猕猴桃基因组DNA提取的研究
猕猴桃遗传转化研究进展
猕猴桃遗传转化研究进展猕猴桃属于猕猴桃科猕猴桃属的多年生落叶藤本植物，其果实营养丰富，人体必需的矿物质、纤维素和维生素含量较高。
此外，还具有药用价值，有水果之王之美誉。
要获得高品质的猕猴桃，遗传转化无疑成为一种有效的现代生物技术。
猕猴桃属雌雄异株，倍性复杂，雌雄株间花期不遇使种间杂交困难，育种周期长，且有不确定性。
因此，需要引进新的手段和方法进行育种。
目前，猕猴桃的遗传转化已取得很大进步，本文就猕猴桃遗传转化方面的研究进展做一综述。
1 已别离与克隆的猕猴桃目的基因目前已被别离和克隆的目的基因，主要与猕猴桃果实成熟及衰老过程有关。
从1993年开始，MacDiarmid和任小林等分别成功地从猕猴桃果实中别离和克隆出ACC氧化酶基因，导入猕猴桃，均可增强猕猴桃的耐贮藏性。
1997年王春霞等建立了由根癌农杆菌介导的西瓜高效遗传转化系统，来控制植株的寿命和果实早熟或耐储藏性。
xx年宋喜贵等利用从番茄果实中别离到的ACC合成酶c DNA基因反向置于CaMV35S启动子的控制之下，并转入美味猕猴桃的愈伤组织中从而延缓植株衰老并提高其耐贮藏性。
Atkinson等从美味猕猴桃中别离克隆出PG基因。
任小林等还从美味猕猴桃中克隆了钙调蛋白c DNA。
徐昌杰等从中华猕猴桃别离出的ACC合成酶家族四个成员的基因组DNA片段。
2 猕猴桃遗传转化的方法遗传转化主要是将外源基因导入受体细胞中，使之发生定向的遗传变异。
通常利用重组DNA，组织培养或种质系统转化等技术，其方法主要有农杆菌介导法、花粉管通道法等。
目前，在猕猴桃遗传转化中应用的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、DNA直接摄取法等。
2.1 农杆菌介导转化法包括根癌农杆菌和发根农杆菌介导法。
该方法研究较成熟。
农杆菌介导法获得稳定转化体的频率更高且重复性更好。
2.2 基因枪介导转化法又称微弹轰击法，其将外源DNA片段包裹在微小金粒或钨粒外表，然后在高压作用下将微粒高速射入植物细胞或组织中，微粒上的外源DNA进入细胞后整合到植物染色体上，得到阳性表达从而实现基因转化。
猕猴桃化学成分提取及应用研究现状
猕猴桃化学成分提取及应用研究现状作者：汤安英来源：《现代食品》 2019年第24期汤安英（贵州医科大学，贵州?贵阳?550001）Tang Anying(Guizhou Medical University, Guiyang?550001, China)摘?要：本文归纳了猕猴桃中各类化学成分，总结了其在药物和保健品中的应用研究现状，归纳了猕猴桃内各类化学物质对临床疾病的影响、作用机制及药理作用，对猕猴桃研究前景进行了展望，并提出了将猕猴桃应用于药用和保健方面的新思路。
关键词：猕猴桃；药理作用；保健品；药物应用Abstract：This paper summarized the kiwi in all kinds of chemical composition, summarized its application in medicines and health products research present situation, summarized the kiwi in all kinds of chemicals to clinical disease affecting factors, mechanism of action and pharmacological effects, the research prospect of kiwi fruit was discussed, and provided a new idea of kiwi fruit in medical and health care.Key words：Kiwi fruit; Pharmacological action; Health care products; Drug application中图分类号：R284.1随着保健品和药物的开发和应用，越来越多的研究者把目光投向了植物化学成分提取在药物制剂开发领域的应用。
猕猴桃营养成分的提取工艺研究进展教学内容
猕猴桃营养成分的提取工艺研究进展猕猴桃营养成分的提取工艺研究进展猕猴桃，又称阳桃，素有“果中珍品”‘水果之王”之称‘¨。
猕猴桃果实中富含多种营养成分，特别是维生素C含量很高。
猕猴桃还具有药用价值，能滋阴补阳、止渴生津，其籽油中的亚麻酸、不饱和脂肪酸和活性油脂等物质有降低血脂和血压的功能，对高血压、冠心病等疾病有防治功效。
猕猴桃皮渣中的果胶还可以刺激胃肠的蠕动，帮助改善老年人的肠道功能。
近年来，随着猕猴桃制品深受大家喜爱，国内外加快了对猕猴桃开发和利用研究进程，关于猕猴桃果实、籽油及皮渣中营养成分提取的各种加工方式应运而生。
