HTRF技术原理和应用介绍
HTRF used in Kinase research
HTRF激酶检测解决方案激酶简介激酶是磷酸转移酶的一种，它在控制细胞生长，代谢，分化和凋亡的很多信号通路中起着核心作用。
激酶能催化一个磷酸基团从三磷酸腺苷（ATP）转移到特定的底物上。
这些底物可以是蛋白、多肽、脂质，糖，核苷，这些底物被磷酸化后会被激活从而发挥出一些特殊功能，例如在信号传导，调控细胞周期以及代谢等复杂的功能中发挥作用。
因此激酶跟人体的多种疾病如肿瘤，炎症，免疫失调，代谢疾病等有关。
激酶通常根据它们的底物命名。
激酶当中最大的一类是蛋白激酶，蛋白激酶作用于特定的蛋白或多肽，并改变其活性。
目前在人类基因组中已经发现了500多种蛋白激酶，占了人类所有基因的2%左右。
蛋白激酶可以分为：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，酪氨酸蛋白激酶，组氨酸蛋白激酶，色氨酸蛋白激酶，天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶，目前研究的比较多得是前两类。
Cisbio公司利用其专利HTRF技术，开发出一系列的激酶平台，可以分为以下四类：HTRF KinEASE TM, HTRF Transcreener ADP, HTRF Kinase toolbox, Cellular Kinase assays。
目前这些产品被世界上几乎所有的大型药企广泛使用，本期我们将对这些产品逐一作介绍。
HTRF KinEASE TM试剂盒----测定丝氨酸/苏氨酸激酶，酪氨酸激酶活性最方便的平台丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶是药筛的主要靶点。
Cisbio Bioassays和Millipore合作研发了基于HTRF技术的四个激酶试剂盒，已经有160多种激酶利用这个平台上得到了验证。
HTRF KinEASE TM四个试剂盒的实验方法都是一样的，每一个试剂盒都包含有一个通用的生物素化的多肽底物，一个标记了Eu的只针对特异性磷酸化位点的单抗，Sa-XL665以及实验缓冲液。
如图1所示，丝氨酸/苏氨酸激酶试剂盒有三种不同试剂盒，每一种有不同的底物；酪氨酸激酶试剂盒有一种底物，每一种底物都适用于一系列的激酶。
高通量药物筛选利器——HTRF,原理介绍
HTRF 技术介绍快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。
上述优势使得Cisbio 的HTRF 技术一直是药物研发领域的领先技术之一，并广泛用于信号转导研究和免疫检测。
该技术已经在知名医药公司、生物技术公司和学术研究机构应用了15年以上。
HTRF （均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法。
该技术结合了荧光共振能量转移（FRET ，Fluorescence Resonance Energy Transfer ）和时间分辨荧光 （TRF, Time-ResolvedFluorescence)）两种技术。
这种结合将FRET的均相实验方式和TRF 的低背景特点融合在一起，使得HTRF 技术拥有如下优势：操作简单、灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠、假阳性率较低。
HTRF 是基于TR-FRET 的化学技术，拥有与其它TR-FRET 技术相似的特征，包括使用镧系元素（铕和铽），具有非常长的半衰期，很大的Stroke's shift （如图1所示，Eu 3+ Stroke’s shift > 300 nm ）等。
除此之外，它还有其独特的性质，从而与其它技术区分开来。
这主要表现在HTRF 的镧系元素与络合的穴相结合，而不是像其它所有TR-FRET 技术使用螯合物。
螯合物在溶液中是一种动态平衡，在特定条件下不稳定；而HTRF 中应用的穴与镧系元素是永久地嵌合，非常稳定，可耐受较宽的pH 范围、二价金属离子如Mn 2+等、螯合剂如EDTA 等。
HTRF 的独特之处还包括对数据的专利的比值处理方法，其能校正样品基质不同等带来的干扰。
FRET 技术简介FRET 技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为（能量）供体和（能量）受体，前者的发射光谱与后者的激发光谱重叠。
供体被外来能源激发（例如闪光灯或激光），如果它与受体在足够近的距离之内，可以将能量共振转移到受体上。
htrf法 -回复
htrf法-回复[HTRF法]：一种高灵敏、高准确性的生物分析技术引言：近年来，生物分析技术在生命科学和药物研发领域发挥着至关重要的作用。
其中，HTRF法（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence Assay）以其高灵敏度、高准确性和简便操作而备受瞩目。
本文将一步一步回答关于HTRF法的基本原理、应用领域和未来发展方向。
