结核菌培养方法、
结核杆菌培养标准操作流程
一、痰标本的采集
1、痰标本的种类 根据痰标本采集时间，可 将标本分为3类： （1）即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液； （2）清晨痰：患者晨起立即用清水漱口后咳 出的第2口、第3口痰液； （3）夜间痰：送痰前一日患者晚间咳出的痰 液。
2、正确的咳痰方法：
（1）咳嗽前应缓慢的深吸气，吸气后稍屏气片刻。 （2）躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸 壁下部，内收并稍加力。 （3） 咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次 深吸气可连续咳嗽三声。 （4）停止咳嗽并收缩将剩余的气体尽量呼尽。 （5）在缓慢吸气或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的 动作。 （6）勿将漱口水、唾液、呕吐物、鼻咽分泌物等混 入痰内，以免影响检验结果。如标本不合格，检验 人员应当拒收，并和临床医生对接，重新采样。 （7）标本量一般在3～5毫升。
分支杆菌培养阳性（3+）：菌落占斜面面3/4 分支杆菌培养阳性（4+）菌落布满全斜面。
5、培养基污染情况报告
在观察分支杆菌生长情况时，发现有非分支 杆菌生长，报告污染，重新送检。污染必须 控制在2%以下，当污染率高于2%时，提示 培养基污染或消化处理不当，应采取相应措 施，查寻和分析原因。
结核分支杆菌培养
讲述内容： 一、痰标本的采集 二、结核分支杆菌培养操作规程
结核分支杆菌培养是结核病诊断 细菌学检验的重要内容之一（另外是 “抗酸杆菌涂片检查法”）这里我只 讲结核分支杆菌培养。 讲之前我还是要强调下要保护好 自己（即生物安全问题）。结核分支 杆菌是怎样传播我想你们比பைடு நூலகம்懂，由 于时间关系，这里也不展开讲，进入 正题………
3、接种方法：取前处理消 化后痰液0.1mL,无菌操作接 种于培养基斜面上，每份标 本同时接种两支酸性改良罗 氏培养基，放37℃孵育。
结核分枝杆菌痰培养方法
结核分枝杆菌痰培养方法结核病是一种大家较为熟知的慢性传染性疾病，由结核分枝杆菌感染引起。
可通过空气传播，且感染剂量很低，人吸入很少的结核分枝杆菌即可引起感染。
该疾病会在任何年龄发病，而免疫力低下的患者更容易感染结核分枝杆菌。
近年来，随着艾滋病发病率的增加，耐药性结核分枝杆菌的出现，吸毒人群的增多以及免疫抑制剂的应用等，我国结核病发病率仍然较高。
结核病已成为威胁人类健康的全球性的严重的公共卫生问题。
如何知道自己得了结核病呢？当人体感染结核杆菌后，因感染的部位不同，会出现不同的临床症状。
例如肺结核患者主要会表现出咳嗽，咳痰，咯血，胸痛，低烧，盗汗，乏力等一些呼吸道疾病症状。
而感染肾脏时，患者会出现尿急，尿痛，血尿等泌尿系统症状。
大部分患者感染结核杆菌后会出现不同程度的低热，盗汗，虚弱等等。
当人体出现以上症状时，即可高度怀疑为结核病。
出现自觉症状后，就医后医生首先会建议患者进行影像学诊断，以此来确定结核分枝杆菌感染的脏器部位，同时也会进行体液培养来进一步确定患者是否感染了结核杆菌，通常会采取患者的痰液来进行检验。
让我们进一步来了解一下吧。
一、什么是结核杆菌？结核杆菌即为结核分枝杆菌。
它是引起结核病的病原体，而结核杆菌是一种较为古老的细菌，早在4500年前的古埃及，人们就已经发现了这种细菌的存在。
古代时大家将肺结核患者称为肺痨患者。
在1882年，该病菌由一名德国的细菌学家郭霍发现后，才被正式命名为结核菌。
结核分枝杆菌是一类专性需氧菌，它生长较为缓慢。
对干燥，冷，酸碱等抵抗力非常的强，在紫外线的照射下，痰液中的结核杆菌需要经过六个小时左右才会被彻底杀死。
目前痰培养是确定结核杆菌感染的主要检查项目，经过痰液培养分离细菌可以发现，结核分枝杆菌革兰染色不易着色，需用特殊染色方法荧光染色或萋—尼抗酸染色。
