昆虫细胞培养手册
壹生科 IB905 昆虫细胞全悬浮培养基 使用说明书
IB905昆虫细胞全悬浮培养基使用说明书YSK-TS-ZK-401-00目录一、产品概述 (1)二、订购信息 (1)三、产品参数 (1)四、使用范围 (1)五、配制过程 (2)六、储存条件 (2)七、培养基适应 (2)八、昆虫悬浮细胞冻存 (4)九、昆虫悬浮细胞复苏 (4)一、产品概述IB905是一款昆虫细胞通用型无血清全悬浮培养基，广泛应用于昆虫杆状病毒表达平台。
二、订购信息表1订购信息产品名称液体固体货号规格货号规格IB905L110011L Y10411L-100L三、产品参数表2IB905培养基产品参数理化特性外观澄清浅黄色液体均匀细致粉末pH 6.35-6.45渗透压400-430mOsm/kg内毒素≤10EU/mL 是否含有谷氨酰胺是细胞相关适用细胞H5、SF9倍增时间24h 保质期保质期限（固体）20个月保质期限（液体）12个月四、使用范围仅用于科研及工业生产，不能用于人体。
五、配制过程IB905培养基含有三个组分：表3IB905配方量组分配方量Part137.898g/LPart25g/LPart3（液体）1mL/LIB905配制说明：5.1.确定配制总体积，选择两个容器进行配制，其中容器1体积大于总体积，容器2体积大于总体积10%；5.2.按照配方量在容器1中加入Part1培养基粉末，再加入约配制总体积80%的超纯水或注射用水，建议机械搅拌30min；5.3.按照配方量在容器2中加入Part2培养基粉末，再加入约配制总体积10%的超纯水或注射用水，建议机械搅拌30min；5.4.将溶解后的容器2中的液体移入容器1中混合；5.5.按照配方量体积加入Part3液体培养基的量；5.6.利用5M的NaOH调整pH至6.35-6.45；5.7.建议机械搅拌至少60min至粉末全部溶解；5.8.加入超纯水或注射用水至最终目标体积；5.9.无菌过滤。
注：Part1和Part2需分开溶解，以保证培养基的滤过性。
昆虫细胞培养基-sf-900 ii sfm 1x液体版 说明书
Sf-900™ II SFMDescriptionSf-900™ II SFM is a complete, serum-free, protein-free, ready-to-use insect cell culture medium developed for high cell-density growth and high-level recombinant protein expression using the Baculovirus Expression Vector System (BEVS). Sf-900™ II SFM has optimized amino acid, carbohydrate, vitamin, and lipid components, as well as a biologically active raw material providing significant improvement in cell growth, virus production and recombinant protein expression over other serum-free or serum-supplemented media. Sf-900™ II SFM supports long term growth (>20 passages) of Spodoptera frugiperda (Sf9, Sf21), Trichoplusia ni (Tn-368), and Lymantia dispar (Ld) cells in both suspension and monolayer culture.Product Catalog No. Amount Storage Shelf life*Sf-900™ II SFM (1X), liquid 10902-09610902-15310902-08810902-104500 mL10 × 500 mL1000 mL6 × 1000 mL2°C to 8°C; Protect from light 12 monthsSf-900™ II SFM (1X), liquid, Universal Bag 10902-16110902-17910902-187 5 L10 L20 L2°C to 8°C; Protect from light 12 monthsSf-900™ II SFM (1X), liquid w/out methionine or cysteine 21012-026 500 mL 2°C to 8°C; Protect from light 12 months * Shelf life duration is determined from Date of Manufacture.Product useFor Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Important informationSf-900™ II SFM is a complete, ready to use medium. Do not addL-Glutamine or surfactants such as Pluronic® F-68.Safety informationRead the Safety Data Sheets (SDSs) and follow the handling instructions. Wear appropriate protective eyewear, clothing, and gloves.Culture ConditionsMedia: Sf-900™ II SFMCell line: Sf9, Sf21, Ld, Tn-368 cellsCulture type: Suspension or