基因工程中限制酶的选择及的筛选方法
新人教《生物技术与工程》高考总复习：第7讲 重点研究“基因工程操作中限制酶的选择和PCR技术”
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ (2)磷酸二 酯键 (3)自我复制 一个至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养 宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)位于基因首端的一段特 殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ 和 XhoⅠ 的识别位点，故在引物末端添加限
制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和Xho Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶 EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶MunⅠ与限 制酶EcoRⅠ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶 是EcoRⅠ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含 有限制酶EcoRⅠ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ 和XhoⅠ 切割。综上所 述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物选用添加限制酶EcoR Ⅰ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；
项目 已知序列
PCR引物
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中 (虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′AACTATGCG……AGCCCTT3′ B．5′AATTCCATG……CTGAATT3′ C．5′GCAATGCGT……TCGGGAA3′ D．5′TTGATACGC……CGAGTAC3′
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加 限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______， 在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构 建完成的整个过程共需要________种酶。
高中生物基因工程如何选取限制酶专题练 (含答案)
2024届高三生物提分攻略：如何选取限制酶选择限制酶时需要考虑哪些因素？①为了防止目的基因、载体自身环化和及2者的反向连接，尽量选择双酶切法，选择2种限制酶。
②酶切位点位于目的基因两侧，不能破坏目的基因；③不能破坏启动子、终止子、复制起原点。
④通常选择含有目的基因的DNA片段和载体上共有的酶切位点，或者能产生相同黏性末端的限制酶；⑤若载体上有2个及以上的标记基因，为了便于筛选，通常需要破坏一个标记基因；若载体上只有1个标记基因，不破坏这个标记基因。
⑥考虑转录的方向，需要将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，且考虑到目的基因插入后能正常转录出正确的RNA。
1、构建重组质粒时可选用四种限制酶，其识别序列如下图。
为防止酶切片段的自身环接，不可选用的限制酶组合是（）A.①③B.②③C.①④D.③④2、若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ（－A↓GATCT－），EcoRⅠ（－G↓AATTC－）和Sau3AⅠ（－↓GATC－）。
下列分析合理的是（）A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRI切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体3、获得相关基因后，利用PCR技术进行融合得到目的基因，可选择与乳腺细胞表达载体pBC1构建重组DNA 分子。
目的基因、表达载体pBCl如图乙所示。
①PCR扩增图示目的基因时需加入种引物和酶。
②本实验应选择限制酶切割目的基因与pBCl载体，将酶切产物正确连接后形成重组DNA分子，以便后续通过荧光检测筛选。
4、人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经加工后形成具有两条肽链（A链和B链）的有生物活性的胰岛素。
此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。
基因工程中限制酶的选择及的筛选方法
基因工程中限制酶的选择及的筛选方法摘要:基因工程是现代生物科技专题的重要内容,基因工程四部曲中的核心内容是基因表达载体的构建，在构建表达载体过程涉及的限制酶的种类以及筛选方法成为考试的热点内容。
本文结合三道例题将限制酶的选择和筛选方法结合在一起进行比较分析.关键词：限制酶筛选1 单酶切及筛选若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端，因而可能出现多种连接方式如①质粒和质粒②目的基因和目的基因③质粒的自身环化，目的基因的自身连接④质粒与目的基因的连接。
质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种。
若启动子在质粒上，目的基因与质粒的反向连接则导致三联体密码顺序改变,起始密码子和终止密码子位置改变,使得翻译不能正常进行而无法得到正常的表达产物。
例1：（2012江苏生物高考33题部分)图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。
现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。
请回答下列问题若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒,那么应选用的限制酶是。
在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌,一般需要用添加的培养基进行培养。
