高效液相色谱法测定大米中的维生素B_1

维生素 B1 （ VB1 ） 又称硫胺素或抗脚气病维生 素。维生素 B1 参加细胞中的糖代谢，对于神经细胞 膜对兴奋的传导作用起着重要作用［1］。维生素 B1 在体内储存 量 极 少，如 果 摄 入 量 不 足，会 引 起 脚 气 病。维生素 B1 缺乏，主要损害神经血管系统，导致 多发性末梢神经炎及心脏功能失调［2］。维生素 B1 广泛分布于动植物界中，谷物是我国人民的主食，也 是我国传统膳食中维生素 B1 的主要来源［3］。大米 中含有丰富的维生素 B1 ，是我们摄取维生素 B1 的 主要途径。而且，随着《预包装食品营养标签通则》 的实施，维生素 B1 成为评价大米营养品质的重要指 标之一［4］。因此，准确测定大米中维生素 B1 的含 量具有现实意义。
96 102
98 96 94 94 94 98 97 97 101 99 99. 5 98. 5 101 98 99 100. 5
由表 2 可以看出，三个水平的加标实验回收率 在 94% ～ 102% 之间，符合 GB / T 27404—2008《实验 室质量控制规范 食品理化检测》［10］中对回收率的 要求，表明本方法的准确度满足检测的要求。 2. 3 对比实验结果
按照 GB / T 7628—2008 中的方法，对同一大米 样品 进 行 测 定。用 t 检 验 法 分 析 本 方 法 与 GB / T 7628—2008 中的方法是否存在显著性差异。 1. 3. 4 数据分析方法
使用 OriginPro 7. 5 和 SPSS 11. 0 对数据进行统 计分析。
色 谱 柱： YWG － C18 柱； 流 动 相： 甲 醇 与 0. 05 mol / L 乙酸钠溶液（ pH = 4. 5） 之比为 35： 65； 柱温： 40 ℃ ； 流速： 1. 0 ml / min； 检测波长： 激发波长为 365 nm，发射波长为 435 nm； 进样量： 10 μL。 1. 3. 3 比对实验
Laboratory Mill 3100 型 旋 风 磨： Perten Instruments AB； AB204 － N 型 电 子 分 析 天 平： METTLEＲ 公司； DSY － 1 － 4 型电热恒温水浴锅： 北京国华医 疗器械厂； PYX － DHS － 40X50 型隔水式电热恒温 培养箱： 上海市跃进医疗器械厂； 高效液相色谱仪 （ 配荧光检测器） ： Agilent 公司。 1. 3 方法 1. 3. 1 样品前处理
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高效液相色谱法测定 大米中的维生素 B1
曹 阳，刘美辰
（ 北京市粮油食品检验所，北京 100162）
摘 要： 大米中的维生素 B1 经酸解、酶解、氧化、萃取后，采用高效液相色谱法，经过 C18 色谱柱，以 甲醇∶ 0. 05 mol / L 乙酸钠溶液（ pH = 4. 5） = 35 ∶ 65 作流动相，用荧光检测器进行检测。结果表明， 维生素 B1 在 0 ～ 0. 20 μg / mL 的范围内具有较好的线性关系，检出限为 0. 65 ng / mL，三个浓度水平 的加标回收率均在 95% 以上，6 次平行试验的相对标准偏差为 2. 93% ，t 检验表明本方法与 GB / T 7628—2008 法之间无显著性差异。 关键词： 大米； 维生素 B1； 高效液相色谱 中图分类号： TS 210. 7 文献标识码： A 文章编号： 1007 － 7561（ 2014） 06 － 0071 － 03
2 结果与分析
2. 1 维生素 B1 的定性与定量 精确称取 100 mg 维生素 B1 溶于 0. 1 mol / L 盐
酸中，并稀释至 1000 mL，配制成 100 μg / mL 的标准 储备液。吸取上述标准储备液 1 mL，用 0. 1 mol / L 盐酸稀释至 100 mL，配制成 1 μg / mL 的标准中间 液。分别吸取 0. 00、0. 25、0. 50、1. 00、1. 25、2mL 标 准中间液于 25 mL 具塞比色管中，再依次加入 0. 1 mol / L 盐酸 10、9. 75、9. 50、9. 00、8. 75、8mL，再分别 加入 5 mL 碱性铁氰化钾，充分混匀后，加入 10 mL
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂 大米样品： 采用吉林 2011 年产的粳稻谷加工成
国标三级粳米，并粉碎过 60 目筛。 维生素 B1 标准品： 中国计量科学研究院； 淀粉
酶（ 酶 活 力 ≥50 U / mg） 、蛋 白 酶 （ 酶 活 力 ≥6 000
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U / mg） ： Sigma 公司； 盐酸 （ 分析 纯） 、乙 酸 钠 （ 分 析 纯） 、铁氰化钾（ 分析纯） 、正丁醇（ 分析纯） ： 国药集 团化学试剂有限公司； 甲醇（ 色谱纯） ： Fisher Scientific 公司。 1. 2 主要仪器与设备
表 2 维生素 B1 回收率实验结果
加标量 / （ mg·kg － 1 ）
本底值 / （ mg·kg － 1 ）
测定值 / （ mg·kg － 1 ）
回收率 / %
0. 50 1. 00 2. 00
0. 95 0. 95 0. 95
1. 43 1. 46 1. 44 1. 43 1. 42 1. 42 1. 89 1. 93 1. 92 1. 92 1. 96 1. 94 2. 94 2. 92 2. 97 2. 91 2. 93 2. 96
收稿日期： 2014 － 05 － 29 作者简介： 曹阳，1985 年出生，女，工程师，硕士．
