LC-MS方法鉴定黄酮类化合物
黄酮类化合物的检识与结构测定
HO
OH
AlCl3
OH O O Al O
3+
HCl/H2O
O O Al3+
形成络合物的能力： 黄酮醇3-OH >黄酮5-OH（二氢黄酮5-OH）> 邻二 酚羟基 > 二氢黄酮醇5-OH 邻二酚羟基和二氢黄酮醇 5-OH 在酸性条件下不与 AlCl3络合； 但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络合； 形成络合物越稳定，红移越多。 4）二者相减可检测邻二酚羟基。
２）聚酰胺层析
适用范围广，可分离含游离酚羟基或其苷类。 常用展开系统：乙醇：水（3：2）；丙酮：水（1：1） 等。 显色剂：紫外光； 2% 三氯化铝甲醇液； 1%K3Fe(CN)6(1:1)混合液。 1%FeCl3 /
二、紫外光谱在黄酮类鉴定中的应用
可用于确定黄酮母核类型及确定某些位置是否含
有羟基。 一般程序： ①测定样品在甲醇中的UV谱以了解母核类型； ②在甲醇溶液中分别加入各种诊断试剂后测 UV谱 和可见光谱以了解3, 5, 7, 3’, 4’有无羟基及邻二酚 羟基；
有4’-OH，无3-OH 有3-OH，无4’- OH
+NaOMe 或 +NaOH
带 I ， II 随 加 NaOMe 时间延长，逐渐衰减 320-330 nm有小峰
有 3, 4’-OH 或 3, 3’, 4’OH（衰减更快）
7-OH
+NaOAc (未熔溶)
5-20
有 3-OH, 4’OH 也 发 生 红移，但意 义不大
若上述条件不成立，则H-2’, 6’分别为二重峰 （J=2Hz）
（三） C环质子
1. 黄酮类
竹叶黄酮的分离提取
竹叶黄酮的分离提取、检测与成分分析姓名：周胤潇班级:微生物121学号：201201220414摘要：竹叶黄酮(Bamboo- leaf-flavonoid, BLF)是我们于上世纪90年代末创制的一种新型植物黄酮制剂,具有优良的抗自由基、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧、抗病毒、抗菌、抗炎、降脂、扩冠和免疫增强活性等（1-2）。
竹叶总黄酮以其巨大的资源优势和良好的药理活性将成为一种非常有前途的天然药物,具有广阔的开发前景.本实验主要对竹叶中黄酮类物质的含量用紫外分光法进行测定以及高效液相色谱法对竹叶提取物的成分分析。
关键词：竹叶黄酮类物质紫外分光法高效液相色谱法前言竹子为禾本科Poaceae竹亚科Bambusoideae多年生常绿植物，在我国分布很广，资源十分丰富。
竹子在建筑、水利、农业等领域都有广泛的应用，然而，竹子加工利用后，竹叶却总是被弃置，造成了极大浪费。
近年来的研究发现竹叶中含有多种活性物质，其主要活性物质是黄酮类物质,含量平均在2%,竹叶提取物中的有效成分主要是以荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷为代表的碳苷黄酮和以对香豆酸、绿原酸、咖啡酸和阿魏酸为代表的植物酚酸为主，竹叶黄酮中的功能因子主要是黄酮糖苷和香豆素内酯,黄酮类物质是一类天然植物成分，具有显著的生理及药理活性，黄酮类成分有明显的抗溃疡、解痉、抗菌、抗炎、降血脂、镇痛和雌性激素等生物活性和生理活性作用⑶。
实验目的：（1）掌握样品的前处理的方法（2）掌握竹叶黄酮的提取、分离与纯化（3）用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定竹叶子中总黄酮（4）采用超高效液相色谱（UPLC）定量分析竹叶中荭草苷、异荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、对香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸8 个特征性成分的量。
1 实验材料和仪器1.1实验材料：竹叶（摘自浙江农林大学校园内）标准样品：甲醇（分析纯）、乙醇（分析纯）、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚（分析纯）、氢氧化钠、芦丁标准品（购自中国药品生物制品检定所，纯度均大于98%）、去离子水。
