重组人前脑啡肽原基因腺相关病毒载体的构建和其镇痛效应的研究

毕中科技大学同津医学院２００２衄博士学位论文结果一、ｐＳＮＡＶ－ｈＰＰＥ质粒的构建为建立携带外源基因的ｒＡＡＶ２载体细胞株，中科院病毒研究所吴小兵实验室构建了适合多种外源基因插入的通用型ｒＡＡＶ２载体质粒ｐＳＮＡＶ。

其结构如下，含有ＡＡＶ２两端的ＩＴＲ，中间依次为ＣＭＶ即早增强子和启动子，多克隆位点和ｐｏｌｙＡ信号。

ｐＳＮＡＶ供外源基因插入的多克隆位点为ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ和ＢｇｌＩＩ；它还携带了ＳＶ４０启动子控制下的新霉素抗性基因（ｎｅｏ．），共转染后选择阳性细胞克隆使用，其基因表达盒位于两个ＩＲＴ之外。

ｐＳＮＡＶ所能装载的外源基因容量为４．６Ｋｂ。

经ＥｃｒｏＩ和ＳａｌＩ双酶切下来的８１０ｂｐ的ｈＰＰＥ基因片段克隆到ｐＳＮＡＶ载体上相应的酶切部位。

重组的ｐＳＮＡＶｈＰＰＥ质粒结构如图１．１所示。

图１．１ｐＳＮＡＶ－ｈＰＰＥ质粒图谱二、重组ｐＳＮＡＶ－ｈＰＰＥ质粒的筛选和鉴定图１．２ｐＳＮＡＶ－ｈｐｐｅＥｃｏＲＩ＋ＳａｌＩ酶切筛选阳性克隆可切下８００ｂｐ左右的ｈＰＰＥ片段。

（从左到右：ＤＬｌ５０００、１－１１克隆、ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ第１、２、３、５、６、７、８阳性，取１号克隆扩大培养，扩增质粒）图１．３ｐＳＮＡＶ－ｈＰＰＥＰＣＲ鉴定成功从重组质粒ｐＳＮＡＶ－ｈＰＰＥ中扩增出８００ｂｐ左右ＤＮＡ片段，证明ｈＰＰＥ基因片段插入ｐＳＮＡＶ载体中。

从右到左：阴性、第一号阳性克隆阳性对照、ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ图１．４ｐＳＮＡＶ－ｈＰＰＥＳｍａｌＩ酶切鉴定从右到左：ＤＬｌ５０００ｍａｒｋｅｒ、载体对照、第１号克隆、ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ重组的１号阳性克隆经ＳｍａｌＪ单酶切后，凝胶电泳得到１０００ｂｐ和８５０ｂｐ左右的两条带，可证明插入的基因片段方向正确，质粒重组成功１９三、ｐＳＮＡＶ－ｈＰＰＥ细胞株的建立１．将１号阳性克隆扩大培养，抽提得到ｐＳＮＡＶ－ｈＰＰＥ，用脂质体法转染ＢＨＫ－２１细胞，经Ｇ４１８筛选培养后，形成新霉素抗性的ｒＡＡＶ２载体细胞，传代培养后获得ｐＳＮＡＶ－ｈＰＰＥ载体细胞株ｐＳＮＡＶ－ＳＨｌ。

２．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ．ｂｌｏｔ鉴定载体细胞上的ｒＡＡＶ２是否能被ＨＳＶ拯救和复制携带目的基因的ＡＡＶ２载体在包装成病毒颗粒之前，必须先将目的基因表达盒及其两端的ＩＴＲ从载体质粒上拯救下来，并进行复制。

该过程需要ＡＡｖ２的Ｒｅｐ蛋白及辅助病毒的参与。

本文所用的辅助病毒（ＨＳＶｌ．ｒｃ／ＡＵＬ２）Ｉ既是辅助病毒，又具有Ｒｅｐ蛋白的功能，因此应具有从载体细胞株的基因组上拯救和复制ｒＡＡＶ２基因组的能力，本实验利用这种作用来进行载体细胞株的鉴定。