1猕猴桃果实中营养成分的提取1.1多糖的提取工艺1.1.1正交设计法提取多糖猕猴桃果实中含多种药用成分，尤其是猕猴桃多糖，可以提高及刺激机体的免疫功能，阻断亚硝酸类化合物的生成，具有一定的抗癌作用。
提取是影响粗多糖分离纯化的第一步，直接影响多糖得率和生物活性。
庞振凌首次采用二次回归正交旋转组合设计法，从温度、时间、料液比、pH值等影响猕猴桃果粗多糖提取的因素进行了研究。
结果表明，在试验范围内，对粗多糖提取率和活性影响最大的因素是浸提液酸碱度，其次是温度、料液比以及浸提时间等因素。
陈志慧以新鲜猕猴桃果实为原料提取水溶性多糖，并进行了正交和单因素试验来确定提取工艺，对提取过程中影响提取率的因素如温度、料液比及时间等进行了统计分析，得出了最佳提取工艺条件为提取温度80℃、料液比19：25 mL、提取时间4h，提取2次，并用苯酚硫酸导数光谱法进行多糖含量的测定。
多糖的提取多采用水提或酶辅助等提取方法，但它们不是得率低就是价格昂贵，都不是理想的提取方法。
磷酸盐缓冲液是生物化学研究中比较常用的一种缓冲液，由于它是二级解离，pH值范围比较宽，并且容易配制成各种浓度。
张晶等以猕猴桃为材料，采用磷酸盐缓冲液浸提法对多糖进行提取研究，采用单因素和正交试验，优化提取猕猴桃多糖工艺条件，在最佳提取温度70℃、料液比1: 20的条件下提取3h，猕猴桃多糖提取率高。
PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究
PMA-qPCR方法检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌活菌的研究肖妍;刘芸宏;高贵田;曹凡;马燕萍;赵武奇;雷玉山【摘要】将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量(qPCR)相结合定量检测陕西猕猴桃溃疡菌优势病原菌(Psa)活菌的数量.通过优化PMA最佳浓度、暗孵育时间、曝光时间,确定PMA-qPCR区别溃疡菌活、死菌的最佳条件.结果表明,Psa经98.3℃沸水浴处理13 min可完全致死,Psa死菌浓度为1×107 CFU/mL时PMA与死菌共价交联的最佳浓度为105μg/mL,最佳暗育时间为8 min,最佳曝光时间为20 min,在此条件下死菌DNA无扩增,而对活菌DNA扩增无影响;Psa质粒标准品建立的线性回归方程为Y=-3.2204x+37.73,R 2=0.9955,最低可检出6.39×102拷贝/μL的溃疡菌;建立的PMA-qPCR方法最低可检出2.38×102拷贝/μL的溃疡菌;采用人工染菌枝条样品的最低检出限为6.30×104 CFU/mL,与菌落计数检测结果相符.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2019(035)004【总页数】7页(P48-53,59)【关键词】PMA;qPCR;猕猴桃溃疡菌;活菌检测【作者】肖妍;刘芸宏;高贵田;曹凡;马燕萍;赵武奇;雷玉山【作者单位】陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;陕西省猕猴桃工程技术研究中心,陕西西安 710404;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119;陕西省猕猴桃工程技术研究中心,陕西西安 710404;陕西省农村科技开发中心,陕西西安 710054【正文语种】中文猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa)引起的细菌性病害[1]，严重影响猕猴桃产业的发展。
猕猴桃溃疡病病原菌的鉴定及生防菌的筛选
2021年34卷4期Vol.34No.4西"农业学&Southwest China Journal of Agricultural Sciences755文章编号：1001-4829(2021)4-0755-07DOI:10.16213/kb scjas.2021.4.011狒猴桃溃疡病病原菌的鉴定及生防菌的筛选杜贞娜，晏子英，候忠余，李树江，张晓勇，杨友联(六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州六盘水553004)摘要：！目的】探明獄猴桃溃疡病的致病病原，为该病的生物疗诒提供有效的菌种资源。
【方法】采用常规组织分离法从獄猴桃感染溃疡病的染病组织分离致病病原菌，从獄猴桃种植土壤和健康獄猴桃组织中分离细菌，采用抑菌圈法筛选拮抗菌株，通过-态学与分子生物学相结S的方法对分离的菌株进行鉴定。