经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是。
答案: BamH I 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向链接笔者认为可通过免疫学方法检测目的基因的表达产物排除反向连接的重组质粒，或分别在质粒和目的基因上设计相同的限制酶识别位点，然后用该酶去切割重组质粒，正向连接和反向连接便会得到不同长度的DNA片段，再根据已知的限制酶在目的基因的位置进行比对，找到正确连接的重组质粒。
2 双酶切及筛选因为用单酶切会出现质粒与目的基因的任意连接，所以在实际操作中多使用双酶切。
双酶切可以避免质粒的自身环化，目的基因的自身连接和目的基因和质粒的反向连接，而目的基因与目的基因的连接因为没有抗生素抗性基因所以可以在含有该抗生素的培养基上去除，故只剩下质粒与质粒，以及质粒与目的基因的重组体。
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程所需要的酶
基因工程所需要的酶引言基因工程是一项重要的生物技术，它利用酶的特殊功能来改变生物体的遗传信息。
酶在基因工程中起着关键作用，它们能够催化特定的化学反应，使得基因组中的DNA序列发生改变。
本文将介绍基因工程中常用的酶以及它们在不同的应用领域中的作用。
常用酶及其功能1. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶。
它们广泛应用于基因工程中的DNA重组、克隆和测序等领域。
限制性内切酶根据其识别位点和切割模式被分类为不同类型，如EcoRI、BamHI等。
这些酶可以将DNA分子切割成片段，并产生粘性或平滑末端，为后续操作提供方便。
2. DNA连接酶DNA连接酶是一种能够将两个单链DNA或RNA分子连接成一个完整双链分子的酶。
它们在基因工程中常被用于连接DNA片段，构建重组DNA分子。
T4 DNA连接酶是常用的DNA连接酶之一，它能够将DNA片段连接成环状或线性结构。
3. 核酸聚合酶核酸聚合酶是一类能够催化DNA或RNA的合成的酶。
在基因工程中，核酸聚合酶被广泛应用于PCR（聚合酶链式反应）和基因克隆等领域。
其中，Taq DNA聚合酶是PCR反应中最常用的核酸聚合酶之一，它能够耐高温，并具有高度特异性和高效率。
4. 核酸修复酶核酸修复酶是一类能够修复DNA损伤和错误的酶。
在基因工程中，核酸修复酶被用于修复突变的DNA序列，纠正基因组中的错误。
CRISPR-Cas9系统利用Cas9核酸修复酶来导向性地切割和编辑目标DNA序列。
5. 核苷三磷脂转移ase核苷三磷脂转移ase（NTPase）是一类能够催化核苷三磷酸与核苷二磷酸之间的磷酸酯键转移的酶。
在基因工程中，NTPase被广泛应用于DNA合成和修饰等领域。
DNA聚合酶的活性依赖于NTPase的催化作用。
酶在基因工程中的应用1. DNA重组和克隆在基因工程中，限制性内切酶被广泛应用于DNA重组和克隆。
通过选择适当的限制性内切酶，可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来，构建重组DNA分子。
专题9 微课微练 (2) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
专题九微课微练(二) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建一、选择题1．图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。
据此判断下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述，错误的是()A．若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和HindⅢ剪切C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用感受态的大肠杆菌D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达解析：选D PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合，沿相反的方向合成子链，故所用的引物组成为图乙中引物甲和引物丙，A正确；选择的限制酶应在目的基因两端存在识别位点，但Bam HⅠ可能使质粒中的启动子丢失，因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，B正确；将目的基因导入微生物大肠杆菌细胞中，需要用Ca2＋处理，使之成为感受态细胞，C正确；在构建基因表达载体时，使用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割质粒，氨苄青霉素抗性基因已被破坏，因此氨苄青霉素抗性基因在受体细胞中不能表达，D错误。
2．(2022·东城区一模)自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。
我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
下列相关叙述错误的是()A．上述获得蓝色玫瑰的方案中无需转入能调控液泡pH的基因B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和Bam HⅠC．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的D．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上解析：选B蓝色玫瑰细胞质基质中的靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中无需转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeⅠ和Bam HⅠ，则会将终止子1一同切除，故只能用Bam H Ⅰ，B错误；sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的，C正确；将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法，故农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。