蒙药广枣总黄酮的提取及HPLC和LC-MS定性分析
加 热 回流 提取 ２ ， 料 比分别 为 １： 和 ８ １每 次 １， 次 液 ０１ ：， ｈ 合并 两
次 提取 液 ， 滤过 ， 滤液 回收 乙醇 ， 置 ， 心 ， 清 液 １６ ０ｍ ， 静 离 上 ２０ Ｌ 从
紫 外 可见 分 光光 度计 （６ 世纪 ）ｓｒ ｒ ｓ 电子 天 平 （ Ｔ新 ，ａｏｉ 型 ｔｕ 德
液 相一 质谱 联用 仪 ， 配备 电喷雾 离 子源 ， 离子肼 质 谱检测 器 。 Ｈ Ｄ Ｏ 孑 吸 附树 脂 （ Ｐ Ｉ０大 Ｌ 河北 沧 州 ） 层 析 聚酰 胺 （０ ９ ，柱 ６ ～０
目） 。
部 ， 蒙 医习用 药材 。广枣 性 味甘 、 ， ， 有行 气活 血 、 心安 为 酸 平 具 养 神 之 功效 ， 于气 滞血 瘀 、 用 胸痹 作痛 、 心悸 气短 、 神 不安 等疾 病 心
参考 文献 【】 宁省 阜新 卫 生局． 医药方剂 汇编 ［ ． 宁人 民 出版社 ， ７ ． ｌ 辽 蒙 ＭＩ 辽 １ ６ ９ 【 国 家药典委 员会 ． 国药典一部 ・０ ５ 『． 学 工业 出版社 ， ２ 】 中 ２０ 版 ｓ化 】
２ ４． ２
峰 型较 好 ， 具较 适合 的保 留时间 。该方 法准 确 、 并 灵敏 、 简便 ， 可
容 ， 备供 试 品溶液 。为保 证被 测成 分洗 脱完 全 ， 察 了 同一批 制 考 号供试 品 ， ５ ％甲醇 洗脱 ， 用 ０ 收集 洗脱 液 ４ ｍ 后 ， 继 续收 集洗 ５ｌ 再
脱液 １ｍ 进 行 测定 ， ０Ｌ 结果 在与对 照 品相 同 的保 留时 间处基 本无 吸收 ， 明 ４ｍ 表 ５ Ｌ洗脱 液可 以将麻 黄 碱洗 脱干 净 。
国赛多 利斯 ）Ｅ Ｅ Ａ Ｎ １０ ，Ｙ Ｌ 一 １０型旋转 蒸发 仪 （ 海爱 郎仪 器有 限 上 公 司 ）Ｓ Ｚ Ｄ循 环水 式 真空泵 （ 南 巩义 市英 峪华 中仪器 厂 ） ，Ｈ — 河 ， Ｋ 一 ０Ｅ型超 声波 清洗器 （ Ｑ １０ 昆山超声 仪 器科技 有 限公 司 ） 。
LC-MS方法鉴定黄酮类化合物
黄酮类化合物 (flavonoids)
一、 概 述
广泛分布于植物中的天然有氧杂环化合物，主要游离态和与糖结合成苷的形式存在。 藻类、细菌等微生物中没有发现黄酮类化合物的存在。
以前，黄酮类化合物主要是指基本母核2-苯基色原酮类化合物，现在则是泛指两个 苯环（A-与B-环）通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。
四、黄酮化合物的生物功能 1、使植物免除紫外线对植物的辐射损伤； 2、抵抗昆虫、病原菌； 3、络合有毒金属离子； 4、参与光敏过程与能量转移； 5、调节植物生长等生理活动等。
同种不同属植物的化学何成分有一定相似性，故在植物 化学分类学上作为Chemotaxonomic markers。
五、黄酮的生物活性
对黄酮苷首先对样品进行甲基化、乙基化、三甲基硅烷化等衍生化操作。
化学电离（Chemical ionization，CI）质谱法
对黄酮苷的鉴定效果差。
场解析（Field desorption，FD）质谱法
快原子轰击（Fast atom bombardment，FAB）质谱法
LC-MS法鉴定黄酮
热喷雾（Thermospray ionization，TSP) 质谱
黄酮骨架上结合位点的不同可能与其酶抑制活性、抗氧化活性有关。在Manach 的研 究中，大剂量 Quercetin 给以大鼠后，其甲基化代谢产物 Isorhamnetin 含量很高。而 已知Isorhamnetin对黄嘌呤氧化酶 的抑制能力强于Quercetin 。
黄酮类化合物的MS鉴定
电轰击（Electron impact，EI）质谱法
Stobiecki, M., et al., Profiling of phenolic glycosidic conjugates in leaves of Arabidopsis thaliana using LC/MS. Metabolomics, 2006. 2(4): p. 197-219.