【结果】从獄猴桃感染溃疡病的染病组织中分离到9株菌株，经鉴定确定致病病原菌为丁香假单胞杆菌獄猴桃致病变种(Pseudomonas syringa e s>v.a；epgas%;从土壤和健康的獄猴桃组织分离到35株细菌，其中3株芽抱杆菌(BaciPus e pp-对獄猴桃溃疡病病原菌具有较好拮抗效果，抑菌圈直径平均为20.8-23.7mm…［结论】为獄猴桃溃疡病生疗菌剂的开发应用奠定了基础&关键词：獄猴桃；溃疡病；病原菌;拮抗真菌；生物疗诒；分子生物学鉴定；天盘水；贵州中图分类号:S436-34.1+2文献标识码：AIsolation and Hentification of Patiogen Causing Canker andScreemng of Biocontrol Bacteria in KiwifruinDU Zhen-na,YAN ZTying,HOU Zhong-yu,LI Shu-jiang,ZHANG Xiao-yong,YANG You-lian*(Colleve of Biological Sciences and Technology,Liupanshul Normal University,Guizhou Liupanshui553004,China)Abstract:【Objecfve】The peesentpapeeaimed toeeeieypathogenicbacteeiaoekiwieeuitcankeeand peoeidee e e ctieesteain eesoueceseoebio-logical control against kiwWruit canker-【Method]The pathogenic bacteria were isolated from infected bsucs of kiwifruit plan—infected with canker by a convention tissue isolation method.The antagonbtic strains were screened from the bacteria isolated from soil and heal—y kl-wbruit tissues by an inhibition zone method.The isolated antagonis/c r—ains were identified by morphology and molecular biology methods-【Result]9strains isolated from the infected tissues of kiwifmit plants infected with canker were identified as Pseudomonae38x050pv.Ac-tinidae.35strains were isolated from soil and healthy kiwWruit tissues.3screened Bacillus strains had the good antagonism e/ect against Pseudomooas syringa c pv.Actinidat and the average diameter of inhibiA/zone was20.8-23.7mm.【Conclusion]Three screened Bacillus strains lay a foundation As development and application of biological agents against kiwifmit cankes-Key words:KiwifmW；Canker；Pathogen；Antagonistic fungus,Biological control；Molecular biological identWicaCon；Liupanshul；Guizhou【研究意义］I猴桃(ActiniPP spp.)是一种经济价值极髙的水果，其中Vc含量非常丰富，每100y 果肉中含有Vc100〜420my,被誉为“水果之收稿日期：2019-06-23基金项目：贵州省教育厅特色重点实验室建设项目“贵州省特色农业种质资源开发与利用重点实验室”&黔教合KY(2017) 012］%国家级大学生创新创业项目“六盘水I猴桃溃疡病生防菌筛选研究”(201710977019)%六盘水科技局联合基金项目“I 猴桃内生真菌多样性及溃疡病生防菌筛选(52020-2018-04-02),2六盘水特色果树资源研究与利用重点实验室3(52020-2017-02-03)%六盘水师范学院科技创新团队项目2分子生物学与生物化学科技创新团队”(LPSSYKJTD201602号)作者简介：杜贞娜(1994-),女，E-mail：2820218998@qq.cm% *为通讯作者:杨友联(1975-),男，教授，博士,主要从事微生物学研究和教学,E-mail：yangyoulianl@163-com。