AdherentCulture vessels: Shake flask, spinner bottle or T-flask. Temperature range: 27°C to 28°CIncubator atmosphere: Non-humidified, air regulated non-CO2 atmosphere. Ensure proper gas exchange and minimize exposure of cultures to light.Recovery1.Rapidly thaw (<1 minute) frozen cells in a 37°C water bath.2.Transfer entire contents of the cryovial into theappropriately sized vessel so that the cells are seeded at3–5 × 105 cells/mL of pre-warmed Sf-900™ II SFM.3.Incubate at 28°C in a non-humidified, air regulated non-CO2atmosphere, on an orbital shaker platform rotating at120–140 rpm. Loosen flask caps to allow for gas exchange. 4.Subculture when cells reach >2 × 106 viable cells/mL. Werecommend subculturing cells a minimum of 3 passagesbefore using in downstream applications. Subculture suspension culturesInsect cells are sensitive to physical shearing. Ensure that impeller mechanisms rotate freely and do not contact vessel walls or base (adjust prior to autoclaving).1.Determine viable cell density using a Countess® AutomatedCell Counter or alternative automated or manual method. 2.Seed cells at 3–5 × 105 viable cells/mL in sterile culturevessels containing pre-warmed Sf-900™ II SFM. (30 mL per125-mL shake flask, 75–100 mL per 100-mL spinner bottle).3.Incubate at 27°C to 28°C in a non-humidified, air regulatednon-CO2 atmosphere. Loosen caps to allow for gas exchange.4.Rotate shake flask cultures on an orbital shaker platform at120–140 rpm, set impeller stirring rate to 85–95 rpm forspinner bottles (optimum impeller speed must be empirically determined for each spinner apparatus for robust cell growth and viability).5.Subculture cells when viable cell density reaches>2 × 106 viable cells/mL (about twice a week) into clean,sterile flask(s) with fresh pre-warmed Sf-900™ II SFM. Note: If cell debris is observed, gently centrifuge the cell suspension at 100 × g for 5–10 minutes and resuspend the cell pellet in fresh Sf-900™ II SFM to reduce accumulation of cell debris and metabolic waste by-products.Note: We recommend thawing a fresh low-passage vial of cells every 3 months or 30 passages.Subculture monolayer cultures1.Observe cell monolayer to ensure 80–90% confluence.Aspirate medium and floating cells from a confluentmonolayer.2.Add 4 mL (per 25 cm2) pre-warmed Sf-900™ II SFM to theflask and resuspend cells by repeatedly pipetting themedium across the monolayer.3.Observe cell monolayer to ensure cell detachment from thesurface of the flask. Firmly rap the side of the flask on thepalm of your hand or a hard flat surface if