基于UPLCQTOFMSMS技术快速鉴定降香中化学成分
基于UPLCQTOFMSMS技术快速鉴定降香中化学成分一、本文概述随着现代科学技术的发展，对天然植物产品的化学成分研究已成为中医药现代化的重要组成部分。
降香，作为一种传统中药材，广泛用于活血化瘀、消肿止痛等方面。
由于降香化学成分复杂，传统分析方法在鉴定其中的有效成分时存在一定的局限性。
为此，本研究采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLCQTOFMSMS）技术，对降香中的化学成分进行快速鉴定。
本文首先介绍了UPLCQTOFMSMS技术的基本原理及其在天然产物分析中的应用。
随后，详细阐述了实验方法，包括样品处理、色谱和质谱条件等。
通过对降香样品的分析，我们鉴定出多种化学成分，并对这些成分的结构进行了推测和验证。
本文讨论了这些化学成分的药理作用及其在中医药中的应用前景。
本研究不仅为降香的化学成分分析提供了新的方法，也为中医药的现代化研究提供了科学依据。
二、材料与方法降香样品：采集自我国某地区，经鉴定为降香（Dalbergia odorifera T. Chen）。
超高效液相色谱四极杆飞行时间串联质谱（UPLCQTOFMSMS）系统：由美国Waters公司提供，包括Acquity UPLC系统、evo G2S QTOF 质谱仪、MassLynx数据处理系统。
电子天平：购自瑞士Mettler Toledo公司，型号为ME104E。
超声波清洗器：购自昆山市超声仪器有限公司，型号为KQ500DE。
准确称取100 mg样品粉末，加入10 mL乙腈，超声提取30分钟。
提取液经22 m微孔滤膜过滤，滤液用于UPLCQTOFMSMS分析。
色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3柱（1 mm 100 mm，8 m）。
梯度洗脱程序：05 min，595B510 min，95B1012 min，955B。
正离子模式：毛细管电压0 kV，锥孔电压40 V，源温度100，去溶剂温度350，去溶剂气体流量600 Lh。
黄芩中黄酮类化合物药理学作用研究进展
黄芩中黄酮类化合物药理学作用研究进展一、本文概述黄芩，作为中国传统中药的瑰宝，自古以来就在中医药理论中占据重要地位。
黄芩的药用价值主要来源于其含有的黄酮类化合物，这些化合物具有多种药理学作用，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等。
随着现代科学技术的进步，对黄芩中黄酮类化合物的药理学作用研究不断深入，为黄芩在临床治疗中的应用提供了更为科学的依据。
本文旨在综述近年来黄芩中黄酮类化合物的药理学作用研究进展，以期为黄芩的进一步开发利用和临床应用提供理论支持。
本文将首先介绍黄芩及其黄酮类化合物的概述，包括黄芩的生物学特性、黄酮类化合物的种类及结构特点等。
然后，重点综述黄酮类化合物在抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等方面的药理学作用及其机制。
还将对黄芩中黄酮类化合物的提取分离方法、含量测定以及药代动力学等方面的研究进展进行简要概述。
对黄芩中黄酮类化合物的临床应用前景及存在的问题进行展望，以期为其在医药领域的深入研究和应用开发提供参考。
二、黄芩黄酮类化合物的提取与分离黄芩黄酮类化合物作为黄芩的主要活性成分，其提取与分离技术的研究对于深入理解其药理学作用具有重要意义。
近年来，随着科学技术的进步，黄芩黄酮类化合物的提取与分离方法得到了不断的优化和创新。
提取方法：黄芩黄酮类化合物的提取主要采用有机溶剂提取法、水提法、超声波提取法、微波提取法以及超临界流体萃取法等多种方法。
其中，有机溶剂提取法因其操作简便、提取效率高等优点而被广泛应用。
然而，由于有机溶剂可能对人体和环境造成危害，因此，寻求环保、高效的提取方法仍是研究的热点。
分离技术：黄芩黄酮类化合物的分离主要依赖于色谱技术，包括硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、大孔树脂柱色谱等。