一. HTRF法的基本原理HTRF法是一种光学测量技术，其基本原理是通过荧光共振能量传递来检测分子之间的相互作用或反应。
这个传递过程需要三个关键成分：Donor 标记物、受体标记物和荧光基质。
1. Donor标记物：Donor标记物是受体分子表面的产生能量的物质，通常是用稀土金属离子（如铕或镭）标记。
Donor标记物在受到激发光照射后会发射光子。
2. 受体标记物：受体标记物是Donor标记物能量传递的接收者，通常用荧光染料或荧光蛋白标记。
当Donor标记物的发射光与受体标记物的激发光在频率匹配时，能量会传递给受体标记物。
3. 荧光基质：荧光基质是一个短寿命的荧光化合物，例如有机化学家染料Terbium。
荧光基质在受到发射光照射后，会产生荧光信号，并在一段时间后减弱。
基于这个原理，HTRF法如下工作原理：首先，通过标记Donor和受体标记物，将其加入试验样品中。
当样品中发生特定的分子相互作用或反应时，Donor标记物的发光会与受体标记物的激发光匹配，从而传递能量，使受体标记物产生荧光。
荧光基质会吸收这些荧光，并在一段时间后发射出荧光信号，该荧光信号可以被检测并与样品中分子相互作用的程度相关联。
通过检测荧光信号的幅度与光谱特性，我们可以量化目标分子相互作用的强度和动力学参数。
二. HTRF法的应用领域1. 蛋白质相互作用研究：HTRF法被广泛应用于研究蛋白质相互作用，如配体-受体结合、酶底物结合等。
该技术不仅能够定量测量蛋白质相互作用的强度，还可以研究这些相互作用的动力学参数。
均相时间分辨荧光技术
卡尔·古斯塔法·莫桑德尔 （Carl·Gustaf·Mosander）
背景简介——镧
镧的发现
镧于1839年1月，由在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡研究所的卡尔·古斯 塔法·莫桑德尔（Carl·Gustaf·Mosander）发现。他从在1803已 经发现的铈中提取了它。莫桑德尔注意到他的大多数氧化铈样本不 可溶，而有些是可溶的，他推断这是一种新元素的氧化物。他从铈 中提取出了第二种元素，他称之为didymium（镨钕混合物）。然而 他没有意识到didymium也是混合物，在1885年它被分离成了镨和钕。
利用长发射半衰期的稀土镧系元素作为供体荧光团，HTRF技术结合了荧光共振能量转移 （FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence） 两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF 技术拥有 如下优势：实验方式灵活、可靠，并且具有更高的灵敏度、 稳定，实验结果的假阳性率较低
镧系元素：lanthanide element
镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门， 是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素后又 找到稀土元素中的三个。镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土 元素的第二道大门，是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继 铈和钇两个元素后又找到稀土元素中的三个。
二、荧光共振能量转移
荧光共振能量的缺点：
然而，这些生物测定法在荧光检测方面具有很大的缺点，因为它被来自散射激发光的背 景噪声显着抑制，并且受到样品中共存材料荧光（荧光化合物和粉尘/线）的显着干扰，使其 变得困难以获得高度敏感的测量而且在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰 期非常短，其背景荧光较强。
htrf法 -回复
htrf法-回复HTF法（理性思考五步法）是一种思考工具，用于帮助人们在处理问题和做决策时更有条理和客观。
HTF法的五个步骤分别是：观点表达、原因分析、利弊评估、替代方案、决策与行动。
通过按照这五个步骤进行思考，我们可以更有效地解决问题，做出明智的决策。
本文将依次详细介绍每个步骤。
希望通过了解HTF法，读者们可以更好地运用这一工具来处理问题和做出决策。
第一步，观点表达。
在这一步骤中，我们需要明确我们需要思考的问题或要做出决策的主题。
我们可以通过问自己问题、定义目标或确定关注的焦点来明确要表达的观点。
在这一步骤中，我们应该尽量明确、准确地表达我们的观点，这样后续步骤才能更系统地进行。
第二步，原因分析。
在这一步骤中，我们需要分析问题或决策主题背后的原因。
我们可以通过问自己“为什么”来深入了解问题的起因和根源。
在分析原因时，我们需要尽量客观并且全面地考虑各种可能的因素和变量。
通过这一步骤，我们可以更好地理解问题的本质，为后续的思考和决策提供更坚实的基础。
第三步，利弊评估。
在这一步骤中，我们需要评估问题或决策的利弊。
我们可以通过对不同的利弊进行权衡来确定最合适的决策方案。