necessary.Publication Number MAN0007285 Rev. 1.002.4. Transfer entire cell suspension to a sterile conical tube; anycell clumps quickly settle to the bottom after 1–2 minutes. Pipet the clumps into a 10-mL pipette and gently break up the clumps by pressing the pipette tip against the bottom of the tube and gently expell the cells back into the medium, repeat if necessary to break up remaining clumps. Pipetting too harshly will decrease cell viability due to sensitivity of cells to shear force.5. Determine viable cell density using a Countess ® AutomatedCell Counter.6. Inoculate 2–5 × 104 viable cells/cm 2 into new culture flaskscontaining pre-warmed Sf-900™ II SFM (5 mL/25 cm 2). 7. Incubate at 27°C to 28°C in a non-humidified, air regulatednon-CO atmosphere. Loosen caps to allow for gas exchange. 28. Three days post-plating, aspirate medium from the cellmonolayer and re-feed the culture with an equal volume of fresh medium gently added to the side of the flask. Note: Sf9 cells are not anchorage dependent and may be transferred between monolayer and spinner/shaker culture repeatedly without noticeable change in viability, morphology, or growth rate.For additional technical information such as Safety Data Sheets (SDS), Certificates of Analysis, visit /support For further assistance, email ************************All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. Pluronic is a trademark of BASF Corporation. ©2014 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved.DISCLAIMER - LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION AND/OR ITS AFFILIATE(S) DISCLAIM ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY, FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE, OR NON-INFRINGEMENT. TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW, IN NO EVENT SHALLLIFE TECHNOLOGIES AND/OR ITS AFFILIATE(S) BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF.Adapt cells to Sf-900™ II SFMIt is critical that cell viability be ≥90% and the growth rate be in mid-logarithmic phase prior to initiating adaptation procedures.Direct adaptationMonolayer cultures need only have the culture media exchanged with prewarmed Sf-900™ II SFM as described in Subculture monolayer cultures.Transfer suspension cultures into Sf-900™ II SFM as follows: 1. Centrifuge the cell suspension at 100 × g for 5–10 minutes.Aspirate and discard the supernatant.2. Resuspend the cell pellet in pre-warmed Sf-900™ II SFM at aviable cell density of >5 × 105 cells/mL and transfer to appropriate culture vessel.3.Return to incubator and monitor cell