近年来，随着色谱技术的不断发展，高效液相色谱（HPLC）、超高效液相色谱（UPLC）以及液相色谱-质谱联用（LC-MS）等技术在黄芩黄酮类化合物的分离中得到了广泛应用。
这些技术不仅提高了分离效率，而且有助于化合物的准确鉴定。
芹菜籽中黄酮成分的提取纯化及LC-MS检测
说 明此 提 取 纯 化 方 法 具 有 可 行 性 。 【 关 键 词 】芹菜 籽 ； 黄酮； 提 取 纯化 ； 液 相 色谱 一质谱
【 中图分类号】 Ｒ ２ ８ ４ ． ２
【 文献标识码】Ａ
【 文章 编号】１ ６ ７ ２ — ５ ６ ５ ４【 ２ ０ １ ３ ） Ｏ ８【 ａ ） 一 ０ ０ ０ ８ — ０ ２
Ｊ Ｉ Ｉ ＡＮＧＸｉ ａ ｏ ｈ ａ ｎ｜ ＭＥＮＧ Ｑｉ ｎ ｇ ２ ＬＩ ＵＬｉ ｌ ａ ｎＩ Ｌ Ｉ ＵＨｏ ｎ ｇ ｍｅ ｉ ｉ
１ ． Ｇｕ ａｎ ｇ ｄｏ ｎ ｇ Ｆ ｏｏ ｄ Ａｎ ｄ Ｄｒ ｕ ｇ Ｖｏ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎａ ｌ — ｔ ｅ ｃ ｈ ｎｉ ｃ ａｌ Ｓ ｃ ｈｏ ｏ１ ．Ｇｕａ ｎ ｇｄ ｏ ｎｇ ５１ ０ ６６ ３，Ｃｈ ｉ ｎａ ；２． Ｇｕ ａ ｎｇ ｄｏ ｎ ｇ Ｐｈ ａ ｒ ｍａｃ ｅ ｕｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎｉ ｖｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｃｅ ｎｔ ｒ ａ ｌ ｌ ａ ｂｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ， Ｇｕａ ｎｇ ｄ ｏｎ ｇ ５１ ０ ２２ ４， Ｃｈｉ ｎ ａ
旱芹 （ Ａｐ ｉ ｕ ｍ Ｇｒ ａ ｖ ｅ ｏ ｌ ｅ ｎ ｓ ， ｃ ｅ ｌ ｅ ｒ Ｙ ） 为 伞 形 科 一 年 生 或 二 厂 ） ； 磷酸 （ 色谱醇 ） （ 天津 市 科 密 欧 化 学 试 剂 开 发 中心 ） ； 甲醇 （ 色 年 生草 本 植 物 ， 异名香芹 、 药 芹 等 …。 芹 菜 籽 为 伞 形 科 植 物 旱 芹 谱 醇 ） 、 乙腈 （ 色谱醇 ） ， （ Ｔ ｅ ｄ ｉ ａ Ｃ ｏ ｍｐ ａ ｎ ｙ Ｉ ｎ ｃ ． ＵＳ Ａ） ； 蒸馏水、 二 Ａｐ ｉ ｕ ｍ ｇ ｒ ａ ｖ ｅ ｏ ｌ ｅ ｕ Ｓ Ｌ． ｖ ａ ｒ ． ｄ ｕ ｌ ｅ ｅ ＤＣ． 的干 燥成 熟果实。 目前 研 次 去 离 子 水 （ 实 验 室 自制 ） ； 大孑 Ｌ 吸 附 树 脂 Ｄ． １ ６ （ 中 国沧 州 远 威 化 究 表明芹 菜籽具有 抗氧化 、 抗 肿瘤 、 降血脂 、 降 血 压 等 多种 药 理
食品中黄酮类化合物含量分析方法研究
食品中黄酮类化合物含量分析方法研究黄酮类化合物是一类具有多种生物活性的天然化合物，广泛存在于蔬菜、水果和谷物中。
它们被认为具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降低胆固醇和抗衰老等多种保健功能，因此备受关注。
为了准确测定食品中黄酮类化合物的含量，科学家们进行了大量研究，提出了多种分析方法。
其中一种常用的分析方法是高效液相色谱（HPLC）法。
这种方法通过将食品样品中的黄酮类化合物分离并与特定检测剂发生反应，利用检测剂和产物之间的荧光性质进行定量分析。
HPLC法不仅能够准确地分离食品样品中的黄酮类化合物，还能够快速、灵敏地测定它们的含量。
然而，该方法在实际应用中存在一些局限性，比如需要耗费较多的时间和昂贵的仪器设备。
为了解决HPLC法的局限性，科学家们着手研究其他分析方法。
其中一种是质谱联用技术（LC-MS），它结合了高效液相色谱和质谱技术的优势。
该方法通过先利用HPLC将食品样品中的黄酮类化合物分离，然后通过质谱技术进行定性和定量分析。
与HPLC法相比，LC-MS具有更高的选择性、灵敏度和分析速度。
然而，这种方法的复杂性和高昂的成本限制了其在实际应用中的推广。
除了HPLC和LC-MS，还有其他一些新兴的分析方法被应用于食品中黄酮类化合物的含量分析。