在大方瓶中扩增ｒＡＡＶ２／ｈＰＰＥ载体细胞株，并感染辅助病毒。

４８小时后，用Ｈｉｒｔ法从细胞中提取染色体外低分子量ＤＮＡ，将提取到的低分子量ＤＮＡＩ％琼脂糖凝胶上电泳，转膜后，用地高辛标记的ＣＭＶ基因片段为探针进行杂交。

从图中可以看出，感染了ＨＳＶ１－ｒｃ／ＡＵＬ２的载体细胞株的基因组存在ｒＡＡＶ２的复制中间体单倍体（ｍｏｎｏｍｅｒ）和二倍体（ｄｉｍｃｒ）形式的ｒＡＡＶ２ＤＮＡ，见图１．５。

图１．５载体细胞株中前病毒颗粒被辅助病毒拯救和复制三、纯化后ｒＡＡＶ２的检测：１．ｒＡＡＶ２物理滴度的测定，采用点杂交的方法测定，结果如图１．６。

图１．６地高辛标记探针点杂交测定ｒＡＡＶ２／ｈＰＰＥ滴度地高辛标记的探针对ｒＡＡＶＪｈＰＰＥ样品（稀释１００倍）点杂交判断杂交信号与标准中５号相当，经计算得样品滴度为２．５×１０”ｖ．ｇ．／ｍｌ２．ｒＡＡＶ２纯度的鉴定ＡＡＶ２的外壳由三种蛋白构成，即ＶＰｌ、ＶＰ２和ＶＰ３，分子量分别为８７、７２、６２ＫＤ，三种蛋白在ＡＡＶ２中的比例约为１：１：１０，在ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳后形成三个特征性条带，如图１．７所示，条带清晰，未见杂带。

图１．７ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳测定ｒＡＡＶ２／ｈＰＰＥ纯度３．纯化后ｒＡＡＶ２病毒的扫描电镜观察：电镜下可见病毒颗颗粒为２０面体，与野生ＡＡＶ２相似，说明载体构建正确。

图１．８ｒＡＡＶ２／ｈＰＰＥ病毒颗粒电镜照片（５万倍）华中辞技太拳同沣垂季晓２００２敏博士学隹论文结果一、大鼠原代大脑皮层星形胶质细胞的培养原代培养星形胶质细胞传代两次后纯度可高达９９％。

光镜下呈较不规则外观，呈三角形或多边形，透明，带有一个或多个粗大的突起，胞质较丰富，细胞核常偏于一侧，细胞排列不规则，有接触抑制现象。

胶质原纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）免疫组织化学鉴定所培养细胞为阳性，说明该细胞是星形胶质细胞，见图２．１。

图２．１原代星形胶质细胞的培养及鉴定０００倍）左：原代培养星形胶质细胞右：ＧＦＡＰ免疫组织化学染色鉴定二、大鼠原代海马神经元的培养培养２天后可见多数细胞贴壁，也有悬浮的坏死细胞，贴壁细胞大小不等，明显可见形态较大的锥体状细胞，并发出短突起，少数细胞突起较长；２—３天后，胶质细胞等非神经细胞快速生长、数目增多。

经阿糖胞苷处理后，非神经细胞大部分死亡，贴壁细胞明显减少，神经元突出于视野之中。

７天后可见锥体状神经元体积增大，多有３～４个突起，并发出２～４级分枝，突起可达胞体的２～３倍，细胞表面光滑、边界清楚、胞浆均匀一致、细胞轮廓反光好。

神经元存活可达２８天。

经兔抗神经元特异性烯醇抗体（ＮｓＥ）免疫细胞化学染色显示所培养细胞为神经元，见图２．２。

图２．２原代神经元的培养及鉴定（ＤＡＢ显色，２００倍１左：原代培神经元右：ＮＳＥ免疫组织化学染色鉴定华中科技大学一痒医学晓２００２衄博士学位论文三、原代胚胎大鼠神经干细胞的培养由胎鼠海马分离的原代细胞，在添加ｂＦＧＦ的无血清培养基中生长２－３天后，可见许多由数个细胞组成的小球，随着培养时间延长小球内的细胞数目迅速增加，培养７天后，培养瓶中形成大量致密的悬浮细胞团，每个细胞团由数十，甚至数百个细胞组成，收集细胞球离散传代，接种到新鲜培养液中很快生成新的细胞球。

