哺乳动物细胞培养手册
实用哺乳动物细胞培养
实用哺乳动物细胞培养手册细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术.细胞培养的培养物可以是单个细胞,也可以是细胞群.1、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。
细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。
细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。
2、常用设施及设备（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。
（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。
操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。
缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。
（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。
3、培养器皿常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。
常准备量是使用量的三倍。
器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。
常用的器皿有下面几种。
（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml 等几种。
（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种。
（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。
分直径30mm、60mm、120mm 等几种。
（4）吸管：常用的有长吸管和短吸管两类，长吸管也称刻度吸管。
其改良后管上部有球型刻度称改良吸管，刻度吸管用于移动液体。
哺乳动物离体贴壁细胞的传代培养.pdf
三、实验操作——传代培养
1、细胞房及超净台的紫外线消毒，时间约30min-1h。 2、准备材料：完全培养基，0.25%胰酶，PBS，75%乙醇，培养瓶，并且预热培养用液：把装有培养 液、PBS和胰酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 3、用酒精棉球擦拭实验台和双手，正确摆放使用的器械（保证足够的操作空间，不仅便于操作而 且可减少污染）；点燃酒精灯（注意火焰不能太小）。 4、从培养箱内取出细胞（若是培养瓶，注意取出细胞时要旋紧瓶盖），用酒精棉球擦拭显微镜的 台面，再在镜下观察细胞。 5、小心用移液枪吸去原培养皿中的培养液；加入2ml的PBS（无Ca2+和Mg2+）清洗贴壁细胞1-2次， 吸去PBS（此步骤中，PBS应小心添加，以免将贴壁细胞吹打损失） 6、加入原培养液1/10体积（量以盖住细胞最好）的胰蛋白酶-EDTA消化，此处为800ul，使细胞间连 接断裂，液体均匀覆盖培养皿，大约2min或培养箱中20s（目测贴壁细胞块状脱落为标准；倒置显 微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度；最佳消化温 度为37℃）。 7、细胞消化完毕后，加入适量的培养基（带血清）拮抗以终止消化，并吹打细胞，制成均匀的细 胞悬液（尽量吹打均匀，使细胞分散开。） 8、将细胞悬液转移至1.5mlEP管，离心2-3min，转速控制在2000rpm下，后弃去上清（此步骤旨在 去除可能过度消化产生的细胞碎片）。 9、沉淀用1mlDMEM吹打均匀后，按照下面介绍的方法计数细胞，后按比例分装到已装有新鲜培养 液的培养皿中。（传代细胞的密度应该不低于5×105/ml 。） 10、做好标记，晃动以使细胞铺展均匀（经验为横纵轴方向各晃动20-30下，此处应小心勿让培养 液溅出）。 11、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量， 以及细胞是否铺展均匀。
生物化学实验方法手册
生物化学实验方法手册Markus R Wenk National University ofSingapore, SingaporeAaron Zefrin Fernandis NationalUniversity of Singapore, SingaporeA Manual For BiochemistryProtocols2007,127pp.PaperbackISBN 978-981-270-066-7Markus R Wenk等编该书是生物医学研究手册丛书的第三卷，其前两卷分别是《初级哺乳动物细胞培养手册》和《生物医学研究中的显微镜技术》，后续还将推出《生物材料及骨架编织技术手册》和《知识产权管理手册》，这五卷均由世界科学出版社出版。
本手册共分为6章，各章内容分别是：1.蛋白纯化；2.蛋白分析；3.脂肪分析；4.哺乳动物细胞培养；5.显微镜学；6.分析与鉴定。
作者希望这本手册不仅仅是将各种生物化学实验方法的简单罗列，更希望读者能够通过这本手册掌握生物化学实验技巧进而理解这些方法背后的原理。
这本手册将给广大读者带来一个全景式的生物化学，尤其对于那些初次踏入生物化学领域的读者，选择这本手册会是一个不错的开始。
这本手册的编者都是科研一线人员，所编著的方法实用且前沿，并且详尽地介绍了生物化学中可能会使用的实验方法。
本手册适合从事生物化学、分子生物学的相关人员，在实验中它是一本不错的参考工具。
程恩隽，博士生(国家纳米科学中心）Chengenjun, DoctoralCandidate(National Center for Nanoscience and Nanotechnology ,China)。
经常使用哺乳动物细胞培育基配方
30
生物素
11
L-赖氨酸盐酸盐
31
D-泛酸钙
12
L-甲硫氨酸
32
叶酸
13
L-苯丙氨酸
33
i-肌醇
14
L-脯氨酸
34
烟酰胺
15
L-丝氨酸
35
氯化胆碱
16
L-苏氨酸
36
盐酸吡哆醇
17
L-色氨酸
37
核黄素
18
L-酪氨酸
38
盐酸硫胺素
19
L-缬氨酸
39
维生素 B 12
20
对氨基苯甲酸
DMEM(A) 基（粉末型）成份
28
盐酸硫胺
13
L-亮氨酸
29
盐酸吡哆辛
14
L-盐酸赖氨酸
30
葡萄糖
15
L-甲硫氨酸
31
丙酮酸钠
16
L-苯丙氨酸
32
酚红
DMEM(L) 基（粉末型）成份
序号
化合物名称
含量 (mg/L)
序号
化合物名称
含量 (mg/L)
1
无水氯化钙
17
L-丝氨酸
2
硝酸铁 .9H 2 O
