50, 1. 0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ, 5. 00 mg/kg; 观察试验和主试验均只做到最高浓度, 即20. 0, 5. 0 mg/kg。
3 种 方 法 的 比 较
上下增减剂量法
固定剂量法 毒性等级法
GB 15670-2017
序贯法 (Up and Down Procedure) 亦称上下增减剂量法。 霍恩氏法(Horn's method) 亦称改良维氏法或简化概率单位法。 采用几何级数的四个递次剂量，各个剂量组动物数相同，染毒后根据每组动物的死亡数， 从计算表格中查找受试物的LD50和95%可信区间。 概率单位法 (Miller and Taninter's method) 亦称目测法或对数概率单位绘图法。以灌饲法经口给各试验组动物不同剂量的受试物。 染毒剂量的选择可通过预试验确定。染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。 试验期间死亡动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物应人道处死并进行大体解剖。
特点如下
ATC不能用以精确估计LD50的值, LD50的值可以根据提供的数据使用最大相似法进行计算。 该方法同样也适用于对LD50的置信限, 死亡剂量反应曲线及其置信限的估计。 分类法能够发展并成为监管机构认可的方法一方面是因为它有较高的正确率, 另一方面则是它的操作在实际应用中足够简便。
固定浓度试验法
急性经口毒性测定方法调研
GB 15670-1995 (2018-2-1 废止)
GB 15670-2017 (2018-2-1 实施) 文献
霍恩氏法
GB 15670-1995
(2018-2-1 废止)
机率单位-对数图解法
寇氏法 序贯法
GB 15670-2017
(2018-2-1 实施)
霍恩氏法
概率单位法
上下增减剂量法
1、背景 上下增减剂量法(Up-and-Down Procedure, UDP)由Dixon和Mood于1948年首次提出。 1985年Bruce进行了改进。 OECD最早于1998年采用UDP，期间几经更新并于2006年更新列为指南TG425。 2008年我国采用该方法为国家标准(GB/T 21826-2008)。 2、实验原理 限度试验分为2000和5000mg/kg两个剂量水平,最多仅用5只动物。 主试验是一个预先设计的染毒程序, 每次染毒1只动物, 由第1只动物染毒后的反应决定第2个动物接受 化学物的剂量, 若动物存活, 第2只动物给予高一级剂量,若第1只动物死亡或出现濒死状态, 第2只动物 给予低一级剂量。在对每只染毒动物仔细观察48h后, 可以决定是否对下1只动物染毒以及确定染毒剂 量。当满足停止试验的标准时可以结束试验。根据终止时所有动物的状态, 用最大可能性法计算LD50 值。实验需要选择一个比较合适的剂量范围, 使得大部分的动物所接受的化学物剂量都会在真正的平 均致死剂量左右。如果剂量范围过大, 则需要有更多的动物来进行观察。
谢谢
LD50测定盛瑞PPT精品文档20页
50%
LD50
dose
4
LD50测定的意义
是药物筛选的第一步，药物安全性评价 的第1道关卡。
初步估计该药的安全性
TI=LD50/ED50 TI值越大，就越安全
提供药物毒性的基本资料：症状、靶器 官、剂量
5
方法和步骤
1.动物选择 Various species are used for LD50 tests.
LD50 stands for Median Lethal Dose, in other words, the dose of a substance that will kill half the test animals.
3
以死亡率做纵坐标，剂量做横坐标，常呈一个长尾“S” 形曲线。这条曲线两端平缓，中间陡峭，在反应率50% 处斜度最大，LD50是剂量反应曲线上最敏感的一点。
溶液浓度。 实验动物的种系、性别、体重范围、分组情况、
给药途径、剂量、给药时间、给药后的中毒症 状、死亡时间和死亡率。 LD50的计算过程和结果（包括LD50值和95% 可信限范围）
14
Number
1 2)
Injection volume (ml)
Large numbers of rats and mice are used, but sometimes dogs and rabbits are also included . 小鼠，18-22g，雌雄各半，健康
6
2.剂量分组
首先摸索合适剂量范围，测出0%和 100%死亡的剂量范围
在预试验所获得的0%和100%死亡的剂 量范围内，选用几个剂量组（小鼠一般 不少于5个剂量组，按等比级数增减， 相邻组间比一般取1:0.8~1:0.7），尽可 能使半数组的死亡率在50%以上，另半 数组死亡率在50%以下。
霍恩氏法解读
霍恩氏法解读
霍恩氏法是一种统计学中常用的方法，主要用于计算样本的标准误（ standard（error）。
标准误是样本统计量（ 如样本均值、样本比例等）的标准差，它衡量了样本统计量与总体参数之间的差异。
霍恩氏法在计算标准误时考虑了样本中的有限样本调整，特别是在样本容量较小时，可以更准确地估计标准误。
霍恩氏法的计算公式如下：
霍恩氏法的核心思想是，在计算标准误时，考虑了样本容量相对于总体容量的比例关系。
当样本容量与总体容量相等时，霍恩氏法的标准误就等于普通的标准差。
但当样本容量远小于总体容量时，霍恩氏法会对标准误进行修正，以考虑样本容量相对较小可能引入的抽样误差。
使用霍恩氏法可以更准确地估计样本统计量的精确度，尤其是在样本容量较小时，它能够提供更可靠的结果。
在统计学中，了解如何正确地计算和解释标准误是非常重要的，因为它直接影响到对样本统计量的解释和推断的可靠性。
半数致死量计算..