在培养过程中，有少量悬浮生长的细胞球自发贴壁，边缘的细胞向外迁移，并长出突起。

经２～３代，培养的神经干细胞纯度可达９５％以上。

细胞团在５％胎牛血清和多聚赖氨酸诱导贴壁后行免疫组织化学细胞化学染色，结果显示细胞呈巢蛋白（Ｎｅｓｔｉｎ）抗原阳性反应，表明培养神经细胞为神经干细胞，见图２．３。

图２．３原代神经干细胞培养及鉴定（ＤＡＢ显色，１００倍）左：原代神经干细胞培养（４０倍）右：血清诱导贴擘后Ｎｅｓｔｉｎ免疫组化染色呈阳性四、ｒＡＡＶｚ／ｅＧＦＰ转染细胞检测腺相关病毒对不同神经细胞的转染效率１．ｒＡＡＶ２／ｅＧＦＰ转染大鼠皮层胶质细胞后２４￣４８小时，倒置荧光显微镜下可见散在的绿色荧光表达，约为２～３个／４０倍视野。

转染４８小时～５天，表达细胞数逐渐增多，但整体转染效率仍在２０％以下，见图２．４。

图２．４ｒＡＡＶ２／ｅＧＦＰ转染体外培养星形胶质细胞（１０天，２００倍）左：蓝色激发光ｒ荧光显示右：普通光镜显示毕中科鼓大学网辛医学晓２００２鼓博士学位论文２．转染后２４小时后，即有大鼠海马神经元细胞表达绿色荧光，４８～７２小时，表达荧光细胞数明显增多，到转染后第７～１０天，表达率达到高峰（９４士４％），见图２．５。

图２．５ｒＡＡＶ２／ｅＧＦＰ转染体外培养海马神经元（１０天，２００倍）左：蓝色激发光下荧光显示右：普通光镜显示３．ｒＡＡＶ２／ｅＧＦＰ转染神经干细胞１２小时后，倒置显微镜Ｆ即可见散在的荧光表达，４８小时后表达显著增多，到７～１０天时表达达到高峰（转染率为９２士３％）。

镜下荧光呈团块状，有细胞轮廓突起于表面，表明细胞球中细胞多被转染并成功表达绿色荧光蛋白。

培养神经干细胞２月后，绿色荧光蛋白的表达率仍在８０％以上。

图２．６ｒＡＡＶ２／ｅＧＦＰ转染体外培养星形胶质细胞（１０天）Ａ：普通光镜显示Ｂ；蓝色激发光Ｆ荧光显示（４０倍）Ｃ：普通光镜显示Ｄ：蓝色激发光下荧光显示（２００倍）４１毕中科技太学同沣医学晓２００２衄博士学位论文４．ｒＡＡＶ２对不同神经细胞的转染率的比较见图２．７。

转染室＾８摹胶质细胞十细胞ｏ１８１２３５７１０时间（天）图２．７ｒＡＡＶ２对不同神经源性细胞的转染率比较（ｎ－５）五、ｒＡＡＶ２感染对干细胞生物学特性的影响由图２．８、２．９可看出，５％血清诱导神经干细胞分化及神经干细胞分化传代后荧光能有较高的表达率。

