大肠菌群检测过程中可能遇到的常见问题及解答
大肠菌群检验中需注意的要点
大肠菌群检验中需注意的要点母永贵（米易县疾病预防控制中心；四川攀枝花617200）一、什么是大肠菌群？大肠菌群是指某些特性相同的细菌，并不代表某一个或者某一属细菌，主要是在需氧和兼性厌氧的情况下，可以分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群的分布较广，主要来源人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有污染肠道致病菌可能。
所以对于大肠菌群的检查是使用频繁的检查项目，只有在检查过程中通过对可以避免的操作或者结果进行分析和反复的检查，可以有效的提高大肠菌群的检出率，提高检查结果的有效性。
二、大肠菌群检验中需要注意的问题？大肠菌群的检查是临床中常见的实验室检查的一项常规内容，由于一些操作或者其他方面的影响很有可能导致检查结果的误差，从而出现检查结果的不准确。
所以在进行大肠菌群检验中一定要注意以下几个问题：（1）实验材料的选择：在对大肠菌群检查时，可选取糕点类或者肉类食品。
（2）抑菌剂的使用：通常在对大肠菌群检查时，对培养基中会加入一些抑菌剂，来抑制其他病原菌，但是抑菌剂中可能会对大肠菌群中的某些菌群起到轻微的抑制作用，从而导致检查结果的误差。
（3）稀释程度：由于要求对样本进行不同程度的稀释，但是很有可能因为稀释的程度而导致检测结果的偏差，从而降低检查结果的可靠性。
所以对于不同的样本在选择稀释程度时一定要选用最佳的稀释程度，避免结果的偏差。
（4）初步发酵：临床中对大肠菌群的定义是在37℃分解乳糖产酸产气，所以在初步发酵时，可以进行适当的延长培养时间，有助于大肠菌群细菌的复活和增殖，提高大肠菌群的检出率。
（5）挑选菌落：由于大肠菌群是一大类菌群的总称，在平板上呈现出不同的形态和特点，要选择典型的菌落进行检查，避免结果假阳性的出现，提高检出率。
（6）产酸产气情况：大肠杆菌可以分解乳糖产酸产气，往往在检测过程中着重于观察菌群发酵产气的情况。
由于不同的菌群其产气的能力不同，加上由于在筛选过程中，样本中所存留的大肠菌群数量的不足，很有可能在发酵初期，出现较小的气泡，但是大多数发酵管可以充满气体。
浅谈食品中大肠菌群和菌落总数检测的几个操作规范要点
浅谈食品中大肠菌群和菌落总数检测的几个操作规范要点浅谈食品中大肠菌群和菌落总数检测的几个操作规范要点摘要：本文介绍了食品中大肠菌群和菌落总数的检验中容易不规范操作的几个方面，并针对性地提出解决办法。
关键词：食品大肠菌群菌落总数检测规范前言目前，食品大肠菌群与菌落总数的检测标准主要是采用GB/T4789.3-2003食品卫生微生物学检验大肠菌群测定[1]、GB4789.3-2010食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数[2]、GB4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[3]这三个国家标准。
但是目前国家标准只给出了实验的基本操作步骤及计算方法，而在实际的检验工作中，还存在一些影响操作可靠性的因素并未给出说明。
本文结合笔者自身检验经验，对大肠菌群与菌落总数的检测过程中易发生不规范操作的部分做出强调，以期对每个检验环节精确控制，以获得稳定可信的检验结果。
一、大肠菌群测定的一些要点：大肠菌群的发酵试验中要用到小倒管，主要用来观察气泡的出现。
但是实验中经常会出现还未接种样液，小倒管内就出现气泡，这样会影响结果的判断。
现列举出出现这种现象的几种原因及对策：1.小倒管的口太小。
在灭菌过程中，高压会将培养基压进小倒管，使空气排出，但如果小倒管开口过小，空气不容易出来，培养基也不容易进去，容易导致气泡残留在管内影响观察，若是这种情况，可以改用开口较大的V形管代替。
2.小倒管里面残留有水珠。
因为小倒管开口很小，清洗后内部的水不容易干燥完全。
这样会导致灭菌过程中培养基无法进去，使用时要注意放置小倒管前要将其内部的水甩干。
3.硅胶塞将试管口塞得过紧。
硅胶塞将试管口塞得过紧，会使在灭菌过程中试管内外的压力不一致，灭菌锅升温升压时，锅内压力大于试管内压力，压力不够将培养基完全压进小倒管，于是就会残留气泡。
塞子过紧还易导致灭菌锅降温时，锅内压力小于试管内压力，容易使试管内培养基喷出，培养基报废。
大肠菌群
灭菌后小导管内留有气泡的原因分析及其解决办法大肠菌群（大肠杆菌）检测实验培养基（LST）灭菌时，偶尔会有小气泡留在小导管内，导致培养基不能使用。
重复灭菌不仅费时费电，还会破坏培养基的成分。
为了避免问题的发生，本人根据实验经验和严密思考做出几种原因分析，并给予解决的办法。
**原因一：过早打开灭菌锅当灭菌锅压力表示数为0而温度表示数还高与室温时，不要打开灭菌锅。
因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低，试管内温度也随着降低，导致管内气减小，沸点降低，部分水会汽化留在小导管内。