例如，基于表面增强拉曼光谱（SERS）的方法，通过将食品样品与金属纳米颗粒混合，利用纳米颗粒引起的电磁增强效应来提高黄酮类化合物的信号强度，从而实现灵敏的定性和定量分析。
此外，还有一种名为电化学法的分析方法，它利用电化学技术测定黄酮类化合物的电化学行为来推断其含量。
这些新兴方法在提高分析效率和降低成本方面具有巨大潜力。
综上所述，食品中黄酮类化合物含量分析方法的研究一直在不断深入。
HPLC法作为传统的分析方法，已经取得了一定的成绩。
然而，为了提高分析的速度和灵敏度，科学家们不断探索新的方法。
LC-MS、SERS和电化学法等新兴方法在提高分析效率和降低成本方面具有潜力，但仍需要进一步研究和改进。
LC—MS／MS法同时测定葛根药材中14种异黄酮类成分的含量
LC—MS／MS法同时测定葛根药材中14种异黄酮类成分的含量目的：建立同时测定葛根药材中14 种异黄酮类成分含量的方法。
方法：采用液相色谱串联质谱法同时测定14批葛根药材（野葛：PL-1～PL-7，粉葛：PT-1～PT-7）中14种异黄酮类成分的含量。
色譜柱为Extend C18，流动相为甲醇-水（梯度洗脱），流速为0.8 mL/min，柱温为22 ℃，进样量为5 μL；离子源为电喷雾离子源，检测方式为负离子检测，扫描方式为多级反应监测模式，喷射电压为-4 500 V，离子源温度为600 ℃，雾化气为60 psi ，辅助气为60 psi，碰撞气为7 psi，气帘气为30 psi。
采用SIMCA 13.0软件对上述14批药材进行聚类分析。
结果：14种待测异黄酮类成分在10～1 000 ng/mL（葛根素为10～5 000 ng/mL）范围内具有良好的线性关系（r均大于0.990 0），精密度、稳定性和重复性试验的RSD均小于5%，加样回收率范围为95%～105%，RSD范围为0.8%～4.5%（n=6）。
野葛与粉葛中异黄酮类总含量差异较大，不同产地的葛根药材异黄酮含量差异较大；14种异黄酮类成分中，葛根素含量最高。
聚类分析结果显示，14批葛根药材可聚为4类，PL-2为Ⅰ类，PL-3、PL-4为Ⅱ类，PL-5、PL-6、PL-7为Ⅲ类，其余为Ⅳ类。
结论：该方法操作简单、重复性良好，可用于检测葛根药材中14 种异黄酮成分的含量，适用于该药材的整体质量控制。
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of 14 kinds of isoflavones in Pueraria radix. METHODS：LC-MS/MS was adopted to detect 14 kinds of isaflavones in 14 batches of P. radix （P. radix：PL-1 to PL-7，P. thomsonii：PT-1 to PT-7）. The determination was performed on Extend C18 with mobile phase consisted of methanol-water （gradient elution）at the flow rate of 0.8 mL/min. The column temperature was set at 22 ℃. The sample size was 5 μL. Ion source was ESI source. The detection mode was negative ion detection. Scanning mode was MRM with jet voltage of -4 500 V；ion source temperature was set at 600 ℃，and atomization gas was 60 psi. The auxiliary gas was 60 psi，collision gas was 7 psi，air curtain gas was 30 psi. SIMCA 13.0 software wasused for cluster analysis of above batches. RESULTS：The linear range of 14 kinds of isoflavones