限制酶(知识讲座)
“限制酶”考点例析湖南省耒阳市第一中学周伟“限制酶”是高考试题中命题频率较高的知识点，也是高考备考的核心知识点。
下面结合典型试题，对相关知识进行归纳和整合，希望能对广阔考生的复习备考有所裨益。
一、酶切结果的推导限制酶作为酶类，决定其催化作用具有高效性、专一性和作用条件温和等特点。
其中专一性的具体表现为：某种限制酶只能催化DNA上特定序列特定位点的磷酸二脂键水解，结果是使DNA分子被分割成不同的DNA片段。
限制酶所识别的双链DNA上的序列具有“回文对称”性质，即无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，即错位平切，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，即平切，产生平末端。
错位切的限制酶在基因工程中最常使用，因为与平末端相比较，黏性末端更有利于DNA片段的连接。
例1下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图〔↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端〕：限制酶1：——↓GATC——；限制酶2：——CATG↓——；限制酶3：——G↓GATCC——；限制酶4：——CCGC↓GG——；限制酶5：——↓CCAGG——。
请指出以下哪组表达正确〔〕A．限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对B．限制酶3和5识别的序列都包含5个碱基对C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同D．限制酶1和2剪出的黏性末端相同解析：限制酶2、3、4、5识别的序列分别包括4个、6个、6个、5个碱基对，故A、B错。
限制酶1和2切割产生的黏性末端不同。
限制酶1剪出的黏性末端是：—C T A G，限制酶2剪出的黏性末端是：—C A T G，限制酶3切割产生的黏性末端是:—C T A G，故D错。
答案 C二、酶切方法的选择构建重组质粒，需要用限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和质粒，切割方法主要有单酶切和双酶切。
专题9 现代生物科技专题 精研重难点(2) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别 和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。 答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 一个至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的 培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱 动转录过程
精研重难点(二) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
从“高度”上研究高考
[典例] (2021·福建高考)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫 蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。 科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过 PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的 基因位置。选用的引物组合应为__________。
B．NdeⅠ和XbaⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
解析：构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能 破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位。故只能选用Nde Ⅰ 和BamH Ⅰ切割质粒，因此在PCR扩增的该基因的两端需分别引入Nde Ⅰ和 BamH Ⅰ两种限制酶的识别序列。 答案：A
[解析] (1)密码子位于 mRNA 上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密 码子和终止密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对 引物应分别位于 A 位点和 B 位点的外侧。
(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组 载体P′中的MT基因接入载体E，此时需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切 位点之间，故选EcoRⅤ将载入体P切开；由于E.coli DNA连接酶只能连接黏性 末端，而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，结合题意可知， MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构 成重组载体P′。②由图1可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子； 为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图1可知，载体 P′和载体E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，故可选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶进行酶 切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是感受态细胞法，需用钙离子处理大肠杆 菌。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定， 故即使MT工程菌的MT蛋白相对表达量较高，也无法说明已经成功构建能较强 吸附废水中重金属的MT工程菌。
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基因工程中限制酶的选择及的筛选方法