解决办法：等灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。
**原因二：试管塞塞得太紧（使用硅胶塞的时候）试管塞塞得太紧在灭菌时会导致试管内与灭菌锅内压力不一致。
在灭菌锅升温升压时，锅内压力会大于管内压力；灭菌锅降温降压时，锅内压力小于管内压力。
锅内压力会大于管内压力时，试管内压力不够，不能将小导管内气体排尽，就留有气泡；锅内压力小于管内压力时，可能会使试管塞和培养基崩出，培养基报废。
解决办法：改用透气性好的棉花塞，切勿使用橡皮塞。
*原因三：小导管口太小我们可以把一根毛细管一端封口，另一端插进水里，毛细管里怎么都不会进水。
同样把一个烧杯倒扣进水里就很容易进水了。
小导管在加压后一方面水要进去，另外里面的空气要出来，如果口太小的话，空气不容易出去，水也不容易进来，就会导致气泡六在里面了。
解决办法：改用内空较大的导管，尽量使用V型管，不要使用锥型管。
原因四：培养基质量引起由培养基质量引起的气体不能排尽或培养基含有高温高压分解产气的成分。
灭菌时用水做培养基组的对照试验，若培养基组有气泡，而对照组没有气泡，可确定是有此原因引起。
解决办法：改用其它培养基。
原因五：灭菌锅工作压力不够，使气体不能排尽灭菌锅最大压力不够不能使管内液体强行把气体挤出，最后还留有小气泡，还会使温度上升缓慢，或达不到灭菌温度。
此原因的可能性较小，我们可以在排除原因一、二、三、四的情况下，用不加试管塞、大口导管做试验，若还仍不能达到效果，就要检查灭菌锅了。
菌落总数及大肠菌群检验中的注意事项
菌落总数及大肠菌群检验中的注意事项作者：李银花来源：《幸福家庭》2020年第10期菌落总数可以反映食品、饮用水等受到污染的程度。
大肠菌群则是一类与粪便污染有关的细菌。
食品安全卫生管理中，菌落总数、大肠菌群均是重要的参考指标，通过对食品中菌落总数、大肠菌群的及时检验，可为食品安全管理提供依据。
本文介绍菌落总数及大肠菌群在检验中需要注意的事项。
菌落总数、大肠菌群检验结果的准确性会受到检验方法的影响，合理选择检验方法至关重要。
目前菌落总数检验方面，如果是生活饮用水检验，需要参照GB/T 5750.12-2006;食品检验需要参照GB 4789.2-2016。
两种方法最大的不同是培养基。
生活饮用水菌落总数检验方法中的培养基为营养琼脂（NA），食品菌落总数检验中使用平板计数琼脂（PCA）。
其中NA对细菌培养更有利，且可避免细菌成片状生长。
饮用水菌落总数检验如果选择PCA，测定结果可能会偏高，导致合格饮用水结果误判。
大腸菌群的检测有MPN法与平板法两种。
其中MPN法为半定量计数，如果食品中大肠菌群含量较低，可选择该方法。
而大肠菌群较多的食品则可选择平板法，该方法是定量计数法。
通常情况下限度单位是确定选择哪种方法的依据，如单位为MPN/g或MPN/mL，应使用MPN法;如果单位是CFU/g或CFU/mL，此时可选择平板法。
部分特殊食品需要使用其他大肠菌群检验方法，如酱油、醋等虽然限度单位要求为MPN/100mL或MPN/100g，但是不能选择上述方法，而应该参照GB/T 4789.3-2003。
菌落总数以及大肠菌群检验还需要减少环境引起的污染问题。
因此，在检验中，检验人员需要保证样品在洁净区处理，检验中接触到的不同仪器、器具等需要做好消毒灭菌工作。
比如可将检验需要使用的金属取样工具、玻璃培养皿、刻度吸管等置入不锈钢消毒桶中，通过热空气消毒箱予以消毒;如果是培养基、生理盐水等含水物品，可应用湿热灭菌处理。
取样前保证样品包装处于密封状态。
【微生物】大肠菌群检验及注意事项
【微生物】大肠菌群检验及注意事项！大肠菌群介绍大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。
调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。
粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
大肠菌群检验方法由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。
目前国内采用的食品大肠菌群检测方法主要有国家食品药品监督管理总局发布的国家标准和国家质量监督检验检疫总局颁布的进出口行业标准。
两个标准方法在检测程序上略有不同。
但两种方法都是采用推测、验证两大步骤。
推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。
36±1℃培养48±2h，观察是否产气。
大肠菌群平板计数实验失败总结
大肠菌群平板计数实验失败总结
本次实验失败有很多原因，个人总结如下:
1.实验预习不足，没有充分考虑实验细节带来的影响
例如，试样虽然一半浸在液体中，但是没有考虑液体蒸发带来的平面下降，导致后来实验中途更改方案，使得最后匆忙结束实验。