growth.Note: If suboptimal performance is achieved using the direct adaptation method, use the sequential adaptation method.Sequential adaptationFollow the procedures for subculture of suspension or monolayer cultures with the following modifications.1. During the adaptation procedure use a seeding density of>5 × 105 viable cells/mL.2. Subculture cells into stepwise increasing ratios of Sf-900™ IISFM to original medium with each subsequent passage (25:75, 50:50, 75:25, 90:10 followed by 100% Sf-900™ II SFM). Multiple passages at each step may be needed.After several passages in 100% Sf-900™ II SFM, the viable cell count should exceed 2–4 × 106 cells/mL with a viability exceeding 85% within 4–6 days of culture.Cryopreservation1. Prepare the desired quantity of cells, harvesting in mid-logphase of growth with viability >90%. Reserve theconditioned medium to prepare cryopreservation medium.Determine the viable cell density and calculate the requiredvolume of cryopreservation medium to give a final cell density of >1 × 107 cells/mL.3. Prepare the required volume of cryopreservation medium of92.5% Sf-900™ II SFM (50:50 ratio of fresh to conditioned media) + 7.5% DMSO on day of intended use, store at 4°C until use.4. Centrifuge cell suspension at 100 × g for 5–10 minutes.Resuspend the cell pellet in the pre-determined volume of 4°C cryopreservation medium.5. Dispense aliquots of this cell suspension into cryovialsaccording to the manufacturer’s specifications.6. Cryopreserve in an automated or manual controlled ratefreezing apparatus following standard procedures (1°C decrease per minute).7. Transfer frozen cells to liquid nitrogen, (vapor phase)°C to –125°C.storage at –200Related productsProductCatalog no. Sf9 Cells Adapted in Sf-900™ II SFM 12659 Sf21 Cells Adapted in Sf-900™ II SFM 12682 BaculoDirect ™ N-Term Expression Kit 12562-054 BaculoDirect ™ N-Term Transfection Kit 12562-062 BaculoDirect ™ C-Term Expression Kit 12562-013 BaculoDirect ™ C-Term Transfection Kit 12562-039 Bac-N-Blue ™ Transfection KitK855-01 Bac-to-Bac ® Baculovirus Expression System 10359 Bac-to-Bac ® Vector Kit10360Countess ®Automated Cell CounterC10227Explanation of symbols and warningsThe symbols present on the product label are explained below:Temperature LimitationManufacturerBatch codeUse By:Catalog numberCaution, consult accompanying documentsConsult instructionsfor useKeep away from lightSterilized using aseptic processing techniquesLimited product warrantyLife Technologies Corporation and/or its affiliate(s) warrant their products as set forth in