经抗酸染色后菌体为红色细长直或略弯的杆菌，该细菌没鞭毛，无芽孢，有荚膜，多数有异染颗粒。
荧光染色、抗酸染色如图：从致病性角度分析可见，结核杆菌本身不会产生内外毒素，其致病物质主要是他的荚膜、脂质以及蛋白质。
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结核分枝杆菌的培养要求
结核分枝杆菌的培养要求结核病是一种罕见但严重的疾病，其病原体是结核分枝杆菌。
为了对这种病原体进行研究和诊断，需要进行结核分枝杆菌的培养。
下面就来介绍一下结核分枝杆菌的培养要求。
1. 培养基的选择结核分枝杆菌是一种嗜氧菌，因此需要在含有足够氧气的培养基上进行培养。
同时，由于这种菌对酸碱度比较敏感，因此需要选择pH值在6.5至7.5之间的培养基。
MIddlebrook培养基被广泛用于结核分枝杆菌的培养，它含有牛肉提取物、蛋白胨、甘油和酚红等成分。
2. 消毒和净化在进行结核分枝杆菌的培养前，需要对培养器具进行消毒和净化，以避免外来微生物的污染。
通常使用高温高压法或者化学消毒法进行消毒，然后用无菌水或酒精进行净化。
3. 脱毒由于结核分枝杆菌会产生毒素，因此在培养前需要将菌体中的毒素去除。
使用热牛血清进行脱毒是一种常用的方法。
先将菌体用热水清洗干净，再用热牛血清进行淹洗，最后用无菌水洗净。
4. 接种量和温度结核分枝杆菌的接种量和温度对其生长和繁殖起着至关重要的作用。
一般来说，接种量应当足够，不过也不能太多。
高密度接种会导致细菌之间竞争，从而导致细菌繁殖速度减缓。
温度应当控制在35-37度之间，这样才能创造出适合细菌繁殖的环境。
5. 培养时间结核分枝杆菌是一种生长缓慢的细菌，在进行培养时需要耐心等待。
在使用Middlebrook培养基进行培养时，需要约4至6周的时间。
在培养过程中，需要对菌落进行观察，以了解其生长情况。
以上就是结核分枝杆菌的培养要求，希望对大家有所帮助。
想要更好地对结核分枝杆菌进行研究和诊断，需要加强对这些培养要求的了解和掌握。
结核分枝杆菌培养基制备、保存、质量控制
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结核分枝杆菌培养基制备、保存、质 量控制
培养基制备注意事项
• 无菌试验后，虽然没有发现有可见菌落出现，但培养 基已经变蓝色或变黄色，与蓝绿色或黄绿色有明显区 别时，应视为污染弃去。
• 每批培养基应作无菌试验。
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结核分枝杆菌培养基制备、保存、质 量控制
质量控制内容
• 颜色 • 质地 • 湿度 • 匀质性 • 无菌性 • 敏感性
培养基制备需要的试剂
• 2% 孔雀绿溶液，单独配制
n孔雀绿染料
2g
灭菌去离子水
100 ml
使用无菌技术溶解染料于灭菌去离
子水中（放置于37°C温箱中１－２小 时）或者在水浴中加热。配制好的溶液
储存于深色瓶中。此溶液长时间放置并
不稳定，如果发生沉淀，应丢弃并重新 配制。
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结核分枝杆菌培养基制备、保存、质 量控制
器内。
• 记录批号的信息（看下边信息）。
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结核分枝杆菌培养基制备、保存、质 量控制
培养基制备注意事项
• 培养基制备最好在专用“培养基制备间”内进行，制 备培养基时应有相应制作过程的记录。
• 培养基制备前“培养基制备间”的空气、台面等应进 行消毒。
• 制备培养基的所有物品用具应高压灭菌。
结核分枝杆菌培养基制 备、保存、质量控制
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2020/12/12
结核分枝杆菌培养基制备、保存、质 量控制
内容