事实上，如果当时中途不更改，也会导致实验失败，所以还是没考虑周全，86℃的水温，最后差不多蒸发了一半！
2.小组分工不明确
我只顾着自己实验，没有安排好小组分工。
如果小组中有不太熟练的同学，可以安排他做一些简单的工作，例如试样的表面处理，如果他没做好，到时候我还能检查。
我觉得这个问题在我小组比较严重。
3.实验过程中图快，没有细心考虑
这个问题是我的大问题。
每次实验中老是会忘记这一点。
而且我觉得应该养成实验中随手记录的好习惯，这样回头检查/反思的时候思路清晰。
但是我还是学会了很多知识，大肠菌群是食品污染程度的重要参数指标，是反应食品质量的必测项目，因此，很好地掌握其检测方法以及在检测全过程中的常见问题及解决办法是每一个食品检测人都应该具备的技能。
这次大肠菌群平板计数实验失败了，我挺难受的，做了一天，
一场空。
但是我觉得我应该要总结这次教训，下次实验绝不会再犯这样的错误了！。
大肠菌群试纸片常见问题
大肠菌群试纸片常见问题
1、因菌群计数时所需要的实验器材均需要灭菌处理，且多为一次性耗材，各类耗材均需要灭菌处理。
需要列出器材清单以免遗漏。
常用器材：1ml吸头、离心管、架子、移液器、剪刀、镊子、样本、匀浆袋子、生理盐水或缓冲液、试纸片、废液缸。
2、移液器等不能高压灭菌的切菜需要酒精擦拭，后紫外杀菌20min。
3、菌群稀释需要换枪头反复吸打，菌体在稀释液中诚块状会影响计数结果，必须充分混匀，而枪头附着的菌体对计数结果有很大影响，建议一次一换。
整体偏高。
4、移液器放置喷枪（液体与枪身接触），一旦发生及时用酒精擦拭，重新紫外灭菌或更换移液器继续实验。
否则会严重影响实验结果。
整体偏高。
5、在做国标法与试纸片法比对中，切记选择稳定期初期或者对数期的菌液，否则会影响结果。
致使试纸片的计数结果低于国标法的计数结果。
国标法培养基营养物质高于试纸片，使得部分近死亡的菌株可在国标法的培养平板上生长而不能再试纸片上生长，这是造成偏差的一大原因。
大肠菌群平板计数法的注意事项
大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要求检测的项目。
在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠菌群平板计数法的注意事项。
方法选择相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。
但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。
但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。
假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。
若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标此处不再赘述。
因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。
培养基的要求平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。
无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min 即可使用。
特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。
大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。
当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。
另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。
但值得注意的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。
稀释度的确定国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。
大肠菌群检测操作规范培训
详细描述
采样时，应选取有代表性的样品，如选取多个部位、多种类 型的食物进行采样。同时，采样工具应清洁无菌，避免交叉 污染。
试剂污染或失效
总结词
试剂是进行大肠菌群检测的必要物质，其质量和有效性对检测结果有很大影响。
详细描述
试剂应存放在阴凉、干燥、避光的地方，并在规定的有效期内使用。使用前应检 查试剂是否过期或变质。
确保检测设备齐全、功能 正常，校准合格证在有效 期内。
设备清洗
使用无菌棉球或纱布蘸取 75%乙醇或无水乙醇，擦 拭设备表面和内部，干燥 后进行下一步操作。
设备校准
根据设备说明书进行校准 ，确保检测结果的准确性 。
试剂配制与储存
试剂清单
列出所需试剂的名称、规格和数量，并核对试剂 的有效期。
配制方法
按照试剂说明书进行配制，注意配制环境和卫生 条件。