在评估利弊时，我们要尽量客观地考虑各种可能的结果和影响，并根据自己的价值观和优先级确定哪些利益对我们来说最重要。
通过这一步骤，我们可以更清晰地看到每个决策方案的优点和缺点，从而更有依据地做出决策。
第四步，替代方案。
在这一步骤中，我们需要寻找并比较不同的替代方案。
我们可以通过提出不同的可能解决方案来寻找更好的选择。
在探索替代方案时，我们需要考虑到每个方案的可行性、成本、风险以及与我们的目标和价值观的契合程度。
通过这一步骤，我们可以扩大思考的范围，寻找到更多可能的解决方案。
第五步，决策与行动。
在这一步骤中，我们需要根据之前的思考和评估做出决策，并采取行动。
在做出决策时，我们需要根据之前的分析、评估和价值观做出明确的选择，并制定实施计划。
在执行计划时，我们需要密切关注反馈和结果，并及时调整和改进。
htrf法 -回复
htrf法-回复[htrf法]原理与应用领域[htrf法]（High-throughput Fluorescence Resonance Energy Transfer）是一种高通量荧光共振能量转移技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将逐步讨论[htrf法]的原理、实验步骤和应用领域。
一、[htrf法]原理[htrf法]利用荧光分子之间的共振能量转移现象，测量分子之间的相互作用。
当两种荧光染料分别存在于分子A和分子B上时，它们的光谱特性可以相互影响。
其中一种染料吸收光子的能量会以非辐射跃迁的方式传递给另一种染料，从而导致获能染料的发射峰增强，另一种染料的发射峰减弱。
这种共振能量转移现象可以通过检测发射光谱的变化来量化分子之间的相互作用。
二、[htrf法]实验步骤1. 实验准备：准备待测样本、荧光探针和仪器设备。
2. 样本标记：将待测的分子A和分子B各自用不同的荧光染料标记。
选择合适的染料对是非常重要的，需要考虑其发射和吸收波长的兼容性以及染料的光稳定性。
3. 混合反应：将标记的分子A和分子B混合，使它们相互作用。
也可以加入其他试剂以改变反应条件，以便研究分子间的互作用。
4. 测量反应结果：使用[htrf法]分析仪器测量样品的荧光发射谱。
该仪器可以同时测量两种不同波长的荧光发射。
5. 数据分析：根据[htrf法]原理中共振能量转移的特点，分析测量到的发射谱数据，计算共振能量转移的效率。
这可以通过计算荧光峰的比例来完成，即获能染料峰的强度与失能染料峰的强度之比。
三、[htrf法]应用领域[htrf法]在生物医学研究中具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 蛋白质相互作用研究：[htrf法]可用于研究蛋白质之间的相互作用，如蛋白质与配体的结合和酶促反应。
通过标记不同的蛋白质和配体，可以研究它们之间的相互作用及其动力学特性。
2. 细胞信号转导：[htrf法]可以用于研究细胞中信号传递途径的动态过程。
一种新的便捷高效、高阳性率的单克隆抗体阳性克隆筛选方法——均相时间分辨荧光（HTRF）
⼀种新的便捷⾼效、⾼阳性率的单克隆抗体阳性克隆筛选⽅法——均相时间分辨荧光（HTRF）⼀种新的便捷⾼效、⾼阳性率的单克隆抗体阳性克隆筛选⽅法——均相时间分辨荧光（HTRF）引⾔在利⽤杂交瘤技术制备单克隆抗体的过程中，总共有两次筛选，第⼀次筛选出杂交瘤细胞（⽤HAT选择性培养基），第⼆次筛选出能产⽣特异性抗体的杂交瘤细胞（采⽤有限稀释克隆细胞法）。
两次筛选的原理和⽅法虽有所不同，但在具体操作时多是采⽤传统的酶联免疫检测⽅法（ELISA）。
该⽅法需要提前在微孔板上包被抗原，做实验时要预先封闭，实验中的每⼀步都需要洗板，整个实验步骤繁多，操作复杂，耗时耗⼒，极⼤地影响了阳性克隆的筛选效率。
本⽂介绍⼀种采⽤均相时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF）技术，快速、⾼效，且提⾼阳性率的阳性克隆筛选⽅法。
技术原理均相时间分辨荧光（HTRF, Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）是⽤来检测纯液相体系中待测物的⼀种常⽤⽅法。
该技术结合了荧光共振能量转移（FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)）两种技术。
FRET技术利⽤了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor），前者的发射光谱与后者的激发光谱重叠。
Donor被外来能源激发（例如闪光灯或激光），如果它与Acceptor在⾜够近的距离之内，可以将能量共振转移到Acceptor上。
Acceptor受到激发，发出特定波长的发射光（图1）。
图1. FRET技术的原理将Donor和Acceptor分别偶联在相互作⽤的两个⽣物分⼦上，⽣物分⼦的结合可以将Donor和Acceptor拉近距离，产⽣能量转移。
htrf方法学