• 培养基制备需要的仪器 • 培养基制备需要的试剂 • 培养基制备步骤和方法 • 培养基制备注意事项
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结核分枝杆菌培养基制备、保存、质 量控制
培养基制备需要的仪器、耗材
肺结核的结核病原菌分离与培养技术
肺结核的结核病原菌分离与培养技术肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，它是全球范围内的重要公共卫生问题。
为了诊断和治疗肺结核，必须准确地分离和鉴定病原菌，这在临床实践中起着重要作用。
本文将介绍肺结核的结核病原菌分离与培养技术。
一、分离技术肺结核的结核病原菌主要通过痰液传播，因此，分离病原菌的第一步是收集患者痰液样本。
通常情况下，患者需要在早晨醒来后的连续两至三天采集新鲜的痰液样本。
采集后，样本应迅速送至实验室。
在实验室中，常用的分离技术是培养法。
首先，将痰液进行稀释，然后使用不同的培养基进行涂布。
最常用的培养基是Löwenstein—Jensen培养基和Middlebrook 7H10/7H11培养基。
这些培养基含有适合结核菌生长和分离的营养成分。
涂布后，将培养皿放置在37℃的培养箱中进行培养。
结核菌的生长速度相对较慢，通常需要2至6周的时间才能看到可见的菌落。
在观察期间，必须定期观察并记录培养皿上的菌落特征，如形状、颜色和大小等。
二、培养技术结核菌的培养技术有多种方法，常用的包括固体培养和液体培养。
固体培养是将此菌接种到含有琼脂的培养基上。
固体培养的主要优点是便于观察，菌落特征清晰可见。
但缺点是病原菌增殖速度较慢，且只能得到纯培养物。
液体培养是将结核菌接种到液体培养基中进行培养。
液体培养的主要优点是菌落生长速度快，可以提高结核菌的密度。
此外，液体培养还可以应用于抗生素敏感性测试等其他实验。
无论使用何种培养技术，都要注意环境条件和操作规范以避免交叉污染。
通风良好的实验室环境、洁净的培养仪器和消毒的试剂是保证培养过程成功的关键。
三、分离鉴定培养得到的菌落需要进行进一步的分离鉴定。
传统的鉴定方法包括酸忍受试验、抗酸染色和结核菌分枝杆菌分离物抗原检测等。
这些方法能够鉴定结核分枝杆菌的特殊细胞壁结构和抗原特征。
近年来，随着分子生物学技术的发展，PCR（聚合酶链反应）和核酸杂交等方法也被广泛应用于结核菌的鉴定。
痰结核分枝杆菌培养操作
痰分枝杆菌培养操作注意：培养操作必须在二级生物安全实验室以上的防护条件下进行，穿戴个人防护装备确保安全！一、材料与准备1.实验物品：生物安全柜、漩涡振荡器、计时器、斜面架、培养箱、记号笔、登记本。
2.耗材（每份标本）：前处理管、无菌4%NaOH、无菌吸管（3支）、酸性罗氏培养基（2支）。
3.准备工作：①将培养基从冷藏环境取出，检查培养基（污染或干裂的弃去不用），合格的培养基室温放置5-10分钟，待其恢复至室温，拭去外壁的凝结水后在培养基斜面背面标记编号、患者姓名、接种日等；②取无菌的前处理管，标记患者姓名、实验室编号；二、标本处理与接种1.在生物安全柜内，用无菌吸管吸取痰标本1-3ml，加入到前处理管中；2.视痰标本性状加1-2倍体积的4%NaOH溶液，立即开始计时15分钟；3.涡旋振荡30-60秒后室温静置，直至15分钟结束（如果标本较多，应当分别处理，保证氢氧化钠处理时间不超过20分钟！）；4.检查培养基的凝固水，如果过多，应沿培养基管壁弃去，避免凝固水流经斜面5.用无菌吸管吸取经过前处理的痰标本，接种0.1ml至培养基斜面，尽可能将标本铺满斜面（可在斜面上部和中部各滴一滴标本液，拧紧培养基管盖后向各方向倾斜），每份标本接种两支培养基；三、培养与观察1. 新接种的培养基放在斜面架上，保证斜面水平向上，在培养箱37℃培养24小时；2. 24小时之后，将培养基竖直放置，继续培养；3. 接种后第3天、第7天各观察一次，如果有菌落生长，则进行涂片镜检以鉴别污染菌或速生分枝杆菌。