猕猴桃的研究
猕猴桃的植株是分为雌雄的，雄株多毛，而叶小，雄株花也较早 出现于雌花。然而雌株却少毛，或无毛，叶一大于雄花。猕猴桃的雌花和雄花来自雄株的花雌株的花
遗传转化的方法:根癌农杆菌或发根农杆菌介 导法、病毒介导法 、电激法、电注射法 、 LB法 、动态导入法、基因枪法、显微注射法、 超声波法、花粉管通道法 等
山茶目
命名者 ：
猕猴桃科
猕猴桃属
猕猴桃种
Yangtao Kiwifruit Planch
猕猴桃的分类、地理分布以及引种历史
﹛美味猕猴桃
猕猴桃的分类 中华猕猴桃
地理分布：中国是猕猴桃的原生中心，世界猕猴 桃原产地在湖北宜昌市夷陵区雾渡河镇；猕猴 桃生 于山坡林缘或灌丛中，有些园圃栽培。我 国长江流域以南各地，北 至西北、四川、河南 等地均有分布。
猕猴桃的形态特征：落叶藤本；枝褐色，有柔毛，髓
白色，层片状。叶近圆形或宽倒卵形，顶端钝圆或微凹，很少有小突 尖，基部圆形至心形，边缘有芒状小齿，表面有疏毛，背面密生灰白 色星状绒毛。花开时乳白色，后变黄色，单生或数朵生于叶腋。萼片5， 有淡棕色柔毛；花瓣5—6，有短爪；雄蕊多数，花药黄色；花柱丝状， 多数。浆果卵形成长圆形，横径约3厘米，密被黄棕色有分枝的长柔 毛．花期5—6月，果熟期8—10月。猕猴桃的大小和一个鸡蛋差不多 （约6厘米高、圆周约4.5至5.5厘米），一般是椭圆形的。深褐色并带 毛的表皮一般不食用。而其内则是呈亮绿色的果肉和一排黑色的种子。 猕猴桃的质地柔软，味道有时被描述为草莓、香蕉、凤梨三者的混合。
农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，自从技 术瓶颈被打破之后，农杆菌介导转化在单子叶植物中也 得到了广泛应用，其中水稻已经被当作模式植物进行研 究。
用微卫星DNA标记技术建立猕猴遗传检测方法及对群体遗传多样性的分析
用微卫星DNA标记技术建立猕猴遗传检测方法及对群体遗传多样性的分析随着生物学、医学和药学的发展,对标准化实验猕猴的需求量不断增加,建立并提供遗传背景清楚的标准化实验猕猴,将对生命科学研究结果的准确性和可靠性提供有力保障。
实验动物科学是生物医学乃至整个生命科学研究的基础和支撑条件,其发展和应用程度是衡量一个国家或地区科学技术水平高低的一个重要标志。
但是,从整体水平看,我国实验动物工作的发展还不平衡,标准化进程和水平也不一致,尤其是实验猕猴等大型实验动物,不管是资源丰厚程度,还是自身的研究力度都相当薄弱。
实验动物遗传质量监测是评价动物质量好坏的一个重要手段,其目的是为了验证各种动物品系应具有的遗传特性,检查是否存在杂合性、基因突变和遗传污染等,以确定被检对象是否符合该群体的生物学特性。
微卫星DNA标记技术由于其具有高度地灵敏性、特异性和多态性,方法简便、快速和廉价等特性,被广泛地应用到实验动物的遗传质量监测和遗传结构多样性分析中,是目前公认的物种遗传多样性评估的最佳分子遗传标记技术,也是实验动物遗传质量监测的重要手段。
本实验研究通过优化各猕猴微卫星DNA位点的复性温度和Mg2+浓度等PCR扩增反应体系条件,从100个位点中筛选出D1S1594、D1S533、D3S3045、D21S1246、D7S513、D6S493、D6S2419、D4S1645、D5S820、D5S1470、D5S1466、D14S255、D15S644、D10S611、D20S171、D12S372、D2S1333、D12S67、D2S146、D11S2002、D11S1352、D9S934、D17S1290、D17S791、D13S797、D18S536、D18S869、D19S571、D19S559和D16S403等30个具有多态性高、等位基因数多和染色体上分布均匀的微卫星DNA位点。
利用这30个多态性微卫星DNA位点对北京地区恒河猴种群的28只个体的遗传结构进行了监测分析,其等位基因数均在7条以上,最高的达到了11条。
猕猴桃根腐病研究进展
㊃综 述㊃收稿日期:2022-11-12基金项目:六盘水市猕猴桃果园根腐病发生规律调查与研究(黔农科创联盟合[2022]8号);乌蒙山区特色果园生草复合生产增效创新能力建设(黔科合服企[2021]2号);国家猕猴桃标准化种植示范区(S F Q -2020-49)㊂作者简介:汪志威(1987 ),男,湖北黄冈人;硕士研究生,农艺师,主要从事作物栽培与育种(E -m a i l :594344234@q q .c o m )㊂通讯作者:胡秋舲(1974 ),男,贵州六盘水人;正高级农艺师,主要从事猕猴桃生产及病虫害防治㊂猕猴桃根腐病研究进展汪志威, 李秀亚, 宋福兵, 胡秋舲(六盘水市农业科学研究院, 贵州六盘水553000)R e s e a r c