the Life Technologies’ General Terms and Conditions of Sale found on Life Technologies’ website at /termsandconditions . If you have any questions, please contact Life Technologies at /support .Important licensing informationThese products may be covered by one or more Limited Use Label Licenses. By use of these products, you accept the terms and conditions of all applicable Limited Use Label Licenses.。
细胞生物学实验操作指南
细胞生物学实验操作指南目录1．洗涤与灭菌1.1细胞培养瓶1.2小烧杯、吹管1.3盐水瓶1.4瓶盖、胶塞1.5塑料器皿1.6附注：洗液配方（次强酸液）2．配置常用溶液2.1 平衡盐溶液2.2 pH调整液2.3 抗生素液2.3.1 青霉素+链霉素2.3.2 两性霉素2.3.3 G4182.3.4 潮霉素2.4 消化液2.5 培养基2.5.1 配置2.5.2 使用3．培养操作基本要求无菌操作一．洗涤与灭菌在组织培养中，离体细胞对任何有害物质都十分敏感。
有害物质包括微生物、细胞残余物以及非营养成分的化学物质。
因此对新采用和重新使用的培养器皿，都要严格清洗。
1．细胞培养瓶：(1)浸泡：初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解掉。
新的玻璃器皿，玻面常带有许多干涸的灰尘，同时在生产过程中，玻璃表面常呈碱性并带有一些对细胞有毒的物质，如铅和砷等。
新瓶使用前应先用自来水简单冲洗，然后用稀盐酸(5%)浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。
培养后的玻璃器皿往往附有大量蛋白质，干涸后不易刷洗掉，故用后要立即浸入清水中；注意让水能完全进入瓶皿中，不应留有气泡。
(2)刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗涤，以除去器皿表面的附着较牢的杂质。
刷洗次数太多，能损害器皿表面光泽度，所以应选用软毛刷和优质的洗涤剂（如高级洗衣粉或洗洁精），绝对不能使用含沙粒的去污粉！洗刷时特别注意洗刷瓶角部位。
可以将洗涤剂倒入浸泡培养瓶的清水中，直接在水中进行刷洗，然后再以清水冲洗干净。
(3)泡酸：刷洗不掉的极微量杂质经过硫酸和重铬酸钾洗液的强氧化作用后，可被除掉。
洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污能力很强，是清洗过程中关键的一环。
浸泡时，器皿要充满洗液，勿留气泡。
浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。
注意，泡酸时要戴防酸手套，否则将损伤皮肤。
(4)冲洗：泡酸后必须用水充分冲洗，使之不留任何残迹。
冲洗时每瓶都要用水灌满，倒掉。
昆虫sf9细胞培养
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载昆虫sf9细胞培养地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
标准条件的定义：培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。
活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。
形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。
确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 Ⅲ SFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。
细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。
昆虫sf9细胞培养
Sf9培养要点：温度：27-28摄氏度pH：，sf9最适的pH6.2，随培养时间的延长，Ph值会增加传代时间：72h（三天左右）细胞来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
（以上来自invitrogen）细胞特点：规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
标准条件的定义：培养最低密度：0.6×106/ml（健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。
活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验）1×106/mL将出现对数生长状态传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。
形成单层细胞可以传代培养悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。
确保传代细胞密度不高于4×106个/mL或保持密度高于1×106个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数培养基：sf-900 ⅢSFM（添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量）培养瓶与培养体积：冻存：一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。