需根据菌落形态、革兰氏染色和生化反应等指标综合判断，以确定是否存在大肠菌 群。
在进行菌落计数时，需遵循无菌操作原则，并对各个稀释度的平板进行计数，以计 算出每克或每毫升样品中的大肠菌群数。
结果报告内容与格式
报告中需包含样品名称、来源、 检测日期、检测方法等信息。
应提供每个稀释度平板上的菌落 数及计算得出的大肠菌群数。
根据检测结果，给出样品是否符 合国家或行业标准的判定结论。
结果审核与确认
对检测结果进行审核，确保数 据的准确性和可靠性。
如发现异常数据或疑问，需要 进行复检或重新实验以确认结 果。
审核无误后，由检测人员签署 报告，并报送相关部门或客户 。
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常见问题与解决方案
关于粪大肠菌群等检出限及结果报出问题的回复
关于粪大肠菌群等检出限及结果报出问题的回复摘要：一、背景介绍1.粪大肠菌群检测的重要性2.我国相关检测标准的现状二、粪大肠菌群等检出限及结果报出问题的具体分析1.检出限的定义及作用2.结果报出问题的类型及原因3.对检测结果的影响三、针对问题的解决建议1.提高检测技术水平2.完善标准规范3.加强实验室管理4.提高检测人员素质四、总结1.问题解决的意义2.展望未来粪大肠菌群检测的发展正文：一、背景介绍粪大肠菌群检测是衡量环境污染和肠道疾病传播风险的重要手段。
在我国，粪大肠菌群检测已广泛应用于饮用水的监测、食品卫生监督、环境卫生评价等多个领域。
然而，在实际操作过程中，粪大肠菌群等检出限及结果报出问题时常出现，影响了检测结果的准确性和可靠性。
二、粪大肠菌群等检出限及结果报出问题的具体分析1.检出限的定义及作用检出限是指在特定条件下，能够被可靠地检测出的最小浓度。
对于粪大肠菌群检测而言，检出限的高低直接关系到检测结果的准确性和灵敏度。
过高的检出限可能导致实际污染状况被低估，而过低的检出限则可能引发假阳性结果，对检测结果产生误导。
2.结果报出问题的类型及原因在粪大肠菌群检测过程中，结果报出问题主要包括数据处理错误、仪器设备故障、实验操作不规范等。
其中，实验操作不规范是导致结果报出问题的主要原因，如样本处理不当、培养条件设置不合理等。
3.对检测结果的影响粪大肠菌群等检出限及结果报出问题可能导致检测结果与实际污染状况不符，进而影响相关决策的制定。
例如，在饮用水监测中，若检出限设置过高，可能导致水源地保护措施不足，进而影响水质安全。
三、针对问题的解决建议1.提高检测技术水平加强实验室检测技术的培训和交流，提高检测人员对新技术、新方法的掌握程度，以提高检测结果的准确性和可靠性。
2.完善标准规范修订和完善粪大肠菌群检测相关标准，明确检出限的设置原则和方法，确保检测结果的科学性和合理性。
3.加强实验室管理建立健全实验室质量管理体系，加强对仪器设备、实验材料和实验过程的监管，确保检测结果的准确性和可靠性。
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大肠菌群检测过程中可能遇到的常见问题及解答一、常用检测标准GB/T 4789.3-2003 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定GB 4789.3-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数GB 4789.28-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB 4789.1-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验总则GB 4789.41-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆科检验GB/T 27405-2008 实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T 16294-2010 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法二、常见问题及解答（一）检测方法选择Q1：食品中大肠菌群的检测有两个标准三种方法，该如何选择呢？A：依据产品标准的项目单位1、若单位为CFU/g，则选择GB 4789.3-2016第二法（平板计数法）。
如：GB 19300-2014 食品安全国家标准坚果与籽类食品；2、若单位为MPN/g，则选择GB 4789.3-2016第一法（MPN计数法）。
如：NY/T 1885-2017 绿色食品米酒；3、若单位为MPN/100g，则选择GB/T 4789.3-2003。
如：Q/KSJ0001S-2018 果蔬脆片。
Q2：MPN法3个适宜的连续稀释度该怎样选择？A：依据产品标准的项目标准值1、若标准值为＜3.0MPN/g，则选择0.1g、0.01g、0.001g三个稀释度。