ranged 10-1 000 ng/mL（puerarin of 10-5 000 ng/mL，r>0.990 0）. RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 5%. The recoveries were 95%-105%（RSD were 0.8%-4.5%，n=6）. The total content of isoflavones were different significantly between P. radix and P. thomsonii. The contents of isoflavones in P. radix from different origins were different significantly. Among 14 kinds of isoflavones，the content of puerarin was the highest. Results of cluster analysis showed that 14 batches of P. radix could be clustered into 4 categories，including PL-2 as Ⅰcategory，PL-3 and PL-4 as Ⅱcategory，PL-5，PL-6 and PL-7 as Ⅲcategory，other as Ⅳcategory. CONCLUSIONS：The method is simple and reproducible. It can be used for content determination of 14 kinds of isoflavones in P. radix and quality control.KEYWORDS Pueraria radix；Pueraria thomsonii；Isoflavones；LC-MS/MS；Content determination 葛根和粉葛分別为豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]和甘葛藤（P.thomsonii Benth.）的干燥根，在中医用药史上二者均作为葛根（P. radix）药材使用，具有解肌退热、透发麻疹、生津止渴、升阳止泻的作用[1]。
保健食品中黄酮类功效成分的LC-MS检测技术研究
保健食品中黄酮类功效成分的LC-MS检测技术研究目的：采用液质联用技术对保健食品中黄酮类功效成分进行快速筛选,建立准确可靠的定性定量方法,为保健食品的质量标准研究提供一定的研究思路和方法示范。
所建立的方法可应用于生产企业,也可应用于检测、监管机构,从而更好地对保健食品进行质量控制和监管,打击假冒伪劣商品,规范保健食品市场。
方法：对13个含银杏叶保健食品、13个含大豆异黄酮保健食品、葛根枳棋软胶囊和蜂胶液进行示范性研究。
1、保健食品样品收集。
从市面上收集具有代表性的不同批号、不同厂家、不同包装、不同剂型同一主要原料的保健食品,按照原标准《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)收载项下的质量评价方法进行检测,判断是否为合格产品。
2、采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查保健食品中多种黄酮类化合物。
分别对色谱柱、流动相体系、数据采集模式、离子源参数和碰撞能量等参数进行优化,并通过与对照品对比、数据库匹配及文献数据分析,明确保健食品中所含的黄酮类成分。
3、采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱法建立同时测定保健食品中多种黄酮类化合物的定量分析方法。
采用负离子电喷雾选择反应监测(SRM)模式,分别对管镜补偿电压、碰撞能量和定量离子对等参数进行优化,同时进行检测限、定量限、线性范围、精密度、重复性、稳定性和加样回收率等方法学考察。
4、以相关功效成分及其含量为指标,对不同来源含银杏叶保健食品和含大豆异黄酮保健食品的差异进行比较研究。