细胞需达到90％活率和80-90％融合的要求（如：低代次）推荐冻存几管。
当融解细胞，它将会达到最佳使用状态。
1. 用细胞计数板计数细胞。
需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。
细胞可是悬浮或贴壁培养；2. 将无菌冻存管立于冰上，做好标记；3. 室温400-600×g离心10min。
移除上清。
4. 以给定的密度在冻存液中重悬细胞；5. 移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中；6. 置于-20℃1h，然后移至-80℃24-48h；7. 储存于液氮中。
昆虫细胞系的培养和建立技术
万方数据８期张寰等：昆虫细胞系的培养和建立技术８３５胞系建立的方法、细胞系的特征和鉴定等研究现状及存在的问题，作一综合性的概述。
１历史回顾２０世纪初，许多昆虫学家尝试过使用体外培养的昆虫细胞作为科学研究的工具。
最早进行昆虫组织体外培养的是ＲｉｃｈａｒｄＧｏｌｄｓｃｈｍｉｅｄｔ（１９１５），他使用惜比古天蚕蛾肌ｆｏｐ＾Ｄｍｃ∞ｒｏｐ施的精子进行体外培养，用来观察精子的发育（ＧｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔａＩｌｄＫａｉｓｅｒ，１９１５）。
首次成功建立连续培养的昆虫细胞系的是Ｇｒａｃｅ，于１９６１年建立了桉蚕蛾Ａ舭ｎ凹ｎｅｗ口ｚ印矗卵巢细胞系（Ｇｒａｃｅ，１９６２）。
从此，昆虫细胞系的建立工作在世界范围内广泛展开，新建立的细胞系（株）不断出现。
到目前为止，全世界建立的昆虫细胞系有８００株以上，分别来源于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、蜚蠊目、膜翅目、直翅目、同翅目和半翅目等８个目的１７０多种昆虫，然而其中大部分来自鳞翅目和双翅目，来源于其他目的昆虫细胞系仅占１／１０左右（图ｌ，个人统计）。
由于草地贪夜蛾却。
却把ｒ口．向留咖ｅ以。
细胞株ｓｆ９和Ｓｆ２１，以及粉纹夜蛾孤ｃ＾印ｆｗｉ口ｎｉ细胞株Ｔｎ５８１４（商品名Ｈｉｇｈｎｖｅ）对模式病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ＡⅡ￡ｏｇｎ印胁ｃｏｚ扣ｍｉｃｎｍｕｌｔｉｃ印ｓｉｄｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｍｓ（ＡｃＭＮＰＶ）非常敏感，因而成为各实验室普遍采用的细胞系（Ｇｍｎａｄｏｓ以ｏＺ．，１９９４）。
图１已经建立的昆虫细胞系来源于８个目的昆虫Ｆｉｇ．１ＥｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｓｅｃｔｃｅⅡｌｉｎｅｓｆ而ｍｅｉｇｈｔｉｎ∞ｃｔｏｒｄｅｒｓ在我国，１９５８年高尚荫首次尝试体外培养家蚕勘舶协瑚矗血细胞，并用之进行家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰｖ）的感染实验（Ｇａｗ以ⅡＺ．，１９５９）。
随后，有近５０株昆虫细胞系由国内的研究者建立并公开报道，分别分布于鳞翅目和双翅目昆虫中（个人统计）。
悬浮昆虫细胞培养条件-概述说明以及解释
悬浮昆虫细胞培养条件-概述说明以及解释1.引言1.1 概述悬浮昆虫细胞培养是一种常用的细胞培养技术，可以有效地繁殖和培养昆虫细胞。
随着昆虫细胞培养技术的发展，越来越多的研究者开始通过悬浮培养来研究和利用昆虫细胞。
悬浮昆虫细胞培养与传统的附着式培养相比具有许多优势。
首先，悬浮培养不需要基质或载体来固定细胞，使得培养过程更加简化和高效。
其次，悬浮细胞可以更好地模拟昆虫在自然环境中的生长状态，提供更逼真的实验条件。
此外，悬浮培养还可以方便地进行大规模培养，并且可以根据需要进行细胞的分离、鉴定和纯化。
为了成功地进行悬浮昆虫细胞培养，需要满足一定的培养条件。
首先，培养基的选择非常重要。
常用的培养基包括无血清培养基、激素培养基和复合培养基等。
不同的细胞类型和研究目的可能需要不同的培养基配方。
其次，培养过程中的溶氧量也是关键因素之一。
悬浮细胞对溶氧的需求较高，因此需要采取适当的措施来提供足够的氧气供应。
此外，温度、pH 值、培养容器的选择和培养时间等因素也需要仔细调控。
综上所述，悬浮昆虫细胞培养是一种重要的研究手段，在昆虫细胞的繁殖、鉴定和利用方面具有广阔的应用前景。
通过合理选择培养基、控制培养条件，并结合相关的细胞技术手段，可以为昆虫细胞研究提供更好的实验平台，推动昆虫细胞生物学的发展。
在接下来的文章中，我们将重点介绍悬浮昆虫细胞培养的关键要点和一些最新的研究进展。
1.2 文章结构文章结构是指一篇长文的组织和布局方式，它对于读者来说具有重要的导向作用。
本文的结构主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分的目的是引导读者了解整篇文章的背景和意义，同时为后续内容做铺垫。
本文的引言部分包括概述、文章结构和目的三个要点。
概述部分将简要说明悬浮昆虫细胞培养条件的研究背景和相关研究现状，概述目的是为了让读者了解该领域的重要性和研究的必要性。
在介绍悬浮昆虫细胞培养条件的同时，可以简要提及一些与该主题密切相关的内容，如昆虫细胞培养的意义和应用前景。
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定) PPT
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较：
空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周
2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent
