冷冻电镜简介
冷冻电镜观察蛋白颗粒
冷冻电镜，也称为冷冻电子显微镜或冷冻EM，是一种在低温下观察生物样品的技术。
它可以观察蛋白质颗粒和其他生物大分子，并提供了高分辨率的结构信息。
在冷冻电镜中，样品被迅速冷冻在低温下，以保持其自然状态。
然后，电子束被用来扫描样品，并收集散射的电子来生成图像。
由于电子束的波长比光波短得多，因此冷冻电镜可以提供更高的分辨率图像。
冷冻电镜在生物学研究中非常有用，因为它可以观察不稳定的、易变的或非常小的蛋白质颗粒。
这使得科学家能够更深入地了解蛋白质的结构和功能，进而了解生命的基本过程。
此外，冷冻电镜还可以与其他技术结合使用，例如单颗粒分析、冷冻电子断层扫描和微电子衍射等技术。
这些技术可以提供更多关于蛋白质结构和动力学的信息，有助于科学家更好地理解蛋白质的功能和作用机制。
总之，冷冻电镜是一种强大的技术，可以提供高分辨率的蛋白质结构和动力学信息，为生物学研究和药物设计提供了重要的工具。
冷冻电镜简介
1 冷冻电镜发展背景人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。
虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。
后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。
在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。
对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。
通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。
日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。
X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。
虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。
X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。
核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。
人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。
随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。
在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。
多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。
冷冻电镜
2、电子显微镜的原理？
电子的波长是光子波长的十万分之一左右，是一根极细的探针，理论上它 打在蛋白质分子这类生物大分子身上能被反射，这些反射的电子就能产生一张 照片，电子显微镜相当于是用电子替代光线来照射物体，由于电子的波长远低 于光波，它能够看到非常小尺度的结构。
冷冻电镜在2013年的技术革命
冷冻电镜的工作流程：
样品的制备 透射电子显微镜成像 结构解析
图像处理
图1 冷冻电子显微学解析结构基本步骤
冷冻电镜技术的操作过程：
1、样品的制备
• 用于冷冻电镜研究的生物大分子样品必须非常纯净。生物样品是在高 真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构，又 能抗脱水、电子辐射。 • 一种方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲 水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。该方法有 两个关键步骤：一是将样品在载网上形成一薄层水膜；二是将第一步 获得的含水薄膜样品快速冷冻。 • 另一种方法是通过喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），利用 结合底物混合冰冻技术(spray-freezing)，可以把两种溶液（如受体和 配体）在极短的时间内混合起来 (ms量级)，然后快速冷冻，将其固定 在某种反应中间状态，这样能对生物大分子在结合底物时或其他生化 反应中的快速的结构变化进行测定，深入了解生物大分子的功能。
冷冻电镜的发明及其在生物学的应用
报告人：XXX
冷冻电镜是什么？
冷冻电子显微镜技术（cryoelectron microscopy） 简称
冷冻电镜的原理及应用
冷冻电镜的原理及应用冷冻电镜（cryo-electron microscopy，简称cryo-EM）是一种利用冷冻技术对生物样品进行成像的高分辨率电镜技术。