5、对所检测的每个黄酮类化合物的裂解途径进行解析,总结黄酮类化合物电喷雾质谱(ESI-MSn)特征裂解规律,为建立黄酮类成分目标物的精确分子量、二级MS2质谱图的数据库及一定色谱条件下保留时间的数据库奠定基础。
结果：1、参照原质量标准方法进行检测,市场上部分保健食品的功效成分含量未达到企业标准中功效成分的标示量。
2、采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查了13个含银杏叶保健食品中16种黄酮类化合物、13个含大豆异黄酮保健食品中6种异黄酮类化合物、葛根枳棋软胶囊中20种黄酮类化合物及蜂胶液中16种黄酮类化合物。
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20个标准品LC-MS分析
Malonate-Free Samples Preparation for LC-MS Study
Direct extract of flower
11 A 3-methylquercetin 7-O- -D-glucoside 12 B irilone 4´-O- -D-glucoside 16 3-methylquercetin 7-O- -D-glucoside
CID MS/MS spectra of kaempferol 3-O-rhamnosyl-glucosyl-glucoside 7-O-rhamnoside, MW 902
Negative mode 287 433
595 755
901 首次发现的新化合物
质谱规律总结：
Positive spectra of kaempferol 3-O-glucoside 7-O-rhamnoside and Isorhamnetin 3-O-glucoside 7-O-rhamnoside the rupture of glucose from the C-3 hydroxyl was noted in the first step of fragmentation
Stobiecki, M., et al., Profiling of phenolic glycosidic conjugates in leaves of Arabidopsis thaliana using LC/MS. Metabolomics, 2006. 2(4): p. 197-219.
黄酮C环取代情况对DPPH自由基清除能力影响显著，B环上的相邻羟基 对抗氧化也有影响。
六、黄酮在人体内吸收、分布、代谢、排泄（ADME）
天然黄酮多以糖苷的形式存在，黄酮的存在形式与其吸收有密切关系。 Hollman 认为槲皮素以糖苷形式较苷元吸收好，但有人持不同意见。
黄酮在小肠细胞内与葡萄糖醛酸结合，然后与蛋白结合并被转运到肝脏，在肝脏中 进一步结合上硫酸盐或（和）甲基，从而在循环系统中有较长消除时间，半衰期达到2228h。
1974年，1674种 1980年，2721种 1993年，超过4000种 2010年，？？
羟基理论上都是成苷位点，但某些位点羟基更易于成苷：
7 - 羟基 in flavones, flavanones 与isoflavones 3, 7 - 羟基 in flavanols and flavanols 3, 5 - 羟基 in anthocyanidins 6, 8 位易连接碳苷 4位有氧原子时，5位羟基极少成苷
糖 Glucose is the most commonly sugar
Galactose, rhamnose, xylose and arabinose are not uncommon
Mannose, fructose, glucuronic and galacturonic acids are rare
Lin, L.Z., et al., Chromatographic profiles and identification of new phenolic components of Ginkgo biloba leaves and selected products. J Agric Food Chem, 2008. 56(15): p. 6671-9.