18
L-苏氨酸
3
氯化钾
19
L-色氨酸
L-天门冬氨酸
33
D-泛酸钙
13
L-盐酸半胱氨酸
34
叶酸
14
L-盐酸胱氨酸
35
肌醇
15
L-谷氨酰胺
36
烟酰胺
16
L-谷氨酸
37
氯化胆碱
17
甘氨酸
38
常见细胞种类及培养基
常见细胞种类及培养基在生物学中，细胞是构成生物体的基本单位。
根据形态、功能等特征，细胞可分为许多不同的种类。
同时，为了研究和培养这些细胞，科学家们开发了各种不同的培养基。
下面将介绍一些常见的细胞种类以及它们的培养基。
1.哺乳动物细胞：哺乳动物细胞是大多数哺乳动物体内的细胞，在医学和生物学研究中具有广泛的应用。
常见的哺乳动物细胞类型包括人类胚胎肾细胞（HEK293）、人类肺细胞（A549）、小鼠乳腺癌细胞（MCF-7）等。
哺乳动物细胞的培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）等。
这些培养基通常添加有适当比例的胎牛血清、抗生素等，以提供细胞生长和繁殖所需的养分。
2.昆虫细胞：昆虫细胞广泛存在于昆虫体内，常用于基因工程、生物农药和药物开发等领域的研究。
常见的昆虫细胞类型包括鳞翅目幼虫细胞（Sf9）、鳞翅目卵巢细胞（S2）等。
昆虫细胞的培养基包括TC-100、Graces培养基等。
与哺乳动物细胞相比，昆虫细胞更适合在低温下培养，因此常常将昆虫细胞培养在28°C以下的温度下。
3.鸟细胞：鸟细胞是鸟类体内的细胞，具有重要的医学和生物学价值。
常见的鸟细胞类型包括鸭子胚胎细胞（DEF）、鹅肝细胞（HEEC）等。
鸟细胞的培养基与哺乳动物细胞的培养基类似，如DMEM/F-12、MEM（Minimum Essential Medium）等。
4.真菌细胞：真菌细胞是真菌体内的细胞，也是生物技术和生物药物研发的重要对象。
常见的真菌细胞类型包括酿酒酵母细胞（Saccharomyces cerevisiae）、毛霉细胞（Aspergillus niger）等。
真菌细胞的培养基包括YPD培养基、PDA培养基等，其中YPD培养基主要由葡萄糖、酵母营养素、酵母氨基酸等组成，可提供真菌细胞所需的营养物质。
cho细胞培养参数
cho细胞培养参数
CHO细胞（Chinese Hamster Ovary Cell）是一种常用的哺乳动物细胞系，常用于重组蛋白的生产。
细胞培养参数主要包括以下几个方面：
1. 培养基：常用的CHO细胞培养基有DMEM/F12、RPMI 1640等，其中含有必需的氨基酸、维生素、葡萄糖以及其他生长因子和辅助物质。
2. 温度：CHO细胞的最适生长温度一般为37°C。
3. CO2浓度：为了维持细胞培养环境的酸碱平衡，一般在细胞培养箱中提供5% CO2气氛。
4. pH值：细胞培养液的pH值通常在7.2-7.4之间。
5. 细胞密度：细胞密度的种植密度根据所需的细胞产量，一般可根据细胞生长曲线和培养容器的尺寸来确定。
6. 培养时间：CHO细胞的培养时间一般为2-7天，具体根据细胞类型和实验目的而定。
7. 摇床速度：细胞培养时的摇床速度一般为80-120rpm，旋转摇床的旋转半径也会影响细胞的生长。
8. 营养物质浓度：选择适当的营养物质浓度，如葡萄糖、氨基酸、维生素等，对细胞的生长和产量有重要影响。
9. 培养容器：常用的培养容器有细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养滚筒等，选择合适的培养容器也会影响细胞的生长和产量。
以上为一般常用的CHO细胞培养参数，实际情况可能根据实
验目的和细胞特性的不同而有所调整。
在进行细胞培养实验时，需根据实际情况进行优化调整。
哺乳动物细胞培养技术
哺乳动物细胞培养技术一、前言哺乳动物细胞培养技术是生物学研究中的重要分支，它可以为生物医学研究提供大量的细胞材料，从而促进了细胞生物学、免疫学、药理学等领域的发展。
本文将介绍哺乳动物细胞培养技术，包括培养基的配制、无菌操作、细胞分离与传代、冷冻保存和复苏等方面。
二、培养基的配制1. 基础培养基哺乳动物细胞培养最常用的基础培养基是DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute 1640），这两种培养基都是以含有必需氨基酸和维生素的高糖量液体为基础，添加适当浓度的人血清或牛血清作为营养来源。
2. 补充因子除了上述基础成分外，还需要添加多种补充因子，如抗生素（青霉素和链霉素）、重组人胰岛素、转铁蛋白等。
抗生素可以有效地抑制细菌和真菌的生长，保证培养物的无菌性；胰岛素是细胞增殖和分化所必需的营养物质，可以提高培养细胞的存活率和增殖能力；转铁蛋白则可以促进铁离子的转运，保证细胞正常代谢。
3. pH值调节pH值对于细胞生长和代谢具有重要影响，因此需要在培养基中添加缓冲液来调节pH值。
最常用的缓冲液是HEPES（4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸），其pH范围为7.0~8.0。
三、无菌操作无菌操作是哺乳动物细胞培养过程中最为关键的环节之一。
以下是无菌操作需要注意的几个方面：1. 实验室环境实验室环境应该保持清洁、干燥、通风，并且应该经过消毒处理。
实验人员应该穿戴干净、整洁、合适的实验服，并戴上口罩和手套。
2. 器皿消毒所有用于培养细胞的器皿都需要在高压蒸汽灭菌器中进行消毒处理，以杀死其中的所有微生物。
3. 操作流程无菌操作应该按照一定的操作流程进行，包括洗手、穿戴实验服、准备实验器具和培养基、开展操作等步骤。
在操作过程中要注意不要碰触到非无菌区域和非无菌器具。
四、细胞分离与传代1. 细胞分离细胞分离是指将原始细胞群体中的单个细胞分离出来，使其成为一个独立的单元。
细胞培养完整手册[指南]
![细胞培养完整手册[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/1f310ac3370cba1aa8114431b90d6c85ec3a8806.png)
细胞培养完整手册常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH 计（测量培养用液PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2 孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum 和培养用液）。
无菌操作基本技术无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰ 来苏尔或者新洁尔灭或者0.5 ％过氧乙酸擦拭。
2.CO2 孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰ 新洁尔灭擦拭，然后用75 ％酒精擦拭或者0.5 ％过氧乙酸，再用紫外灯照射。