１．血清诱导神经干细胞分化后ｅＧＦＰ的表达图２．８５％血清诱导神经干细胞分化后ｅＧＦＰ的表达（２００倍）左：监色激发光下，分化后神经干细胞ｅＯＦＰ表达呈绿色荧光右：普通光镜对照图２．９血清诱导神经干细胞分化传代后ｅＧＦＰ的表达（１００倍）左：蓝色激发光下，神经干细胞分化传代后ｅＧＦＰ表达呈绿色荧光右：普通光镜对照４２２．血清诱导神经干细胞分化细胞免疫组织化学鉴定加入５％血清培养神经干细胞４８小时，可见细胞贴壁，伸出伪足，逐渐向周围迁移，经ＧＦＡＰ和ＭＡＰ２免疫组织化学鉴定，神经干细胞可分化为星形胶质细胞和神经元，见图２．１０。

图２．１０５％血清诱导转ｒＡＡＶＪｅＧＦＰ神经干细胞分化（２００倍，ＤＡＢ显色）左ＭＡＰ２阳性细胞（神经元）右ＧＦＡＰ阳性细胞（星形胶质细胞）３．神经干细胞感染ｒＡＡＶ２／ｅＧＦＰ后，生长曲线和群体倍增时间的变化感染ｒＡＡＶ２后神经干细胞的增殖速度和未感染ｒＡＡＶ２的神经干细胞无差异，见图２．１１。

经计算，两者的ＰＤＴ分别为：１９８士３小时和２０１士４小时，无统计学差异（Ｐ＜０．０１）。

图２．１ｌ感染和未感染ｒＡＡＶ２的神经干细胞在一个培养周期内细胞增殖的比较４３一一一一一一一一娜细胞数六、转染ｒＡＡＶ２／ｈＰＰＥ后，不同神经细胞内ｈＰＰＥｍＲＮＡ的表达转染５天后，星形胶质细胞、和神经干细胞的ｈＰＰＥｍＲＮＡ表达量比未转染细胞增高。

吸光度比值分别为神经元０．４８＋０．１０ＶＳ０．１３＿＋０．０４（转染ＶＳ未转染，Ｐ＜Ｏ．０１）星形胶质细胞０．２９＋０．０９ＶＳ０．０９＿＋０．０２（转染ｖｓ未转染，Ｐ＜Ｏ．０１）神经干细胞０．４４＋０．０８ＶＳ０．０８＿＋０．０３（转染ＶＳ未转染，Ｐ＜Ｏ．０１），见图２．１２。

图２．１２不同神经细胞转染ｒＡＡＶ２／ｈＰＰＥ后ｈＰＰＥｍＲＮＡ表达的比较１．ＤＬ２０００ｍａｒｋ２．神经元（未转染）３．神经元（转染）４．星形胶质细胞（未转染）５．星形胶质细胞（转染）６．神经干细胞（未转染）７．神经干细胞（转染）七．转染ｒＡＡＶ２ＪｈＰＰＥ后，细胞培养上清液中Ｌ－ＥＫ的含量转染ｒＡＡＶ２／ｈＰＰＥ后，星形胶质细胞、神经元和神经干细胞培养上清中的Ｌ－ＥＫ含量上升，和未转染细胞相比有统计学差异（Ｐ＜Ｏ．０１）。

见表２．１。

表２．１不同神经细胞转染ｒＡＡＶ２／ｈＰＰＥ后细胞培养上清液中Ｌ－ＥＫ的含量变化（ｎ＝１ｑ茁－＋ｓ，ｐｇ／ｍ１）和未转染细胞相比，‘Ｐ＜Ｏ．０１图２．１３人、金黄地鼠、大鼠和猪的ＰＰＥ基因结构本研究中，转染后ｈＰＰＥ在不同神经细胞中均可达到过表达，和转染ｅＧＦＰ时所观察到的情况相似，在星形胶质细胞中的表达增加量较少，细胞培养基中亦可检测出ｈＰＰＥ的蛋白产物亮脑啡肽的含量增高，此结果表明：１）非同源基因转染可在异种细胞内复制、转录和翻译；２）ｒＡＡＶ２可介导不同的基因转染，目的基因的表达率和ｒＡＡＶ２对受体细胞的亲和性有关，而和被转染的基因关系不大。