它的原理是将生物样品在极低温下快速冷冻，形成冰冻膜，然后在真空环境下进行成像。
冷冻电镜具有成像分辨率高、样品无需染色等优点，因此在生物医学研究领域有着广泛的应用。
首先，冷冻电镜的原理是利用样品在极低温下形成冰冻膜后，通过电子束对样品进行成像。
冷冻膜的形成可以保持生物样品的天然结构，避免了传统电镜中样品染色和固化过程可能导致的伪装效应。
同时，冷冻电镜可以获得纳米级甚至次纳米级的成像分辨率，能够观察到生物样品的细微结构和分子间相互作用，为生物学研究提供了重要的信息。
其次，冷冻电镜在生物医学领域有着广泛的应用。
在细胞生物学研究中，冷冻电镜可以用于观察细胞器的结构和功能，揭示细胞内部的生物过程。
在生物医药研发中，冷冻电镜可以用于药物与蛋白质相互作用的研究，为新药研发提供重要依据。
在病毒学领域，冷冻电镜可以用于观察病毒颗粒的结构，为病毒防治提供重要信息。
此外，冷冻电镜的发展也为生物学研究提供了新的技术手段。
随着成像分辨率的不断提高，冷冻电镜已经成为研究生物分子结构的重要工具，为科学家们解开生命奥秘提供了强有力的支持。
同时，冷冻电镜的技术进步也为药物设计和疾病治疗提供了新的思路和方法。
综上所述，冷冻电镜作为一种高分辨率电镜技术，具有成像分辨率高、样品无需染色等优点，在生物医学研究领域有着广泛的应用。
其原理是利用样品在极低温下形成冰冻膜后，通过电子束对样品进行成像。
冷冻电镜的发展为生物学研究提供了新的技术手段，为科学家们解开生命奥秘提供了强有力的支持。
相信随着技术的不断进步，冷冻电镜在生物医学领域的应用将会更加广泛，为人类健康事业做出更大的贡献。
冷冻电镜表征
冷冻电镜表征
冷冻电镜（Cryo-Electron（Microscopy）是一种生物学中常用的高分辨率电子显微镜技术，它能够以冷冻的方式观察生物样品的高分辨率结构，特别是蛋白质和生物大分子的结构。
冷冻电镜表征通常包括以下步骤：
1.（样品制备：（样品制备是冷冻电镜表征的关键步骤。
生物样品需要以特殊的方式制备，以确保在电镜中保持其原始结构。
通常，样品会在非常低的温度下迅速冷冻，以保持生物分子在其自然状态下的结构。
2.（数据采集：（冷冻电镜利用电子束来照射样品，并记录样品散射电子的图像。
这些图像被捕获并记录下来，形成一系列2D图像。
这些图像需要在不同角度和方向上采集，以获取关于生物样品三维结构的信息。
3.（三维重建：（通过收集的2D图像，使用特定的计算机程序进行图像处理和三维重建。
这些程序能够处理大量的2D图像数据，并将其转换成高分辨率的三维结构模型。
4.（结构解析与分析：（得到的三维结构模型可以进一步用于分析生物样品的结构。
这包括分析蛋白质、细胞器或其他生物分子的形状、大小、构象等信息。
冷冻电镜表征因其能够在生物样品的原始状态下观察高分辨率结构而备受青睐。
它在生物医学研究、生物化学和药物研发等领域中发挥着重要作用，帮助科学家们理解生物分子的结构和功能。
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冷冻电镜——精选推荐
冷冻电镜研究进展冷冻电⼦显微镜技术（cryoelectron microscopy）是从20世纪70年代提出的，经过近10年的努⼒，在80年代趋于成熟。
它的研究对象⾮常⼴泛，包括病毒、膜蛋⽩、肌丝、蛋⽩质核苷酸复合体、亚细胞器等等。
⼀⽅⾯，冷冻电⼦显微镜技术所研究的⽣物样品既可以是具有⼆维晶体结构的，也可以是⾮晶体的；⽽且对于样品的分⼦量没有限制。
因此，⼤⼤突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究⼩分⼦量（⼩于100KDa）样品的限制。
另⼀⽅⾯，⽣物样品是通过快速冷冻的⽅法进⾏固定的，克服了因化学固定、染⾊、⾦属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的⽣活状态。
21世纪初，冷冻电⼦显微镜都具备⾃动图像采集系统。
CCD(charged-couple device)照相机能快速、动态的记录电⼦衍射图，但由于像素的限制，其分辨率不如照相胶⽚。
CCD和照相胶⽚所记录的是⽣物样品空间结构的⼆维投影，利⽤各种计算机软件程序包，可以从电镜的⼆维图像重构样品的三维结构，即三维重构。
已开发出许多软件程序包可供计算机处理使⽤，⼤⼤⽅便了⽣物样品的结构重构。
[1]操作步骤样品准备⽤于冷冻电镜研究的⽣物⼤分⼦样品必须⾮常纯净。
⽣物样品是在⾼真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本⾝的结构，⼜能抗脱⽔、电⼦辐射。
⼀种⽅法是通过快速冷冻使含⽔样品中的⽔处于玻璃态，也就是在亲⽔的⽀持膜上将含⽔样品包埋在⼀层较样品略⾼的薄冰内。
该⽅法有两个关键步骤：⼀是将样品在载⽹上形成⼀薄层⽔膜；⼆是将第⼀步获得的含⽔薄膜样品快速冷冻。
在多数情况下，⽤⼿⼯将载⽹迅速浸⼊液氮内可使⽔冷冻成为玻璃态。
其优点在于将样品保持在接近“⽣活”状态，不会因脱⽔⽽变形；减少辐射损伤；⽽且通过快速冷冻捕捉不同状态下的分⼦结构信息，了解分⼦功能循环中的构象变化。