目前，我国常用的分析大米中维生素 B1 的方法 为 GB / T 7628—2008《谷物中维生 素 B1 测 定》［5］。 该方法操作过程相当复杂，所需检测时间较长。本 试验对国标方法进行了改进。维生素 B1 对酸稳定， 在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外 光激发下，噻嘧色素发出荧光，在无其它荧光物质干 扰情 况 下，荧 光 强 度 与 维 生 素 B1 含 量 成 正 比［6］。 在此原理的基础上，建立高效液相色谱测定大米中 维生素 B1 的测定方法。
Determination of vitamin B1 in rice by high performance liquid chromatography
CAO Yang，LIU Mei － chen （ Beijing Grain and Oil Food Inspection Institute，Beijing 100162）
平均值 / （ mg·kg － 1 ）
0. 96
相对标准偏差 /%
2. 93
由表 1 可 以 看 出，6 次 平 行 测 定 的 平 均 值 为 0. 96 mg / kg，相对标准偏差为 2. 93% 。相对标准偏 差低于 5% ，表明本方法的精密度满足检测的要求。
方法的 回 收 率 反 映 了 测 定 方 法 的 准 确 度［9］。 为了考察方法度准确度，通过对同一种大米样品分 别添加 0. 5、1. 0、2. 0 mg / kg 维生素 B1 的标准品，做 低、中、高 三 个 浓 度 水 平 的 加 标 回 收 试 验，按 照 1. 3. 1 和 1. 3. 2 的 方 法 进 行 测 定，所 得 回 收 率 见 表 2。
根据高效液相色谱中的标准样品峰面积与维生 素 B1 含量的关系进行线性回归，峰面积与维生素 B1 浓度在一定范围内呈线性关系。
图 2 维生素 B1 标准曲线 注： 标准曲线的回归方程 y = 613. 38x + 0. 4506，相关系数 r2 = 0. 9991。其中 y 为峰面积，x 为维生素 B1 浓度，μ g / mL。
色谱峰的峰面积大小是定量分析的指标，表示 被测组分 在 样 品 中 含 量 的 高 低［7］。 色 谱 峰 的 峰 面 积越大，被测组分在样品中的含量越高。由图 2 可 以看出，在 0 ～ 0. 20 μg / mL 的范围内，维生素 B1 的 标准曲线的相关系数大于 0. 999，具有较好的线性 关系，从而保证了定量的准确。取维生素 B1 的标准 溶液按选定的色谱条件测定，根据 3 倍信噪比计算 得到此方法的检出限为 0. 65 ng / mL。 2. 2 方法的精密度与准确度
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正丁醇，剧烈振荡后静置分层，吸取正丁醇相溶液过 0. 2 μm 有机滤膜，所得样液进高效液相色谱中进行 测定。
对维生素 B1 用标准样品进行确认，维生素 B1 的标准物质出峰图如图 1 所示。
图 1 维生素 B1 的标准物质出峰图
色谱峰的出峰时间是一个定性指标，反映了被 测组分与 色 谱 柱 发 生 的 相 互 作 用［7］。 保 留 时 间 是 定性的一个重要依据。在相同的色谱条件下，维生 素 B1 的出峰时间在 6. 27min 左右，保留时间稳定， 可以很好地对维生素 B1 进行定性。
精密度是保证准确度的先决 条 件［8］。为 了 考 察方法的精密度，按照 1. 3. 1 和 1. 3. 2 的方法对同
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一大米样品进行 6 次平行测定，测定结果见表 1。
表 1 维生素 B1 重现性试验结果
试验序号
1
2
3
4
5
6
测定值 / （ mg·kg － 1 ） 0. 97 0. 93 0. 94 0. 93 0. 97 1. 0
Abstract： The vitamin B1 in rice was extracted by acid hydrolysis，enzymatic hydrolysis and oxidation． A C18 column was used for separation and elution． The mobile phase was methanol and sodium acetate （ 0． 05 mol / L，pH = 4． 5，35∶ 65） ． The vitamin B1 was detected by fluorescence detector quantificationally． The results showed that vitamin B1 had a good linear relationship in the concentration range of 0 ～ 0． 20 μg / mL． The detection limit was 0． 65 ng / mL． The recoere above 95% ． The relative standard deviations were 2． 93% （ n = 6） ． There was no conspicuous difference between the result by this method and the result by the method described in GB / T 7628 － 2008． Key words： rice； vitamin B1 ； high performance liquid chromatography