3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30 分钟。
4.实验后灭菌：用75 ％酒精（3‰ 新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
5.定期检测下列项目：钢瓶之CO2 压力；CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75 ％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75 ％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
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实用哺乳动物细胞培养手册细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。
细胞培养目的与用途1、科学研究：药物研究开发与基础研究药物研究与开发(1) 新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。
(2) 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
(3) 基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。
(4) 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。
(5) 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。
基础研究(1) 药物作用机理(2) 基因功能(3) 疾病发生机理2、生物制药(1) 疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
(2) 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等(3) 诊断用和药用单克隆抗体生产(4) 细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
2、优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清。
血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。
23、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。
在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。
因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。
4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
5、合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。
细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。
干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。
每种细胞都有其合适的培养基，详见附表1。
1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。
其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。
但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。
主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
无机盐培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。
此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。
培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg .320 mOsm/kg。
标准培养液的渗透压在此范围内波动。
特别注意：向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压，特别是溶于强酸或强碱中的物质。
向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
缓冲系统大多数细胞所需pH 在7.2 - 7.4。
但是，细胞培养最适pH 值随培养的细胞种类不同而不同。
成纤维细胞喜欢较高pH (7.4 - 7.7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。
由于多数培养液靠碳酸氢钠（NaHCO3）与CO2 体系进行缓冲，因此，气相中的CO2 浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。
如果气相或培养箱空气中CO2 浓度设定在5％，培养液中NaHCO3 的加入量为1.97g/L；如果CO2 浓度维持在10％，培养液中NaHCO3 的加入量为3.95g/L。
细胞培养瓶盖不应拧得太紧，以保证气体交换。
HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力，但是非常昂贵，在高浓度时对一些细胞可能有毒。
HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠（0.34g/L）共用，以抵消因额外加入HEPES 引起的渗透压增加。
在这种培养条件下，细胞培养瓶的盖子应拧紧，以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。
大多数培养液中含有酚红作为pH 指示剂，酸性培养液呈橙黄色，碱性培养液呈深红色。
维生素在细胞培养中，尽管血清是维生素重要来源， 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。
其它成分在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。
如在杂交瘤技术中常用的DMEM 培养液，使用时还需要补加丙酮酸钠和2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。
2-Me 对细胞生长有很重要的作用。