• • • • • • • SlogLD50=i. √(∑P-∑p2)/(n-1) • • • • =0.1218×√(3.5-2.65)/(10-1)
=0.03743
LD50的95%可信区间为： Log-1(3.3654±1.96×0.03473)
= Log-1(3.2920～3.4388) =1958.84～2746.63mg/kg
• 三、概率单位图解法
• (一)本法基本要求： • 1.资料呈对数正态分布； • 2.剂量分组一般取等比级数,也可为等差或 不等距的数值； • 3.各剂量组的动物数要求相等或相近； • 4.由于在理论上死亡率不存在0％和100％, 所以0％更为0.25/N,100％改为（1-0.25）/N • • • • N为该组的动物数.
b＝（y2-y1)/(x2-x1)
毒性分级标准
表 化合物经口急性毒性分级标准
小鼠一次 大约相当体重 70kg 毒性分级 经口 人的致死剂量 LD50(mg/kg) 6 级，极毒 <1 稍尝，<7 滴 5 级，剧毒 1～50 7 滴～1 茶匙 4 级，中等毒 51～500 1 茶匙～35g 3 级，低毒 501～5000 35～350g 2 级， 实际无毒 5001～15000 350～1050g 1 级，无毒 >15000 >1050g
半数致死量计算
--介绍几种常用的计算方法
目的 掌握主要的LD50计算方法和急性毒性分 级标准。
一、改进(良)寇氏法
• (一).本法要求：
• • • • 1.反应情况符合或接近对数正态分布；
• • • • 2.剂量必需为等比级数(几何级数)；
• • • • 3.各组动物数相等或相近；
• • • • 4.最低剂量组动物死亡率<20％；
乙醇小鼠急性经口毒性评价
六、急性毒性分级和评价：
急性毒性试验求出LD50(LC50）值，通过LD50(LC50）值进行 急性毒性分级，评价化学物的急性毒性强弱，比较化学物的 急性毒性大小。 联合国世界卫生组织（WHO）推荐了一个5级标准。
表3-1
WHO急性毒性分级
我国2003年颁布实施的《食品安全性毒理学评价程序和方法》中 提出急性毒性分级的6级标准
四、霍恩氏(Horn)法
原理：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Horn氏法，又叫平均移动法、剂量递增法，是利用剂 量对数与死亡率(反应率)的转换数(即机率单位)呈直线 关系而设计的方法。
100%
Mortality %
Probit Units
Cumulative distribution
Probit transformed
7 5
50
LD50
0
Log Dose
3
Straight line (easier to analyze)
Log Dose
设 计 原 则:
4个剂量组； 每组动物数相等； 每组5只； 剂量可选用两个剂量系列，其组距分别为2.15倍和3.16 倍。 查表求LD50及其95％可信限。
霍恩氏（Horn）法LD50值计算用表
用5个剂量时，
LDk的可信限= log-1(logLDk + 1.96 S ) (P=0.95) X ----为对数剂量； i-----为相邻两组剂量比值（以高剂量组为分子）的对数； y-----为死亡率相应的机率单位（查附表）； 1、2、3、4、5…为小剂量组到大剂量组的顺序。 yK----为LDk所相当的反应率的机率单位 W----为权重系数（查表）
0.0 0.2 0.5 0.7 0.9 1.59
第6章 LD50计算
⑴ Statistics:统计量多选项。
Frequencies:频数 （系统默认值）。输出每个观测值的实际 频数和理论频数；
Relative median potency:相对中位数潜力;
Parallelism test:平行检验;
Fiducial confidence intervals:置信可信性区间，（系统默 认值）;
小鼠的经口LD50为4.29g/kg 95%可信范围为3.74~4.93g/kg。
二、 概率单位法
急性毒性试验方法
九灵胃康在小鼠的经口急性毒性试验结果
组别 1 2 3 4 5 6
剂量g/kg 2.07 2.69 3.50 4.55 5.92 7.69