如：NY/T 1885-2017 绿色食品米酒；2、若标准值为≤30MPN/100g，则选择1g、0.1g、0.01g三个稀释度。
如：Q/KSJ0001S-2018 果蔬脆片。
1g由接种10mL 0.1g/m L至双料乳糖胆盐发酵管得来。
（二）样品采样方法Q3：怎样采样，才能使样品具有代表性？A：这里将样品分为两类：预包装食品和散装食品或现场制作食品。
1、对于预包装食品A、应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品，每件样品的采样量应满足微生物项目检验的要求。
B、独立包装≤1000g 的固态食品或≤1000mL 的液态食品，取相同批次的包装。
C、独立包装＞1000mL 的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后采集适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品；＞1000g 的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内作为一件食品样品。
2、对于散装食品或现场制作食品用无菌采样工具从n 个不同部位现场采集样品，放入n 个无菌采样容器内作为n 件食品样品。
每件样品的采样量应满足微生物项目检验单位的要求。
（三）物资准备Q4：结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）使用前不需要高压灭菌，是否会存在污染的可能？A：大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以不会从培养基带入污染。
当然盛装培养基的容器需要进行高压灭菌，以免容器引入污染。
此外，VRBA是一种选择性培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵验证，因此VRBA培养基就无需高压灭菌。
但需要注意的是，VRBA需要现配现用，完成配制的培养基应当在3h之内使用完毕。
Q5：MPN管灭菌后为什么小导管内会有气泡以及该如何解决？A：原因一：过早打开灭菌锅当灭菌锅压力表降为0而温度表示数还高于室温时，不要打开灭菌锅。
因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低，试管内温度也随着降低，导致管内气压减小，沸点降低，部分水会汽化留在小导管内。
解决措施：待灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。
原因二：试管塞塞得太紧（使用硅胶塞的时候）试管塞塞得太紧在灭菌时会导致试管内与灭菌锅内压力不一致。
在灭菌锅升温升压时，锅内压力会大于管内压力。
锅内压力会大于管内压力时，试管内压力不够，不能将小导管内气体排尽，就留有气泡；试管塞塞得太紧同样会导致灭菌锅降温降压时，锅内压力小于管内压力。
锅内压力小于管内压力时，可能会使试管塞和培养基崩出，培养基报废。
解决措施：改用透气性好的棉花塞，切勿使用橡皮塞。
原因三：小导管口径太小我们把一根毛细管一端封口，另一端插进水里，毛细管里怎么都不会进水。
同样把一个烧杯倒扣进水里就很容易进水了。
小导管在加压后一方面水要进去，另外里面的空气要出来，如果口太小的话，空气不容易出去，水也不容易进来，就会导致气泡留在里面。
解决措施：改用内径较大的导管，尽量使用V型管，不要使用锥型管。
原因四：培养基质量问题由培养基质量引起的气体不能排尽或培养基含有高温高压分解产气的成分。
灭菌时用水做培养基组的对照试验，若培养基组有气泡，而对照组没有气泡，可确定是有此原因引起。
解决措施：改用其它品牌的培养基，且培养基使用前要通过技术验收。
原因五：灭菌锅工作压力不够，使气体不能排尽灭菌锅最大压力不够不能使管内液体强行把气体挤出，最后会留有小气泡。
灭菌锅工作压力不够还会使温度上升缓慢，或达不到灭菌温度。
此原因的可能性较小，我们可以在排除原因一、二、三、四的情况下，用不加试管塞、大口导管做试验，若还仍不能达到效果，就需要检查灭菌锅了。
解决措施：检修灭菌锅，且定期用压力蒸汽灭菌生物指示剂监测灭菌效果。
Q6：培养基的不正确配制会出现哪些异常现象以及可能的原因？A：异常现象一：培养基不凝固原因分析：①制备过程中过度加热；①低pH造成培养基酸解；①称量不正确；①琼脂未完全溶解；①培养基成分未充分混匀。
异常现象二：pH不正确原因分析：①制备过程中过度加热；①水质不佳；①外部化学物质污染；①测定pH时温度不正确；①pH计未正确校准；①脱水培养基质量差。
异常现象三：颜色异常原因分析：①制备过程中过度加热；①水质不佳；①pH不正确；①外来污染；①脱水培养基质量差。
异常现象四：产生沉淀原因分析：①制备过程中过度加热；①水质不佳；①脱水培养基质量差；①pH计未正确控制；异常现象五：培养基出现抑制/低的生长率原因分析：①制备过程中过度加热；①脱水培养基质量差；①水质不佳；①使用成分不正确，如：成分称量不准，添加剂浓度不正确；①制备容器或水中的有毒残留物。