hP r o gr e s s o nK i v i f r u i tR o o tR o t W A N GZ h i w e i ,L IX i u y a ,S O N GF u b i n g ,H U Q i u l i n g摘 要:猕猴桃根腐病是一种分布广㊁危害重㊁难防治的土传真菌病害,是猕猴桃生产上的主要限制因素之一,严重影响猕猴桃的产量和品质,导致猕猴桃衰败和利用年限缩短㊂本文主要从猕猴桃根腐病致病菌的种类㊁危害特点㊁发生原因㊁病原菌侵染过程及致病机理等对猕猴桃根腐病研究现状进行综述,并提出抗病育种和未来猕猴桃根腐病综合防治的研究方向㊂关键词: 猕猴桃;根腐病;危害特点;致病机理中图分类号: S 663.4 文献标志码: A 文章编号: 1008-2239(2024)01-0072-05猕猴桃隶属猕猴桃科(A c t i n i d i a c e a e)猕猴桃属(A c t i n i d i a L i n d l .)的藤本植物[1],目前已发现的有54个种,21个变种,共75个分类群[2]㊂中国是猕猴桃的起源中心,现有的54个种中,有52个为我国特有种或中心分布种[3]㊂2017年联合国粮食及农业组织(F A O )统计,全球有23个国家有猕猴桃种植记载,其中我国种植面积约25万h m 2,是世界其余国家猕猴桃种植面积的总和[4]㊂近年来,随着猕猴桃栽培面积的不断扩大及栽培时间的不断延长,猕猴桃根腐病危害日益严重[5],对猕猴桃产业健康发展构成严重威胁[6]㊂笔者对猕猴桃根腐病种类㊁发生原因㊁鉴定方法㊁侵染过程㊁致病机理及防控措施等方面进行综述,以期为今后猕猴桃抗根腐病种质资源筛选㊁抗根腐病分子机制研究以及抗根腐病分子育种提供科学依据㊂1 猕猴桃根腐病种类1.1 国外猕猴桃根腐病主要种类猕猴桃根腐病属真菌病害,主要危害猕猴桃根系,造成韧皮部腐败,导致猕猴桃根系吸收和运输营养及矿物质受阻,轻则导致猕猴桃地上部分生长不良,重则造成植株死亡㊂2013年,土耳其学者E r pe r 等[7]从患病猕猴桃根部分离出了10株真菌,通过接种试验,发现这10种真菌均能引起典型的根腐病症状,表明了猕猴桃根腐病致病菌不仅仅是某一种真菌㊂1987年,K r a u s z 等[8]在南卡罗来纳州猕猴桃果园采集到了治病菌,通过分离鉴定发现,该病为猕猴桃根腐病,并命名为C yl i n d r o c l a d i u m ㊂1991年,L a t o r r e 等[9]研究发现,在智利1~5年生的猕猴桃果园里,猕猴桃根腐病发生严重,经分离鉴定,确定了智利猕猴桃根腐病的致病菌为疫霉㊂2001年,Y o n gh w a n 等[10]从患有根腐病的猕猴桃根部分也分离出疫霉菌,并将该菌株接种到海沃德上进行致病性鉴定,结果显示,幼苗出现了与田间观察到的相似症状㊂2005年,S h i m i z u [11]也发现了由疫霉菌引起的猕猴桃根腐病㊂1.2 国内猕猴桃根腐病种类中国对猕猴桃根腐病研究起步较晚,并且研究人员较少㊂据文献记载,谭筱冰等[12]在1995年对猕猴桃根腐病展开研究,当时只知道该病是由真菌引起的,但并未对其进行分离鉴定㊂1997年黄亚军等[13]从广东省和平县猕猴桃根腐病病根,分离到两菌株,根据培养性状及形态特征,分别鉴定为:疫霉菌和镰刀菌,通过人工接种表明:疫霉菌有较强的致病力,镰刀菌是属于二次入侵者,并不能单独危害㊂1999年,王汝贤等[14]对陕西省猕猴桃根腐病调查鉴定发现,陕西省猕猴桃根腐病主要是疫霉菌㊂2017年,尉莹莹等[15]通过e f -l a 序列分析m t S S U 序列分析及柯赫氏法则确定导致软枣猕猴根腐病的病原菌为镰孢菌(F u s a r i u mc o mm u n e )㊂2018年,库永丽[16]研究发现,陕西眉县㊃27㊃汪志威等:猕猴桃根腐病研究进展 耕作与栽培 第44卷 第1期地区徐香猕猴桃根腐病致病菌为茄腐皮镰孢孢霉㊂王晓波[17]及刘青[18]研究发现,猕猴桃根腐还包括密环菌根腐病和白绢根腐病㊂总体上,我国有报道且能造成猕猴桃出现根腐病的病原菌种类主要有四大类,分别是疫霉菌㊁镰孢菌㊁蜜环菌及白绢菌㊂2猕猴桃根腐病危害特点张学武等[19]认为,猕猴桃根腐病从春季开始出现,初夏有些植株地上部分有症状表现,盛夏达到发病高峰,10月猕猴桃停止生长后该病也随之逐渐停止发展㊂根腐病对猕猴桃的危害主要在根部,表现在地面枝干及叶片上,不同种类对猕猴桃的危害不同㊂假蜜环菌根腐病主要为害根颈部和主根[18]㊂病原菌侵染根部后,从侵染部位向两边扩散蔓延㊂地下部分症状表现为,发病初期猕猴桃根颈部皮层出现黄褐色水渍状块状斑,随着发病程度的增加,根部皮层逐渐变黑,并且木质部也开始表现出病症变褐腐烂,继而根皮层逐渐腐烂脱落,后期导致整个根系变黑腐烂[17-18]㊂地上部分表现为,树体生长不良,树势弱,叶色小,叶色浅黄,新稍少而短,鸡爪枝多,严重时致部分枝条或整株死亡㊂疫霉根腐病是猕猴桃根腐病的主要病原菌之一,主要发生在猕猴桃旺盛生长的挂果季节[18],其侵染方式多样,既可以从根颈部或嫁接口处侵入还可以从根尖侵入㊂其症状表现为,病原菌较多从根尖侵染,然后蔓延至主根,被害部位呈现水渍状,褐色湿腐,腐烂后有酒糟味,病处长出絮状白色霉状物;感病后植株萌芽期延迟,叶片衰弱㊁枯萎,叶面积减少,梢尖死亡发病后植株在短期内便枯萎,病情发展迅速㊂白绢根腐病是造成苗期死亡的主要病害,植株一旦发病很难挽救,染病株根颈部有白色绢状物,叶片萎蔫,最后整株枯死[18]㊂一般只危害猕猴桃根颈部及其下部30c