htrf方法学一、HTRF方法学简介高灵敏度时间分辨荧光（HTRF）方法学是一种生物分析技术，主要用于检测低浓度目标分子。
它结合了时间分辨荧光（TRF）技术和高效液相色谱（HPLC）技术，具有高灵敏度、高特异性和宽线性动态范围等特点。
二、HTRF技术原理HTRF技术通过将目标分子与荧光标记物结合，利用荧光信号的强度和时间特性进行分析。
在实验过程中，样品经过HPLC分离，随后通过荧光检测器检测，实现对目标分子的定量分析。
三、HTRF方法学的应用领域HTRF方法学广泛应用于生物科学研究、药物筛选、生物标志物检测等领域。
在生物科学研究中，HTRF技术可用于研究蛋白质相互作用、酶动力学、核酸杂交等；在药物筛选中，可用于筛选药物靶点、评估药物活性等；在生物标志物检测中，可用于疾病诊断、疗效监测等。
四、HTRF方法学的优势与局限性优势：1.高灵敏度：HTRF技术可检测低至ng/L级别的目标分子。
2.高特异性：可通过特异性抗体或核酸探针实现对目标分子的识别。
3.宽线性动态范围：适用于不同浓度范围的样品分析。
4.快速检测：实验流程简便，检测速度较快。
局限性：1.仪器设备较高：HTRF仪器设备相对昂贵，投入成本较高。
2.检测范围有限：对于高浓度样品，HTRF方法的检测效果较好，而对于高分子量或大分子复合物的分析能力较弱。
3.操作技巧要求较高：实验过程中需要严格控制条件，以避免非特异性信号干扰。
五、我国HTRF研究与发展现状近年来，我国HTRF技术研究取得了显著成果，不仅在基础研究方面取得了突破，还成功应用于临床医学、药物研发等领域。
此外，国内多家企业致力于HTRF仪器设备的研发与生产，逐步降低了国外产品的市场占有率。
六、未来发展趋势与展望随着科学技术的不断发展，HTRF方法学在以下几个方面有望取得突破：1.仪器设备的微型化和便携化：通过技术创新，降低设备成本，实现HTRF 仪器的便携化，以满足现场快速检测的需求。
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Cisbio-HTRF®技术原理和应用简介
HTRF®（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术。
该技术基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)）两大技术，开通的一款高通量药物筛选利器。
荧光共振能量转移（FRET）
利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。
Donor被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与Acceptor比较接近，可以将能量共振转移到在Acceptor上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。
将Donor和Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将Donor和Acceptor拉到足够近的距离，产生能量转移，由于Acceptor的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。
时间分辨荧光（TRF）
TRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质，它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同。
普通荧光的半衰期为纳秒级。
镧系元素的半衰期为毫秒级，有6个数量级的差别。
所以，在检测室，TRF有一个时间延迟---50us，经过这个时间延迟，普通荧光的信号几乎为零，所以，TRF
的背景非常低，反映样品实际情况。
HTRF®的能量受体（技术创新点）
HTRF®的能量供体是铕(Eu)和钛(Tb)的穴状化合物。
在这个穴状化合物里，Eu和Tb被永久地嵌合在一个笼子里，结构非常稳定，这个结构由教授发明的，并由此在1987年获得了诺贝尔奖。
HTRF®的能量受体
HTRF®的能量受体也有二种，XL665和d2.它们的光学性质相同，分子量不同，前者分子量为10KD，实际上就是别藻蓝蛋白（APC）。
我们将APC的亚基偶联在一起，使其不能解离，提高了稳定性，后者分子量为1KD，在某些实验中有独特的优势。
HTRF®的操作步骤
HTRF®操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂加进去，然后孵育，检测即可。
HTRF®实验数据分析
HTRF®采用了比值法来处理数据，可以去除溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。
HTRF®应用范围
5.数据客观真实：比值处理可有效去除背景荧光，假阳性率和价阴性率低
6.高端检测，只需简单的酶标仪就可以轻松搞定！
HTRF®检测的仪器
Cisbio与几乎所有的仪器供应商都建立了合作伙伴关系，下面是经过验证的仪器列表:。