摘要:基因工程是现代生物科技专题的重要内容，基因工程四部曲中的核心内容是基因表达载体的构建，在
构建表达载体过程涉及的限制酶的种类以及筛选方法成为考试的热点内容。
本文结合三道例题将限制酶的选择和筛选方法结合在一起进行比较分析。
关键词:限制酶筛选
1 单酶切及筛选
若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端，因而可能出现多种连接方式如①质粒和质粒②目的基因和目的基因③质粒的自身环化，目的基因的自身连接④质粒与目的基因的连接。
质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种。
若启动子在质粒上，目的基因与质粒的反向连接则导致三联体密码顺序改变，起始密码子和终止密码子位置改变，使得翻译不能正常进行而无法得到正常的表达产物。
例1: (2012江苏生物高考33题部分)图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。
现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。
请回答下列问题
若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是。
在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加的培养基进行培养。
经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是。
答案: BamH I 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向链接
笔者认为可通过免疫学方法检测目的基因的表达产物排除反向连接的重组质粒，或分别在质粒和目的基因上设计相同的限制酶识别位点，然后用该酶去切割重组质粒，正向连接和反向连接便会得到不同长度的DNA片段，再根据已知的限制酶在目的基因的位置进行比对，找到正确连接的重组质粒。
2 双酶切及筛选
因为用单酶切会出现质粒与目的基因的任意连接，所以在实际操作中多使用双酶切。
双酶切可以避免质粒的自身环化，目的基因的自身连接和目的基因和质粒的反向连接，而目的基因与目的基因的连接因为没有抗生素抗性基因所以可以在含有该抗生素的培养基上去除，故只剩下质粒与质粒，以及质粒与目的基因的重组体。
2.1插入失活筛选法
例2：（苏锡常镇2012届高三教学调研测试）MseI，EcoRI，PstI识别的碱基序列和切割位点分别为GAAT↓TAATTC，G↓AATTC，C↓TGCAG。
请回答下列问题：
1)在用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，需要对质粒改造，构建新的限制酶切位点。
试写出构建需要的限制酶切位点的过程(提供构建需要的所有条件)：
①首先用酶处理质粒；
②然后用DNA聚合酶等处理质粒；
③再运用酶处理质粒，从而形成新的限制酶切位点，可被酶识别。
(2)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。
下图表示运用影印培养法(使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入大肠杆菌。
图3
培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有，。
从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是菌落中的细菌。
答案：（1)EcoRI，DNA连接，MseI(2)四环素青霉素（四环素和青霉素）4和6
用限制酶MseI和PstI同时切割含目的基因的DNA和质粒，但原有质粒上无MseI识别位点，需利用EcoRI识别位点重新构建MseI识别位点。
在抗青霉素基因内部具有重新构建的MseI识别位点，当用MseI和Pst I同时切割含目的基因的外源DNA和质粒，由于目的基因的插入，导致抗青霉素基因出现功能性失活，于是所形成的重组质粒都将具有四环素抗性和对青霉素敏感。
将转化的细菌接种在含四环素的培养基上，一段时间后可得到全部受体菌菌落，将灭菌的绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含青霉素的培养基上。
含重组质粒的受体菌能在四环素培养基上生长却无法在青霉素培养基上上生长。
上题实际是运用插入失活[1]效应检测外源DNA。
根据插入失活原理设计的筛选重组体分子的方法，需要进行菌落平板的影印复制，才能识别出由此而丧失的表型特征，这会给重组体的筛选工作增加不少麻烦，由此而发展出β-半乳糖苷酶显色反应选择法[1]。
2.2 β-半乳糖苷酶显色筛选法
例3:（盐城市2012届高三二模）大肠杆菌pUCl8质粒上的LacZ基囚可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG 和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落；反之，则形成白色菌落。
由此推知，选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入物质。
成功导人重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成色的菌落，原因是。
图四
选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入IPTG，X-gal 和氨苄青霉素。
只有导入质粒的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长繁殖，而重组质粒中的LacZ基囚因插入目的基因不能正常表达，所以无法表达β-半乳糖苷酶，培养基呈白色。
答案：IPTG X-gal 氨苄青霉素：白色；重组质粒中的LacZ基因因插入目的基因而不能表达
3平端位点问题
构建重组质粒时常会出现平端位点，平端DNA可用T4DNA连接酶连接，平端连接可使载体和外源DNA连接序列上的原有限制位点消失，而不含外源插入DNA的载体，经自连成环后仍保留原有的限制位点。
基于这一特性，使用特定限制酶处理连接混合物将能专一性地使自连载体DNA线性化，能抗酶解的重组DNA则依然保持环状。
主要参考文献
[1]吴乃虎.基因工程原理.第二版.北京:科学出版社,1998.372
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