死亡数(n) 0 2 3 5 8 10
动物数(n) 10 10 10 10 10 10
随着计算机的普及，现有编好的Bliss程序，Bliss法已成为最 常用的急毒试验方法。
LD50的计算
急性毒性试验方法
LD50的测定是以动物死活为指标的质反应，当死亡 呈正态分配时，一般具有以下特点：
剂量对数值与死亡率之间为“S”型曲线； 剂量对数值与概率单位之间为直线关系； 从实验数据可计算LD50以外的其它信息。
Model s/n=d/lackfit intervals;
Run;
急性毒性试验方法
急性毒性试验方法
急性毒性试验方法
急性毒性试验方法
SPSS v10.0 的窗口
spss 分析步骤为： ⑴录入数据：如图1 。
急性毒性试验方法
图1
⑵选择方法：选择Analyze菜单下的Regressio急n性项毒中性试的验方法 Probit命令(如图2)，打开Probit Analyze对话框(如图3) 。
计算ld50的查表法和经验估算法
计算ld50的查表法和经验估算法
LD50是指通过嘴部和皮肤接触的某一物质，而且可以让50%的有害生物产生致死的剂量。
为了计算LD50，有两种方法：查表法和经验估算法。
查表法是一种精确的计算LD50的方法，可以从专业的资料中查询物质的LD50值，精巧无误。
查表法具有较高的准确性，可以使计算结果更快，而且任何人都可以使用，节省大量的时间。
经验估算法是一种根据上述经验计算LD50的方法，其目的是估算物质所需的剂量，以获取有效的结果。
它基于业界技术规范，可以完成对LD50的经验测算，得到一个比较准确的结果。
总的来说，通过查表法和经验估算法可以更方便，更快速地计算LD50。
然而，这两种方法都是有可能出现误差的，因此应该根据实际情况，综合考虑各方面因素，确定计算结果的可靠性。
除此之外，计算LD50还需要相关专业知识和技能的运用，以确保精确的计算结果。
LD50的测定方法
LD50的测定⽅法
LD50的测定⽅法
LD50的测定⽅法有三种：概率单位法（Bliss法）、累计法（Reed-Muench、Karber）、序贯法概率单位法：
1、进⾏实验：死亡率为10%-50%、50%-90%的组数各占⼀半。
死亡率为
0%和100%时，舍去不⽤
2、数据转换：计算剂量对数x和死亡率概率单位y
3、对x和y进⾏回归分析，求出回归⽅程
4、由回归⽅程计算当y=5时的x值
5、取x值的反对数得到LD50
如某农药对急性⼤⽩⿏的LD50测定计算
得：
累积法测定LD50
1、剂量组按等差或等⽐级数分5-8组
2、死亡率在0-100%之间
3、分别累计各组动物死亡总数和存活总数
4、分别求各组的累计动物死亡率
5、⽤线性插值法求半数致死量
例：
序贯法测定
1、做实验:从接近LD50的各组动物组数n剂量开始，等⽐级数分4-6组；⼀只⼀只动物进⾏，阳性，下⼀只动物⽤低⼀级剂量，反之，则相反
2、计算各组动物数
3、计算各组动物组数n与剂量对数x的乘积之和：∑nx
4、计算LD50的对数值：∑nx/∑n
5、取反对数得到LD50。
[整理版]ld50
实验十六生理与病理状态的LD50测定【实验目的】熟悉药物半数致死量（LD50）的测定原理、方法、计算及意义。
【实验原理】任何药物超过一定剂量时均会损害机体的组织、器官，引起各系统功能紊乱，直至死亡。
LD50是以动物死活的质反应为指标的毒性数据。
药物的剂量与死亡率之间呈常态分布曲线，与累积死亡率之间呈长尾“S”形曲线，药物的对数剂量与累积死亡率之间呈对称“S”形曲线。
此量效曲线两端平坦，反应灵敏度差，中间段陡，反应灵敏。
而以50%处最敏感，剂量稍有变化，死亡率就有明显变化，故常以引起半数动物死亡（LD50）或半数动物产生阳性效应（ED50）的剂量作为衡量药物毒性或效应大小的最常用、最恰当的指标。
若将反应率转换为机率单位，则对数剂量与机率单位之间呈直线。
测定LD50的方法很多，有蔻氏法、目测法、机率单位法、bliss法（正规机率单位法）等，本实验用的是简化机率单位法。
【实验动物】小白鼠10只，体重20g左右。
【药品与器材】1%盐酸普鲁卡因溶液、苦味酸。
天平、注射器1ml×1、鼠笼。