3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变慢 或不增殖
脱落 或
融合(VSV/G)
裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状 病毒滴度测定)
杆
昆虫细胞的培养
状
病 重组pFastBac质粒的构建
毒
表
重组Bacmid的产生与鉴定
达
获得重组杆状病毒
系
统
蛋白表达&病毒扩大
Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
昆虫细胞系的生长和维持细胞系简介：本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。
Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。
运输与储存：运输：置于干冰上。
储存和传代：置于液氮储存。
收到细胞即可开始，详见14页。
细胞系比较：下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。
订购信息见下页。
细胞 倍增时间 细胞外观 初始培养基Sf9 72h 规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHSf21 24h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁紧。
TNM-FHH5 18h 不同大小带有颗粒球形。
贴壁松。
Express Five SFM重要事项：Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。
在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。
如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。
更多信息请联系技术支持。
用途：仅供研究使用。
禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。
Sf9和Sf21细胞系：来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。
特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。
大小不同：Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。
体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。
Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。
用途：两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。
如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。
在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。
H5细胞系：来源：H5细胞系源于博伊斯汤普森研究所对植物的研究，伊萨卡、纽约和源于白菜尺蠖卵巢细胞，粉纹夜蛾。
特性：此细胞系有如下特性:●倍增时间小于24h；●适于贴壁培养，但易形成不整齐的单层，导致空斑鉴别困难；●适于悬浮培养和无血清培养；●提供5-10个折叠（针对选择的蛋白）分泌表达量比Sf9细胞高。
用途：H5细胞表达重组病毒性能优越。
也经常用于转染和空斑纯化；然而，如果重组体不是蓝色分离重组的空斑就比较困难。
昆虫表达系统：大量从Invitrogen获得的表达系统在Sf9、Sf21或H5昆虫细胞中能便利的表达重组蛋白。
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统适于用杆状病毒来表达重组蛋白，同时InsectSelect适于用无细胞溶解素的系统来表达蛋白。
更多关于表达系统的信息请访问或致电技术服务。
哪个细胞系最好用?推荐Sf9或Sf21细胞用于转染、纯化和增殖重组病毒。
Sf9细胞大小一致，易于操作，能形成良好的单层细胞用于空斑实验。
Sf9和Sf21细胞也能用于重组蛋白的表达，但是H5细胞系的生产量更高。
推荐用H5细胞系来表达分泌型重组蛋白。
其能在无血清培养基中培养，适应悬浮培养以及能生产大量的重组蛋白。
注意：一般来说易于用一种细胞系来表达蛋白达到最优化的程序。
一旦确定用一种细胞来表达重组蛋白，其它细胞系可以尝试优化表达水平。
注意:当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
订购信息：见下表从Invitrogen获得冻存细胞信息细胞 冻存Sf9 货号：B825-011×107细胞/ml 60％Grace's培养基，30％胎牛血清，10％DMSOSf21 货号：B821-011×107细胞/ml 60％Grace's培养基，30％胎牛血清，10％DMSOH5 货号：B855-023×106细胞/ml 添加90mL/L谷氨酰胺的Express Five® SFM需要92.5％ 7.5％DMSO培养基昆虫细胞培养基：Sf9，Sf21和H5能在含血清或无血清培养基中生长（更多信息见12页培养基注意事项）。
推荐如下培养基用于每个细胞系（见下表）。
细胞 含血清培养基 无血清培养基Sf9 Grace's昆虫培养基 Sf-900ⅡSFMSf21 Grace's昆虫培养基 Sf-900ⅡSFMH5 Grace's昆虫培养基 Express Five® SFM培养基订购信息：从Invitrogen获得的GIBCO®昆虫培养基用于培养Sf9，Sf21和H5昆虫细胞。
订购信息见下表。