黄酮骨架上结合位点的不同可能与其酶抑制活性、抗氧化活性有关。在Manach 的研 究中，大剂量 Quercetin 给以大鼠后，其甲基化代谢产物 Isorhamnetin 含量很高。而 已知Isorhamnetin对黄嘌呤氧化酶 的抑制能力强于Quercetin 。
黄酮类化合物的MS鉴定
电轰击（Electron impact，EI）质谱法
方 法 要 点： 1、大量的标准品； 2、正、负离子模式结合； 3、离子化过程的高、低两种电压； 4、样品加酸水解，黄酮苷发生水解反应； 5、样品热处理，丙二酸酯键裂解； 6、借助文献紫外数据等
缺点 1、大量的对照品； 2、仍有一些黄酮无法鉴定。
USDA Database for the Flavonoid Content of Selected Foods – 2003
1、LC-TSP-MS重现性较差，受溶剂成分、取样杆温度及离子源温度的影响； 2、软电离技术，在谱图中只有分子离子峰，碎片非常少； 3、对分析物要求有一定的极性，流动相中要有一定量的水，对热稳定性差的化 合物有明显的分解作用。
ESI 是LC-MS 最常用的方法离子源
LC-MS很少被用于对化合物的完全指认，而LC-MS/MS用于结构鉴定 结果更可靠！
对黄酮苷首先对样品进行甲基化、乙基化、三甲基硅烷化等衍生化操作。
化学电离（Chemical ionization，CI）质谱法
对黄酮苷的鉴定效果差。
场解析（Field desorption，FD）质谱法
快原子轰击（Fast atom bombardment，FAB）质谱法
LC-MS法鉴定黄酮
热喷雾（Thermospray ionization，TSP) 质谱
黄酮化合物对ESI负离子模式更敏感，但提供的结构信息较少，而正离 子模式提供更多结构信息，两种模式结合下有利于黄酮鉴定。
在0.5%甲酸做流动相改性剂可达到正离子模式下的最低检测限制，也有 人认为乙酸较甲酸能提高离子化效率。
色谱保留时间也提供一些结构信息，黄酮甲基化、糖苷化种类、位点、 数量影响其极性。黄酮苷较其苷元先被洗脱出；二糖苷较单糖苷先被洗脱出； 甲基化黄酮在色谱中保留时间较长。
DAD数据同样提供结构黄酮类别信息。
Sakakibara, H., et al., Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables, fruits, and teas. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003. 51(3): p. 571-581
The fragmentation of the [M-H]- ions proceeds differently starting with a preferential loss of the sugar unit at C-7.
Davis, B.D. and J.S. Brodbelt, Determination of the glycosylation site of flavonoid monoglucosides by metal complexation and tandem mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 2004. 15(9): p. 1287-1299.
CID mass spectra of kaempferol 3-O-glucosyl-glucoside 7-O-rhamnoside, MW 756
Negative mode 609
285
431
755
Product ion from [M-H]- ions – cone voltage 25 V and collision energy: 15, 20, 25 and 30 eV, registered with triple quadrupole analyzer
O
O
Isoflavones
O
OH O
Flavan-3, 4-diols
O C H
O
Aurones
三、黄酮的生物合成
3 mol 丙二酰辅酶A与1 mol 桂皮酰辅酶A合成。
R1 R2
7
R3
5
R4
R7
R6 2’
R8 4’
O
2
6’ R9
3 R10
4 R5
O
R取代基：H、OH、OCH3 以及糖类等
众多的取代位点、取代基团的存在使得黄酮类化合物成为一类种类繁多的化合物。
1、对心血管系统的作用 芦丁、橙皮苷 降低血管脆性及异常通透性； 芦丁、槲皮素 有明显扩冠作用等。
2、抗肝脏毒作用 水飞蓟素等治疗急、慢性肝炎，肝硬化，中毒性肝损伤等疾病。
3、抗炎作用 4、雌激素样作用
HO
O
HO
大豆素
O OH
5、抗菌、抗病毒作用
6、致泻作用
7、解痉作用
OH
己烯雌酚
机理：抗氧化活性！
HPLC profile for 28 different polyphenols on a C18 column.
Lin, L.Z., et al., LC-ESI-MS study of the flavonoid glycoside malonates of red clover (Trifolium pratense). J Agric Food Chem, 2000. 48(2): p. 354-65. 红三叶草
CID MS/MS spectra of kaempferol 3-O-rhamnosyl-glucosyl-glucoside 7-O-rhamnoside, MW 902
493
Positive mode
779 925
[M+Na]+ ions – cone voltage 25 V and collision energy 20 or 25 eV, registered with triple quadrupole analyzer