有人认为它相当于胎牛血清，有直接刺激细胞增殖作用。
2-Me的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。
同时避免过氧化物对培养细胞的损害。
另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术，另外，也开始用于一些难以培养的细胞。
2-Me 是一种小分子还原剂，极易氧化。
分子量为78.13，纯的2-Me 是一种无色有刺激味的液体，比重为1.110-1.120(Do20)，常用终浓度为5×10-5M。
常配制成0.1M 的储存液，用时每升培养液加0.5ml。
液体培养基保存：液体培养基应于4℃冰箱避光保存，实验前放入37℃预热。
未加血清液体培养基有效期为12 个月。
液体培养基中的L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。
如果细胞生长不良，可以再添加适量L-谷氨酰胺。
干粉培养基保存：4℃冰箱避光保存，有效期36 个月。
血清细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分为胎牛血清和新生小牛血清。
胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清，价格昂贵。
新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清，如厂家能做到这一点，新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。
如小牛出生后已哺乳，从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质，其质量明显不如前两种。
血清的质量，种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长，而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同，尤其是对克隆细胞的生长，某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。
因此，在购买大量血清之前，必须对血清支持细胞生长能力进行检测，然后再，然后大量购买质量好的同一批号的血清，并注意以下几点：（1）需要长期保存的血清必须储存于-20℃ – 70℃ 低温冰箱中。
4℃冰箱中保存时间切勿超过1 个月。
由于血清结冰时体积会增加约10％，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。
（2）一般厂商提供的血清为无菌，无需再过滤除菌。
如发现血清有悬浮物，则可将血清加入培养液内一起过滤，切勿直接过滤血清。
（3）瓶装血清解冻需采用逐步解冻法：-20℃ 至-70℃ 低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。
然后移入室温，待全部溶解后再分装。
在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。
切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。
（4）热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清。
加热过程中須規則搖晃均勻。
此热处理的目的是使血清中的补体成分（complement）灭活。
除非必须，一般不建议作此热处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，而且还会影响血清的质量。
补体参与反应有：细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。
（5）切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量。
（6）血清中的沉淀物絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。
可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。
显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。
有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。
一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清。
细胞培养环境1、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。
细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。
细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。
2、常用设施及设备（1）超净工作台：也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外流式三大类。
（2）无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。
操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。
缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。
5（3）操作间：普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物（4）洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
（5）分析间：显微镜、计算机及打印机等。
3、培养器皿常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。
常准备量是使用量的三倍。
器 皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。
常用的器皿有下面几种。
（1）液体储存瓶：用于储存各种配制好的培养液、血清等液体，常用规格有500ml、250ml、100ml 等几种。
（2）培养瓶：根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位，规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种。
（3）培养皿：用于开放式培养及其它用途。
分直径30mm、60mm、120mm 等几种。