m内的主根,很少为害侧根和须根㊂3猕猴桃根腐病发生原因猕猴桃根是肉质根系,在生长过程中需氧量大[20],生长在不良环境,容易造成根系缺氧,须根大量死亡㊁腐烂,从而发生根腐病㊂有研究表明,引起猕猴桃根腐病的原因多样[18-21]㊂一是果园土壤质地黏重而干硬,透气性差,导致根系生长不良,从而引发根腐病㊂二是果园土壤缺乏有机质,不利于猕猴桃根系发育,从而引发根腐病㊂三是果园地下水位高,雨季积水严重,从而引发根腐病㊂四是果园p H值过高,铁元素被固定,果树不能正常吸收,造成缺铁,从而引发根腐病㊂五是果农进行农作时,造成根部受伤及果树挂果过多树势衰弱,从而引发根腐病㊂栽植过深,根系呼吸受阻,易导致根腐病㊂六是树体挂果量过大或连年使用大果灵,导致树势衰弱,抗性下降,易诱发根腐病㊂七是苗木带菌,栽种后植株处于感病状态,未得到及时治疗,导致发生根腐病㊂4猕猴桃根腐病分离鉴定方法鉴定方法不同可能会导致检测结果不一样,对植株发病情况也可能产生很大影响,甚至会对病原菌的致病性和筛选鉴定产生一定的偏差㊂好的鉴定方法,不仅可以快速准确地找到致病菌,还可以节约鉴定病菌所需时间,大大提高检测效率㊂猕猴桃根腐病病原菌的常规鉴定可分为大田鉴定和室内鉴定两种㊂由于大田鉴定影响因素较多,难以控制,所以目前对猕猴桃根腐病的鉴定较多采用室内鉴定法㊂室内鉴定一般先分离纯化得到纯种病原菌,然后再开展活体接种试验㊂4.1病原菌分离方法目前,常用的猕猴桃根腐病分离方法是采用植物坏死组织来分离病原菌㊂1988年,中国学者吕中平[22]在翻译美国学者K r a u s z的‘P l a n tD i s e a s e“一书里面提到:美国科学家用带病根块进行病原的分离,再通过培养基培养得到纯种菌株,再进行接种试验,得到猕猴桃根腐病的致病菌㊂尉莹莹等[15]采用组织分离法从茎上部的维管束组织分离病菌,再通过玻璃毛细管法单孢分离获得了纯化菌株㊂4.2病原菌鉴定方法猕猴桃根腐病鉴定主要有致病性鉴定㊁形态学鉴定和分子生物学鉴定3种方法㊂致病性鉴定主要是通过回接试验,观察植株是否表现典型的根腐病病症,来确定该病菌是否是猕猴桃根腐病病原菌㊂形态学鉴定主要是通过将纯化的根腐病病菌接种到培养基(培养液)上,再通过恒温培养,观察菌落形态㊁菌丝㊁菌丝膨大体㊁藏卵器㊁雄器和卵孢子的大小㊁形态以及着生位置,来确定该病菌种类㊂分子生物学鉴定是指通过分子生物学手段,进一步将病原菌基因扩增,与已知病原菌基因序列进行对比,精准地确定病原菌种类㊂致病性鉴定是确定病菌是否是猕猴桃根腐病的最直接方法之一,黄亚军等[23]通过回接试验发现,造成猕猴桃出现根腐病症状的病原菌有两种,后期通过孢子囊㊁有性器官等形态特征形态学鉴定,确定这两种致病菌分别为疫霉菌和镰刀菌;K r a y s z[8]通过取初次接种出现根腐病症状的病原菌,再次接种到正常猕猴桃植株上,再次出现了猕猴桃根腐病症状,后来通过形态学鉴定出该病原菌是丽赤壳属(C a l o n e c t r i a)的一种;为更精确地确定猕猴桃根腐病种类,蔚莹莹等[15]以出现根腐病症状的软枣猕猴桃为实验材料,通过分离培㊃37㊃耕作与栽培,2024,44(1):72-76.h t t p://g z z p.g z n y z y x y.c n T i l l a g e a n dC u l t i v a t i o n V o l.44 N o.01 F e b.2024养致病菌,挑取菌丝体提取基因组D N A,然后通过核苷酸序列的扩增和分析,最终较准确地确定了丹东软枣猕猴桃根腐病致病菌为F u s a r i u mc o mm u n e;毕晓琼等[24]对陕西省猕猴桃栽培区的根腐病进行多重P C R检测发现,陕西猕猴桃果园根腐病致病菌之一是疫霉菌,且疫霉菌有三种,分别为恶疫霉(P h y t o p h-t h o r a c a c t o r u m)㊁樟疫霉(P.c i n n a m o m i)和雪松疫霉(P.l a t e r a l i