以后每周观察一次，并记录结果；4. 至第八周末，仍无菌生长，可报分枝杆菌阴性。
5. 典型的结核分枝杆菌菌落形态为淡黄色、菜花样、粗糙、干燥、不透明。
非典型分枝杆菌菌落形态不一，有的与结核杆菌相似，有的黄色、湿润、光滑。
6.如查不能区分杂菌污染和非结核分枝杆菌，应进行涂片抗酸染染色镜检，如为非抗酸菌，则报告污染（如果培养实验室仅承担菌株分离任务，则不需在培养实验室涂片确认）。
结核杆菌培养特点
结核杆菌培养特点
结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis) 是导致结核病的病原体。
它在人体内的生长速度比较慢，因此在培养中需要一些特殊的技术和条件。
一些结核杆菌培养的特点如下：
•温度：结核杆菌需要高温(37-42°C) 条件来生长，因此在培养中需要使用恒温培养箱。
•氧气：结核杆菌需要低氧(5-10% O2) 条件来生长，因此在培养中需要使用氧气控制装置来控制氧气浓度。
•时间：结核杆菌需要长时间(通常需要2-8周) 来在培养基上生长，因此在培养中需要耐心等待。
•培养基：结核杆菌需要特殊的培养基来生长，如Lowenstein-Jensen培养基，Middlebrook 7H9培养基等。
•染色：结核杆菌需要特殊的染色方法来显示其在培养基上的生长，如Ziehl-Neelsen染色和Fluorochrome染色等。
•检测: 对于结核杆菌的检测，除了传统的培养培养之外，现在也有PCR, LAMP, GeneXpert MTB/RIF 等先进检测方法。
结核杆菌培养需要特殊的条件和技术，并且需要耐心等待。
培养结果可以用于诊断结核病和鉴定结核杆菌菌株。
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敏感与耐药程度的分析 + ++ +++ 3(10.0%) 1(3.3%) 4(13.3%) 22(73.4%)
PAS(%)
22(73.4%) 2(6.6%)
3(10.0%) 3(10.0%)
DPC(%)
20(66.6%) 3(10.0%) 6(20.0%) 1(3.3%)
表1和表2可以说明INH、PAS、 DPC为三种不同的抗结核药物， 他们对不同的结核菌，有不同 的敏感与耐药情况。从8例耐 PAS菌株中，我们发现，此8例 同时有三种以抗结核药物之耐 药，耐DPC菌株10例中，也有 此一现象，是多种耐药性菌株。
• Kowilsky氏测定DPC服用后血浓度的记载，
氏用DPC与INH同量时，血浓度1小时 5.8mg/L,3小时6mg/1,7小时4.56mg/L,12小 时2.6mg/L,14小时2mg/L，氏认为DPC明显 优于INH，其优点是：（1）DPC排泄慢， INH12小时血浓度仅有0.003mg/L，而KPC 仍有2.6mg/L，14小时时INH浓度已为”0”， KPC仍高达2mg/L。（2）血浓度KPC比INH 高，在二者给同样的药量时，INH血浓度为 5.2mg/L，DPC则为5.8mg/L。
• 2、研究结果：我们研究的10种抗结核
药物耐药性试验，这10种抗结核药物是： INH、PAS、DPC、TB1、EMB、RFP、RFD、 SM、KM及CPM，围绕本文目的，我们仅取 30例病人的其中INH、PAS及DPC三种药物 的耐药性进行分析，其他另行报道。INH、 PAS的浓度，按国家耐药性标准，分为1μg 及10μg，以每毫升1μg为耐药上界，1μg药 浓下不能生长者为阴性，为敏感菌。1μg生 长者为阳性，为耐药菌。
INH+PAS的混合物，我们的研究证明从耐 药性及耐药程度分析，DPC是独立的一种抗 结核药物，是INH与PAS的一种化合物，当 前，我国耐INH菌株已达90%，这样的耐药 性，仍在广泛应用，是否降低疗效，值得 重视。INH耐药后，是否致病力全均下降， 从我们的结核菌培养后生长时间看，并未 发现耐药菌的生长延缓。
• Dipasic则暂定为每毫升含药0.1μg、