另⼀种⽅法是通过喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），利⽤结合底物混合冰冻技术 (spray-freezing)，可以把两种溶液（如受体和配体）在极短的时间内混合起来 (ms量级)，然后快速冷冻，将其固定在某种反应中间状态，这样能对⽣物⼤分⼦在结合底物时或其他⽣化反应中的快速的结构变化进⾏测定，深⼊了解⽣物⼤分⼦的功能。
冷冻电镜 蛋白质结构
冷冻电镜蛋白质结构1 冷冻电镜冷冻电镜是物理学和生物学研究 processe 的一个重要手段，它可以提供准确的原子水平的结构信息，使我们了解更多的蛋白质的结构和功能。
冷冻电镜是一种利用蛋白质在极端条件下沉积后保持其原始结构的一种技术，可以高分辨率地检测蛋白质的结构，该方法可以解决蛋白质易溶和不可性质，它采用的方法是在极端温度下形成的蛋白质的冷冻电镜模型，其独特的工艺和步骤操作可以为研究基础过程和结构提供重要的细节数据。
2 冷冻电镜的用途和步骤冷冻电镜可以获得蛋白质的原子结构信息，分析其结构和功能机制，协助我们更深入地理解其生物学功能。
这是一种特殊的显微技术，利用超过50keV的电子束来检测蛋白质的结构。
整个处理过程包括：连续扫描技术，密度法来表征氢键簇的分布，形成的蛋白质的三维模型的定量和质量，检测亚细胞结构和蛋白质的连接状态等。
3 冷冻电镜的优势冷冻电镜技术也有一些优点，它可以快速获得细胞内和细胞外环境中稳定性空间结构的信息，可以确定蛋白质的空间结构，为蛋白质结构和功能机制研究提供空间信息。
另外，它可以模拟很多蛋白质极端环境下的结构，例如高压，低温等，这种技术可以提供准确的有序结构的蛋白质的定量数据，学术界对它的重要性也非常看重。
4 结论由于冷冻电镜技术的优势，它被广泛应用于蛋白质的结构和功能机制的研究。
此外，随着技术的发展和进步，它也可以检测更复杂的蛋白质结构和功能。
可以预料，今后冷冻电镜技术在蛋白质研究中还将发挥重要作用，它将推动人们深入到蛋白质结构和功能了解更多深层次的细节信息，有助于更好地理解与治疗许多疾病，也有助于我们认识自然界的奥秘。
冷冻电镜在生物学领域的应用
冷冻电镜在生物学领域的应用近年来，随着生物学领域的不断发展，科学家们对生物细胞及分子结构的研究越发深入。
而冷冻电镜技术作为重要的高分辨率成像技术之一，近年来也得到了广泛应用，成为生物学研究领域中的重要手段之一。
一、冷冻电镜的简介冷冻电镜技术是指将活体样品通过快速冷冻的方式，制成超薄冰冻切片，并利用电子显微镜进行成像而获得的高分辨率结构信息。
相较于传统离体固定、染色加工的样品，冷冻技术可以避免细胞失真、退化等变化，同时也能有效保持样品中分子结构的活性特性。
二、冷冻电镜在生物学领域的应用1.细胞器结构研究生物细胞中的各种细胞器，是细胞功能的基本单位。
而利用冷冻电镜技术，可以对细胞器进行高分辨率的显微图像拍摄，更好地了解它们的形态、位置及其功能。
例如，研究人员通过冷冻电镜分析得知囊泡的形态和分布位置，进一步探究了细胞内部的物质传输等细胞学现象，有助于探索生物学的奥秘。
2.蛋白质相互作用研究蛋白质是生物体内最基本的结构和功能单元，在多种生物学结构和过程中起着关键作用。
近年来，研究人员利用冷冻电镜技术，成功利用蛋白质的超分子结构和含量信息，探究了许多蛋白质质量的变化与功能性的内部调整过程。
这有助于更好地了解蛋白质的生物活性和分子机制，从而为生物医学研究提供更好的理论基础。
3.细菌微生物学研究细菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，由于其小、形态多样，研究其结构及功能有一定困难。
而冷冻电镜技术可以在样本真实环境中进行成像，有效还原并解析细菌的分子结构，同时也能对其进行分类和功能分析。
这样，研究人员可以利用高分辨率的成像，更好地认识细菌及其功能，并且为细菌类疾病的研究提供理论支持。
三、冷冻电镜技术面临的挑战和应对策略尽管冷冻电镜技术在生物学领域的应用受到了广泛认可，但是它的成本和技术难度较高，且需要一定量的样本，主要限制了其应用范围和实用性。
针对这些限制，还需针对性地进行技术改进。
例如，采用集束误差校正技术、自适应信噪比增强等，大幅提升成像质量和分辨率，使得冷冻电镜技术更好地服务于生物学的理论研究和实践应用。
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1 冷冻电镜发展背景人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。
虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。
后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。
在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。