异常现象六：选择性差原因分析：①制备过程中过度加热；①脱水培养基质量差；①配方使用不对；①添加成分的加入不正确，例如加入添加成分时培养基过热或添加浓度错误；添加剂污染。
异常现象七：污染原因分析：①不适当的灭菌；①无菌操作技术存在问题；①添加剂污染。
（四）实验过程Q7：2016版平板法VRBA倾注完，待琼脂凝固后为什么需要加3-4mL的覆盖层？A：因为大肠菌群是需氧及兼性厌氧的，再加一层琼脂相当于造就一个半厌氧环境，促进兼性厌氧菌的生长，同时抑制其他菌的生长。
除此之外，还有防止菌落蔓延的作用，防止迁徙性菌落对菌落计数构成影响。
例如一些变形杆菌就会有迁徙现象，从而导致菌落长成一片无法区分。
在表面多覆盖一层培养基就可以避免这种情况的发生。
Q8：实验过程中可以引入哪些质量控制，证明此次实验结果有效？A：1、实验过程中，每批次样品均要做空白对照。
若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
需从稀释液、吸管、平皿、培养基和实验环境等进行污染来源分析。
2、无菌室定期进行空气灭菌效果验证（沉降法）时间：消毒处理后与开展检验活动之前期间采样。
采样点：一般情况下，无菌室面积≤30 m2时，从所设定的一条对角线上选取3点，即中心1点、两端各距墙1m处各取1点；无菌室面积≥30 m2时，选取东、西、南、北、中5点，其中东点、南点、西点、北点均距墙1 m。
方法：将含平板计数琼脂培养基的平板(直径9 cm)置采样点(与地面垂直高度80cm处)，开盖暴露15min后置于36±1℃培养箱培养48±2h。
技术要求：洁净级别100级：≤1CFU/皿；洁净级别10000级：≤3CFU/皿；洁净级别100000级：≤10CFU/皿。
Q9：GB/T 4789.3-2003大肠菌群证实实验中，革兰氏染色过程中会有哪些关键点造成假阳性或假阴性的结果？A：1、酒精脱色。
如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。
脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响。
2、染色过程中勿使染色液干涸。
用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液稀释而影响染色结果。
3、选用幼龄的细菌。
G+菌培养12-16h，大肠菌群培养24h。
若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性菌。
Q10：GB 4789.3-2016平板法验证菌落如何挑取？A：分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落数。
按比例挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。
假如在1:10的平板上可疑大肠菌群有10个，典型大肠菌群有6个。
证实实验应该按照可疑跟典型5:3的比例进行挑取，移种于BGLB肉汤管内。
（五）数据处理Q11：GB 4789.3-2016平板法结果如何计算？A：1、若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于15CFU ，具有确证的菌落数，则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算；2、若两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板，并含有已确证的菌落数，则相应平板均作为计数平板；3、若两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内，或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内，则相应的平板不作为计数平板；4、若两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中一个平板无已确证的菌落数，则相应的平板不作为计数平板；5、若两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，但无已确证的菌落数，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；6、若第一稀释度平板上的菌落数超过150CFU，且有证实的菌落数，以及第二稀释度平板上无确证的菌落或典型菌落数不在15CFU~150CFU之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算。
三、结语对于结果检出的平板或试管需要经过无害化处理（121①灭菌30分钟）方能弃去，防止对环境造成污染。