【实验步骤】LD50的测定（简化机率单位法）1．动物的分组方法：取小白鼠20只，称重，随机分为2个不同状态组，每组10只。
2．其中1组动物分别注射肾上腺素为病理状态组。
3．再将每组动物随机分为5个剂量组，每组2只。
4．各组分别腹腔注射不同剂量的1%盐酸普鲁卡因溶液，观察并记录给药后动物反应（中毒症状、外观、行为、呼吸、腺体分泌、大小便等情况），记录动物死亡时间及死亡数。
5．半数致死量的计算：汇集全班结果，求LD50。
表6-6 LD测定记录表【统计与处理】LD50的计算：用对数剂量（x = log D）与机率单位（y）进行直线回归（y = a + bx），以预期机率单位5（50%死亡率）代入公式，求得x即为LD50。
现用Casio-fx-180P计算器处理实验数据：INV KAC，Mode 2输入x按X D Y D，输入y按DA TAINV A （a）INV B (b)INV r(r)5 INV x，INV 10x (LD50)【注意事项】1．测定LD50前，要进行预实验，摸索接近100%和0%死亡的剂量范围。
LD50计算方法之—Horn氏法(霍恩法)
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Horn氏表2-2 每组4只动物，组距2.15倍
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Horn氏表2-3 每组4只动物，组距2.15倍
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Horn氏表3-1 每组5只动物，组距3.16倍
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Horn氏表3-2 每组5只动物，组距3.16倍
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Horn氏表3-3 每组5只动物，组距3.16倍
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Horn氏表4-1 每组5只动物，组距2.15倍
LD50计算方法之—Horn氏法
原 理 Horn氏法，又叫平均移动法、剂量递增法，是利用剂量对数与死亡率(反应率)的转换数(即几率单位)呈直线关系而设计的方法。
设 计 原 则 4个剂量组； 每组动物数相等； 每组4只或5只； 设计剂量时可根据化学物致死剂量范围的宽窄应用两个剂量系列，其组距分别为2.15倍和3.16倍。 根据每组动物数、组距和每组动物死亡数，即可从Horn氏表中查得LD50及其95％可信限。
细菌半数致死量测定
预试验找出引起0%死 亡率和100％死亡率剂 量的所在范围
反应量大致呈正态分布
剂量必须按等比级数分 布
各组动物数相等
2、累计法（Reed-Muench法）
它是先将实验死亡动物数和存活动物数进 行累计加和, 再用加和的数据计算死亡率。 在死亡率中有2个数据A和B,且A刚好大于 50%,B刚好小于50%
测量菌 落大小
离心收 集菌体
100mLBHI 液体培养基
挑取理 盐水重悬
平板菌落计 4℃保存用 数法计数 于攻毒
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
10-9
记录平板上菌落数 量，肉眼观察+放 大镜检查
30℃倒置 培养24h
4 4.4×108 5
2 3 6 2 2/8 22.2%
5 1.5×108 5
0
LD50=4.2×107CFU/mL
5 11 0 0/11 0.0%
数据汇总：
组别 稀释比例
1
原液
2
1:3
3
1:9
4
1:27
5
1:81
死亡率 100% 90.0% 62.5% 22.2% 0.0%
7、LD50计算 距离比例r=（高于50%死亡率－50）÷（高于50%死 亡率－低于50%死亡率）
表1 HX4菌对斑马鱼的毒力（LD50）
组 别
剂量 CFU/mL
只数
死亡 数
存活 数生
累计结果(result)
死
死亡 比例
死亡率
1 1.2×1010 5
5 0 0 14 14/14 100.0%
2 4.0×109 5
4 1 1 9 9/10 90.0%