对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。
通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。
日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。
X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。
虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。
X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。
核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。
人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。
随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。
在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。
多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。
近年来，由于快速冷冻和低温冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微学技术的诞生。
冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视，逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。
2 冷冻电镜发展过程及分类2.1 冷冻电镜发展过程冷冻电子显微镜技术（cryo-electron microscopy）是在20世纪70年代提出的，早在20世纪70年代科学家们就利用冷冻电镜研究病毒分子的结构，首次提出了冷冻电镜技术的原理、方法以及流程的概念。
到了20世纪90年代，随着冷冻传输装置、场发射电子枪以及CDD成像装置的出现，冷冻电镜单颗粒技术出现。
21世纪初，冷冻电镜技术进一步发展，利用三维重构技术获得了二十面体病毒的三维结构，但此时冷冻电镜的分辨率水平依然没有得到突破，这限制了冷冻电镜在生物大分子领域的应用，虽然冷冻电镜和X射线晶体学、核磁共振被称作结构生物学研究的三大利器，但不得不承认冷冻电镜是三者当中最弱的一种技术手段，在现在已解析的一千多种膜蛋白结构当中，90%以上都采用的是X射线晶体学方法，核磁共振在小分子量的蛋白结构解析中也发挥了重要的作用，而冷冻电镜在蛋白结构解析当中所起的作用微乎其微。
然而2013年12月5日，美国加州大学旧金山分校副教授程亦凡与同事David Julius两个实验室合作，采用单电子计数探测器，以近原子分辨率（3.4埃），确定了在疼痛和热知觉中起中心作用的一种膜蛋白TRPV1的结构，这一振奋人心的成果让研究人员们开始重新审视冷冻电镜在结构生物学研究中的所能发挥的作用。
毕竟和X射线晶体学方法相比，它所需的样品量很少，也无需生成晶体，这对于一些难结晶的蛋白质的研究带来了新的希望。
蛋白质TRPV1结构的确定标志着冷冻电镜正式跨入“原子分辨率”时代。
2.2 冷冻电镜分类目前我们讨论的冷冻电镜基本上指的都是冷冻透射电子显微镜，但是如果我们以使用冷冻技术的角度定义冷冻电镜的话，冷冻电镜主要可以分为冷冻透射电子显微镜、冷冻扫描电子显微镜、冷冻蚀刻电子显微镜。
2.2.1 冷冻透射电子显微镜冷冻透射电镜（Cryo-TEM）通常是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，将样品冷却到液氮温度（77K），用于观测蛋白、生物切片等对温度敏感的样品。
通过对样品的冷冻，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。
一台冷冻透射电镜的价格在600万美元左右，价格极其昂贵，它的优点主要体现在以下几个方面：第一是加速电压高，电子能穿透厚样品；第二是透镜多，光学性能好；第三是样品台稳定；第四是全自动，自动换液氮，自动换样品，自动维持清洁。
图2.1 冷冻透射电镜及冷冻电镜下高分辨病毒的三维重构图2.2.2 冷冻扫描电子显微镜扫描电镜工作者都面临着一个不能回避的事实，就是所有生命科学以及许多材料科学的样品都含有液体成分。
很多动植物组织的含水量达到98%，这是扫描电镜工作者最难对付的样品问题。
冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）技术是克服样品含水问题的一个快速、可靠和有效的方法。
这种技术还被广泛地用于观察一些“困难”样品，如那些对电子束敏感的具有不稳定性的样品。
各种高压模式如VP、LV和ESEM的出现，已允许扫描电镜观察未经冷冻和干燥的样品。