s)㊂4.3分级标准关于猕猴桃根腐病抗性评价指标方面,目前还没有统一的评价标准,通常根据成活率和病情指数等指标评价猕猴桃对根腐病抗病性的强弱,但由于划分标准不一,所得出的结果不同㊂现参考前人对大豆等[25-27]作物根腐病的分级标准,对猕猴桃根腐病做简单分级㊂根据猕猴桃根部发病情况,猕猴桃根腐病可采取0~5级标准评价:0级,根系生长健康,新生根较多,没有出现根腐病症状;1级,根系出现轻微伤害,并且出现根腐病病斑,但颜色较浅,为黄褐色,病斑面积小于20%;2级,根系生长不良,新生根减少,根部出现黄褐色病斑,病斑面积超过20%,低于40%;3级,根系明显出现危害症状,新生根明显减少,病斑颜色加深,变成黑褐色,并且病斑面积超过40%,低于60%;4级,根系生长严重受阻,新根少甚至没有新根,大部分根系被感染,且变为黑褐色,病斑面积超过60%,低于80%;5级,根系完全腐烂并变成黑褐色,病斑面积超过80%,几乎覆盖所有根系,植株新稍少且短,叶片小且卷曲,植株生长不良,甚至死亡㊂5病原菌侵染过程与致病机理5.1侵染过程当前对猕猴桃根腐病侵染猕猴桃的过程研究较少,但在其他植物上研究表明,病原菌首先通过皮孔㊁气孔㊁伤口等地方进入植株,然后在不同的部位通过不同方式入侵细胞㊂大部分学者认为,病原菌首先是吸附在植株根系表面,然后再通过细胞间隙或者穿透细胞等方式侵入细胞㊂C h r i s t i n aH a l l等[28]采用甲苯胺蓝染色法对侵染后的菌丝进行染色,发现分生孢子萌发后,在根周围形成广泛的菌丝网㊂康振生等研究禾谷镰刀菌(F u s a r i u m g r a m i n e a r u m)侵染小麦穗部的过程发现,病原菌首先在小麦穗部组织生长扩展,形成大量的的菌丝网,产生入侵菌丝,最后通过入侵菌丝直接入侵小麦组织,再以胞间和胞内生长两种方式在小麦穗部组织扩散㊂随着研究方法的不断发展,绿色荧光蛋白(G F P)基因标记技术被广泛运用到病原菌等侵染植物流程的研究当中㊂刘勇勤[29]采用绿色荧光标记技术回接感病香蕉发现,菌丝扩散有两种形式,一种是在细胞间隙之间无规则扩散,一种是细胞间扩散与细胞内生长结合一起扩散㊂有学者用绿色荧光蛋白基因标记技术研究草莓根腐病侵染草莓过程发现,孢子首先附着在根表面,然后再从芽管侵染根部,最后通过菌丝顶端产生吸盘状结构侵染草莓植株[30]㊂绿色荧光蛋白转化子技术也被用于研究大豆疫霉病[31]㊁马铃薯炭疽病[32]等病菌侵染过程㊂5.2致病机理猕猴桃根腐病属于真菌性病害,其致病过程需要经历受体识别及吸附㊁入侵受体㊁体内定殖㊁释放毒素及产生病害等㊂首先病原菌与猕猴桃根部识别,然后病原菌到达并附着在猕猴桃根表面,接着病原菌产生一系列的致病因子(如抑制寄主产生抗病反应的效应子㊁产生致病相关的酶和毒素等)从而侵入寄主内部,最后在猕猴桃体内定殖后释放毒素,最后出现根腐病病理反应㊂当病原菌吸附在植株表面时,植物细胞壁是否完整是影响病原菌与寄主识别㊁附着并顺利侵入寄主的第一道障碍,也是最重要的影响因子[33]㊂猕猴桃根腐病的细胞壁主要由几丁质㊁葡聚糖和糖蛋白构成,是根腐病与猕猴桃根互作的第一线场所[34]㊂真菌细胞壁本身不能感知外界刺激,而是通过包裹在细胞壁外围的大量糖蛋白来感知外界的刺激[35]㊂以香蕉枯萎病为实验菌株,通过基因编辑技术,敲除影响香蕉枯萎病细胞壁完整性的致病因子O c h1,结果使香蕉枯萎病细胞壁外层的糖基化蛋白显著减少,造成附着在植物细胞表面的能力显著降低,最终导致致病力明显降低[36]㊂还有人采用同样技术,敲除影响蛋白的糖基化从而影响细胞壁的完整性的致病因子G a s1,突变体对番茄的致病力和侵染能力显著下降[37]㊂当病原菌吸附在植株表面后,病原菌会产生一系列生理反应,分泌一些果胶酶㊁木聚糖酶等促进植物细胞壁降解的酶,加速植物细胞壁降解,从而突破植物第一道防线,帮助病菌穿透植物细胞壁进入植物细胞[38-39]㊂细胞壁降解酶是病原菌入侵植物的工具,在病原菌侵染过程中发挥着重要的作用㊂病原菌通常是分泌多种促进细胞壁降解的酶,来帮助病原菌完成入侵,单个细胞壁降解酶对致病力的影响并不明显,单独敲除某一种细胞壁降解酶基因,并不影响病原菌的致病力[40]㊂这可能是因为病原菌体编码细胞壁降解酶的基因分为注销基因和冗余基因,当主效基因被敲除或受到抑制时,相关冗余基因迅速表达,产生同样的酶㊃47㊃汪志威等:猕猴桃根腐病研究进展耕作与栽培第44卷第1期或者相同功能的酶,从而不影响致病菌的致病性㊂说明病原菌产生致病力的原因复杂多样,而且有的并不是由单基因决定的,而是多基因协同作用的结果㊂病原菌代谢产物也是病原菌产生致病性的重要因子之一,当病原菌侵入到寄主体内后,产生一些代谢产物,比如毒素,引起植株代谢㊁形态㊁组织等发生变化,最终导致植株死亡㊂如镰刀菌酸是镰刀菌产生的非专化性毒素[41],它可以促进细胞膜发生改变,增加细胞膜的通透性,从而加速病原菌的侵染进程㊂许文耀等[42]以过滤病菌后的香蕉枯萎病培养液浓缩液和纯镰刀菌酸接种健康香蕉,二者均导致香蕉出现了相同的枯萎病病理反应,当把二者浓度调高