0.5μg、1.0μg及10μg四种。加入药物后， 充分摇匀混合后，分装在中试管内，每管5 毫升，摆成斜面，进行85℃—90℃一小时 凝固灭菌，24小时后再灭菌一次，制成的 含药培养基，保存在冰箱，一个月内有效。 菌液制备：取培养基上生长一个月内的菌 落，于磨菌器内灭菌生理盐水研磨呈均匀 的菌液，再加灭菌盐水稀释，与标准管比 较（制成每毫升含1毫升的菌液），最后 100倍稀释成每毫升含10-2毫克菌液备用。
结核菌培养方法、耐药 性及存活时间的研究
抗结核药物的使用，在结核病防治上起了 划时代的作用。50年代采用INH+PAS联 合治疗，取得了较好疗效。但PAS服用量 大，消化道反应多，病人不能耐受，90% 不能完成治疗程。瑞士Geistlich药厂研制 的Dipasic（简称DPC）（德国又名 GEWO399），是以特殊方法，将INH与 PAS合成的化合物。它能代替INH+PAS联 合用药，增加疗效，副作用明显比PAS为 少，德国Freudenthal等50余位专家均有 Dipasic临床应用的报告，认为有效。但无 Dipasic耐药性的报道。
当前，我国耐药性病人不断增 加，寻求合理用药，是当务之 急，为此我们对Dipasic作耐性 研究，目的在于， （1）了解Dipasic对耐药菌株是 否有效？ （2）Dipasic的药物抑菌浓度如 何？以便研究用量与用法，提 高临床疗效。
1、研究方法：从安徽医科大学附属医院
的门诊及病房肺结核病人的痰进行结核菌 培养，无论病人是初治抑复治，亦不分男 女老少，凡痰菌培养阳性者，即作为研究 对象。结核菌的检验，按标准常规操作进 行。药敏培养基的制备：液体鸡蛋培养基 内，按比例加入抗结核药物，其浓度按我 国药敏标准，如INH、PAS、TB1，每毫升 分别为1μg及10μg，SM、KM、CPM分别为 10μg，RFP及RFD分别为50μg及250μg， EMB为5μg及50μg。
• 比统计学看来，耐INH菌株，应用DPC仍
有效，差异有高度显著性。因此，DPC可 否作为另一种抗结核药物，与RFP、RFD 等联合应用，关键在于DPC是否和PAS那 样，对RFP、RFD吸收有障碍，会降低 RFP的血浓度，降低疗效。如果DPC并没 有PAS这一代谢现象，则DPC作为另一抗 结核药物，其应用前景就较为广阔了。
DPC（%）
22(73.3)
20(66.6)
8(26.7)
10(33.4)
从表1可见耐INH菌珠已达 90%,耐DPC菌株为33.4%,经 统计学处理,X2=27.44,P＜ 0.001,有高度显著性。PAS与 DPC比较，经统计学处理， 校正卡方为0.062，P＞0.05, 无显著性。
表2
药物名
• DPC的浓度，由于我们尚需寻求合
适的抑菌浓度，故分为每毫升含药 0.1μg、0.5μg、1.0μg及10μg四种 不同的浓度。为便于统计比较，暂 以1μg作为耐药标准，1μg以下者 为敏感，1μg以上者为耐药。
表1
30例耐药情况分析
敏感
3（10.0）
药物名
INH（%）
耐药
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ(90.0)
PAS（%）
表3
30例DPC抑菌浓度的分析
培养阳性
30（100%）
18（60%） 9（30%） 2（6.6%）
抑菌浓度(μg)
0．1
0．5 1 10
培养阴性
0（0%）
12（40%） 21（70） 28(93.4%)
从表3可见,DPC抑菌 浓度,1μg尚有9例培 养仍可生长,10μg时 有6.6培养阳性。
讨论：过去，有人认为DPC是一种
• 菌液接种：将含不同浓度的含药培养基顺
序排列，并有不含药物的培养基作为对照。 取每毫升含10-2毫克的菌液，每管接种0.1 毫升，接种菌量为10-3毫克的菌液。放在 37℃温箱内培养，每周观察一次，四周报 告结果。报告的标准是，如培养基上无菌 生长者为（一），培养基上有菌落数在50 个以下者为（+），培养基上菌落数50个以 上，但无融合者为（++），培养基上菌落 大部分融合者为（+++）。