但是，冷冻扫描电镜仍然是防止样品丢失水分的最有效方法，它能应用于任何真空状态，包括装于SEM的Peltier台以及向样品室内冲以水汽的装置。
冷冻扫描电镜还有一些其他优点，如具有冷冻断裂的能力以及可以通过控制样品升华刻蚀来选择性地去除表面水分（冰）等。
冷冻电镜基本的观测流程如下图2.2所示：图2.2 低温扫描电镜样品制备及观测流程2.2.3 冷冻蚀刻电子显微镜冷冻蚀刻（Freeze-etching）电镜技术是从50年代开始发展起来的一种将断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，亦称冷冻断裂（Freeze-fracture）或冷冻复型（Freeze-replica），用于细胞生物学等领域的显微结构研究。
冷冻蚀刻电镜的优点：①样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态；②样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构；③冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存。
缺点：冷冻也可造成样品的人为损伤；断裂面多产生在样品结构最脆弱的部位，无法有目的地选择。
目前，冷冻蚀刻装置的型号很多，但主要分为两种类型：一种是专用冷冻蚀刻装置，如EIKO公司生产的FD-2A型、FD-3型，BALZERS公司生产的BAF300型；另一种是真空喷镀仪的冷冻蚀刻附件，如日立公司生产的HFZ-1型，它与FE-1型加温蚀刻装置一起安装在HUS-5型真空喷镀仪中使用。
以上两种类型各有优缺点，专用装置优点在于操作方便，能连续制样，效率高。
缺点是价格贵；附件装置价格虽便宜，但不能连续操作，效率低。
利用冷冻蚀刻电镜技术观察到的红细胞如图2.3所示。
图2.3 红细胞冷冻电镜蚀刻图3 冷冻电镜原理冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像，其基本过程包括样品制备、透射电子显微镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤（图3.1）。
在透射电子显微镜成像中，电子枪产生的电子在高压电场中被加速至亚光速并在高真空的显微镜内部运动，根据高速运动的电子在磁场中发生偏转的原理，透射电子显微镜中的一系列电磁透镜对电子进行汇聚，并对穿透样品过程中与样品发生相互作用的电子进行聚焦成像以及放大，最后在记录介质上形成样品放大几千倍至几十万倍的图像，利用计算机对这些放大的图像进行处理分析即可获得样品的精细结构。
图3.1 冷冻电子显微学解析结构基本步骤图3.2 冷冻电子显微学原理示意图透射电子显微镜成像过程中，电子束穿透样品，将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。
1968 年，Aron Klug发现中心截面定理（图3.3），提出可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。
根据这一原理，利用透射电子显微镜获得生物样品多个角度的放大电子显微图像，即有可能在计算机里重构出它的三维空间结构。
图3.3 中心截面定理在冷冻电子显微学结构解析的具体实践中，依据不同生物样品的性质及特点，可以采取不同的显微镜成像及三维重构方法。
目前主要使用的几种冷冻电子显微学结构解析方法包括：电子晶体学、单颗粒重构技术、电子断层扫描重构技术等，它们分别针对不同的生物大分子复合体及亚细胞结构进行解析。
3.1 电子晶体学利用电子显微镜对生物大分子在一维、二维以致三维空间形成的高度有序重复排列的结构（晶体）成像或者收集衍射图样，进而解析这些生物大分子的结构，这种方法称为电子晶体学。
其适合的样品分子量范围为10~500kD，最高分辨率约1.9Å。
该方法与X射线晶体学的类似之处在于均需获得高度均一的生物大分子的周期性排列，不同之处是利用电子显微镜除了可以获得晶体的电子衍射外还可以通过获得晶体的图像来进行结构解析。
3.2 单颗粒技术对分散分布的生物大分子分别成像，基于分子结构同一性的假设，对多个图像进行统计分析，并通过对正、加和平均等图像操作手段提高信噪比，进一步确认二维图像之间的空间投影关系后经过三维重构获得生物大分子的三维结构方法（图3.4）。
其适合的样品分子量范围为80~50MD，最高分辨率约3Å。
利用单颗粒技术获得三维重构的方法主要包括等价线方法、随机圆锥重构法、随机初始模型迭代收敛重构等方法，其基本目标是获得二维图像之间正确的空间投影关系，从而进行三维重构。
图3.4 单颗粒重构技术原理3.3 电子断层扫描成像技术通过在显微镜内倾转样品从而收集样品多角度的电子显微图像并对这些电子显微图像根据倾转几何关系进行重构的方法称为电子断层扫描成像技术（图3.5）。
该方法主要应用精品文档，超值下载于细胞及亚细胞器，以及没有固定结构的生物大分子复合物（分子量范围为800kD），最高分辨率约20Å。
图3.5 电子断层扫描成像技术原理。