时,香蕉枯萎病病理反应加重,证明镰刀菌酸是造成香蕉枯萎的主要原因,并且浓度越大,病害越严重㊂6猕猴桃根腐病主要防控措施6.1加强田间管理,改进栽培方式土壤湿度是影响猕猴桃根腐病的一个重要因素,因此建园时应选择土壤透气性较好㊁地下水位低的地块,并且栽种前对地块进行消毒㊂在种植过程中,采用起垄或垄上垄的栽培方式,并且栽植不要过深,增施有机肥或腐熟的农家肥㊁磷肥和钾肥,提高猕猴桃的抗病和耐病能力;及时清除田间病株残体,以便减少土壤菌源和其他病原菌的侵入途径㊂6.2化学防治筛选合适的化学药剂,可以防治猕猴桃根腐病㊂张学武等[6]研究表明,用地菌净800倍液灌根防治猕猴桃根腐病效果较好,防效达67.7%,甲霜灵锰锌防效次之,防效为64.2%㊂邵阳[44]研究表明,向猕猴桃根围土施有益菌可有效防治猕猴桃根腐病㊂黄继魁[45]研究认为,使用5ʎB e石硫合剂封园后,5月使用40%多菌灵400倍液灌根2次,6月份用35%甲霜恶霉灵500倍液灌根2次,可有效防治猕猴桃根腐病㊂笔者通过2年研究表明,用5%咯菌腈㊁甲霜噁霉灵200倍㊁氨基酸1000倍㊁枯草芽苞杆菌200倍灌根,对防治猕猴桃根腐病效率达91.2%㊂6.3选用抗㊁耐性品种选育利用抗(耐)性品种仍然是防控猕猴桃根腐病的有效手段,抗病品种可在不影响或者较小程度影响作物的生产安全范围内有效控制病害,并且抗性基因可稳定遗传㊂选择有单一基因控制抗病性的品种,对病原菌具有较强的抗性,而且选择压力大,抗病效果好,可有效抵御病原菌侵染产生灾害,但是容易促进病原菌产生新的生理小种,导致原来的品种抗病性逐渐减弱,从而丧失抗性㊂选择具有多个抗性的单基因系的品种,在一定程度上可以延缓病原菌生理小种的产生,可以极大程度上延长作物品种抗性保持年限㊂另外,选育耐病性品种,也是提高猕猴桃抗根腐病的方法之一,但是耐病不等于抗病,有时也会发生病害,需要结合药物防治共同防治病害㊂参考文献:[1]W a r r i n g t o n I J,W e s t o nGC.K i w i f r u i t s:s c i e n c e a n d m a n a g e-m e n t[M].A u c k l a n d:R a y R i e h a r d s P u b l i s h e r,1990:183-204.[2]L i JQ,L iX W,S o e j a r t o dD.A c t i n i d i a c e a e[M].B e i j i n g:S c i-e n c eP r e s s,2007.[3]黄宏文.猕猴桃属分类资源驯化栽培[M].北京:科学出版社,2013.[4]方金豹,钟彩虹.新中国果树科学研究70年:猕猴桃[J].果树学报,2019,36(10):1352-1359.[5]宋晓斌,王培新,张星耀,等.陕西猕猴桃病虫害的调查与分析[J].西北林学院学报,1998,13(3):79-84.[6]张学武,韩建君,马松涛.猕猴桃根腐病发生规律及防治技术研究[J].西南林学院学报,2004,24(4):42-44.[7]E r p e r I,A g u s t i-B r i s a c hC,T u n a l iB,A r m e n g 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猕猴桃基因组DNA提取的研究
林智华;林程忠;梁红;周玲艳
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2009(037)003
【摘要】[目的]探讨猕猴桃属基因组总DNA的提取方法.[方法]以富含多糖和多酚次生代谢产物的猕猴桃为材料,比较不同品种在不同方法下的基因组DNA抽提效果,并对不同材料部位、抗氧化剂以及DNA纯化方法等对基因组DNA的获得进行研究.[结论]结果表明,以猕猴桃组培苗的茎部为材料,通过CTAB法,在裂解液中加入1%β-巯基乙醇,以及在异丙醇沉淀前加入1/2体积的5 mol/L NaCl,所得到的猕猴桃基因组DNA的质量较佳.[结论]该研究为今后猕猴桃分子生物学和基因工程研究奠定基础.
【总页数】3页(P996-998)
【作者】林智华;林程忠;梁红;周玲艳
【作者单位】仲恺农业工程学院生命科学学院,广东广州,510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广东广州,510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广东广
州,510225;仲恺农业工程学院生命科学学院,广东广州,510225
【正文语种】中文
【中图分类】S663.4
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