产品 数量 货号非悬浮Grace's昆虫培养基 500mL 11595-030悬浮Grace's昆虫培养基 500mL 11605-094500mL 10902-096 Sf-900ⅡSFM1L 10902-088 Express Five® SFM 1L 10486-025方法细胞操作技术无菌技术：需在层流罩无菌条件下进行昆虫细胞培养。
传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养: 贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：最后培养基体积）稀释维持对数生长。
例如：T75方瓶装12mL培养基长成单层。
将细胞吹下来，取2mL移入新的装有8mL培养基的T75方瓶，这就是1:5稀释（最终10mL体积中含2mL细胞）。
悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。
例如：在装有50mL细胞培养基的100mL摇瓶中细胞密度达到2.0×106细胞/mL。
移取25mL 含细胞的培养基再加入25mL新完全培养基使细胞终浓度达到1.0×106细胞/mL。
融合：融合是细胞进行传代培养的标志。
定义：贴壁细胞汇集成单层布满整个获得的生长表面。
在形成第一层或开始从壁面悬起后，一旦细胞形成团簇，就要开始进行传代。
传代融合细胞：细胞在旧的融合表现倍增时间较少或活率降低以及减少贴壁时应立即传代。
细胞培养以及认为不太健康了。
融合前传代：未形成融合前的细胞不易移除，需较大的机械力。
在未融合前传代，细胞表现倍增时间较短或活率降低（更多信息参见30页疑难解答）。
细胞培养以及认为不太健康了。
漂浮物：漂浮物常发生且常见于旧培养基和过度生长培养基中。
定义：细胞无论是松散贴壁或悬浮于培养基中。
注意：如果漂浮物超过5％，在传代之前用新鲜的培养基取代含漂浮物的培养基。
存活的漂浮物：许多漂浮物仍然存活。
检查活率，移取一小份含漂浮物的培养基用于台盼蓝染色实验。
假如漂浮物的活率较高（〉95％），细胞可用于增殖，将含漂浮物的培养基移至装有新鲜培养基大小合适的瓶子中。
脱落：非常柔和的培养方法可使细胞活率高。
特别用这种方法移除贴壁培养的细胞。
定义：通过培养基吹打从壁面移除细胞。
此技术程序见贴壁培养17页。
倍增时间：昆虫数量倍增时间不同，依赖于生长条件。
健康细胞倍增时间：●Sf9细胞倍增时间72h；●Sf21细胞倍增时间24h；●H5细胞倍增时间18-24h。
注意：如果倍增时间超过24-72h，则初始细胞浓度、活率、培养基、温度或氧化作用可能出现问题。
更多有关倍增时间超过24h的信息见30页疑难解答。
活率：为了维持最佳贴壁和悬浮状态，应通过细胞计数有规律的进行评价细胞活率。
定义：细胞活率是指在培养基中活细胞所占的比例。
细胞活率是通过台盼蓝染色测定。
台盼蓝染料不能通过活细胞膜，但能很快进入死细胞。
变蓝的细胞就是死细胞。
最低要求：健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。
活率低于90％细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验。
如果你的细胞有活率低于90％的问题见第30页疑难解答。
细胞记录：细胞记录对于监控昆虫细胞密度和活率非常重要。
做好细胞记录能使你记住需要进行细胞培养的日期。
并且细胞记录有助于疑难问题的解决（见第30页）。
定义：细胞记录或细胞笔记应包括如下内容：●最初培养日期；●原始发货批号；●传代日期；●每次传代的代次；●传代的密度；●传代的活率；●冻存代次；●任何细胞出现的情况；●培养基及其批号。
生长温度：干燥的环境中维持细胞生长需27℃。
新鲜培养基在使用前需升至室温。
室温细胞维持生长置于工作台上或抽屉里，但建议环境温度控制在27℃。
低于27℃：低于27℃昆虫细胞生长缓慢。
当温度恢复到27℃，细胞能恢复到正常倍增时间。
高于27℃：27℃-30℃之间，昆虫细胞倍增时间加长。
高于30℃细胞活率降低。
细胞长时间暴露在30℃以上高温则不能再用。
如果温度恢复到27℃细胞也不能恢复原来的状态。
CO2：昆虫细胞培养不需要CO2。
浓缩细胞：如果细胞密度太低（＜5×105细胞/mL）细胞需浓缩以达到对数生长。
浓缩细胞至较高密度（1×106细胞/mL）将出现对数生长状态（见第27页）。
细胞分散：在转染和空斑试验之前，细胞需均匀的分散至组织培养板表面。
目的：这将确保如下：a)细胞分散不均，导致形成不匀称的单层；b)最大表面积用来感染。
步骤：分散细胞，用手从前往后一边到另一边慢慢轻摇细胞瓶或板子。
重复四次，仔细观察确保液体布满所有生长表面。
不要用圆周运动来分散细胞，这样会引起细胞聚集板子边缘而不均匀分布。
重要事项：所有添加或移除培养基操作需在层流罩下进行，且在无菌条件下及使用无菌设备。
添加或移除培养基-方瓶：从方瓶中移除含细胞的培养基时，倾斜瓶子使培养基流到瓶角，远离细胞单层。
用移液管小心移除培养基。
避免触碰细胞单层。
添加培养基时，轻柔的吸取培养基置于远离细胞单层的一边。
在细胞贴壁松散和部分脱落时轻柔的处理细胞。
添加或移除培养基-培养板：从摇瓶中移除培养基，拧掉摇瓶臂上的螺丝帽。
小心从瓶臂插入移液管不触及瓶壁吸除培养基。
从摇瓶的瓶臂小心移出移液管，避免触碰瓶壁或掉液。
每次更换移液管，每次插入摇瓶的移液管只能用一次。
给摇瓶添加培养基时，拧掉瓶臂上的螺丝帽。
小心插入移液管不触碰瓶壁添加培养基。
从摇瓶的瓶臂小心移动出液管，避免触碰瓶壁或掉液。
每次更换移液管，每次插入摇瓶的移液管只能用一次。
培养基因素：与杆状病毒作用：与杆状病毒或野毒株作用时，细胞培养和病毒作用的培养基要分开。
杆状病毒粒子能在4℃存活和维持，在传代过程中会通过给培养板或方瓶加液污染细胞。
Grace's昆虫培养基/TNM-FH:●Grace's昆虫培养基: Grace's昆虫培养基,非补充培养基单独从Invitrogen获得（货号11595-030）。