关于毛色基因的依赖性参与对行为特征的影响

关于毛色基因的依赖性参与对行为特征的影响赵秀英指导老师：巩元芳院系：动物科技学院专业：动物科学摘要：为了评价毛色表型的基因位点对行为特征的影响，我们详细地阐述了新的基因位点与社会探索行为的联系并检测了不同位点的每个等位基因对行为表达的影响。

我们使用的F2代小鼠是由DBA\2小鼠与ICR小鼠的F1代杂种交配获得。

其表型分析表明agouti与albino基因影响其行为特征。

以基因型为基础的分析表明新的探索性行为被位于agouti上的显性野生型等位基因频率的依赖方式所抑制，并不是因albino导致。

该等位基因的依赖性仅见于有色小鼠，albino小鼠并未发现。

目前的结果表明，agouti基因位点能够促进albino的野生型等位基因决定特定的行为特征。

它编码一个酪氨酸酶的结构基因。

关键词：agouti 位点；albino位点；新的探索行为；毛色；Laboratory小鼠1引言动物的驯化使人类的生活方式有了很大改变。

对于驯化过程来说，最重要的因素是动物对生活环境的适应。

因此，驯化被认为是动物的一种特性，它能使动物的一生以及其遗传因素重新成型。

虽然一些遗传改变会被涉及，但我们对于遗传基础的改变过程却知之甚少（罗森格伦·皮尔伯格等，2008）。

毛色（或毛发）与性情之间的关系就如同行为与情感特征的关系一样在许多物种中被报道过（Hemer，1990）。

目前已经发现小鼠很多基因参与其毛色表达。

其中某些基因已被克隆并且鉴定了对毛色表型的影响（杰克逊，1994）。

尤其是毛色表型可以被小鼠的多种基因型综合控制。

在个体中，这些基因在四个主要位点表现为常染色体显性遗传。

其主要影响黑色素的合成、色素合成来源以及黑色素细胞中黑色素的运输。

这些基因位点分别控制的毛色是野灰色（A-：野生型等位基因控制个体带状黑毛；aa；隐性纯合等位基因控制非带状黑毛），褐色（B-：野生型等位基因产生黑色真黑素；bb：隐性纯合等位基因产生棕色真黑素），白化（C-：有色的；cc：隐性纯合等位基因导致白化病），以及淡灰（D-：野生型等位基因；dd：隐性纯合等位基因对毛色有淡化作用，使毛的表层整体“受到侵蚀”）。

后代的毛色表型可以通过基因杂交推测出来。

在驯服的动物中，人们把大部分注意力集中在决定毛色深浅的基因上，包括狐狸（基勒等人，1968），大鼠（考特和布莱斯，1987）以及鹿、老鼠（海森，1997）。

调查结果表明动物的隐性纯合非带状等位基因（aa）比与之对应占有优势的野生型带状等位基因，即野生型毛色，更易控制。

进一步说，在特定品系的小鼠中，野生型带状等位基因所编码信号蛋白（ASP）的异位过度表现会导致饲养行为（Fan等人，1997）和应激反应（哈里斯等人，2001；Bazhan等人，2004）。

除了决定毛色深浅的基因外，其他基因位点，特别是淡化毛色的基因（卡扎拉和格利特，1977）和白化基因（温斯顿等人，1967；阿比轮和克洛斯，1968；泰森等人，1970；罗迪斯和亨利，1977；卡扎拉和格利特，1979；卡茨和多伊尔，1981；乐佩普和拉萨尔，1986）对很多行为特征发挥多效性影响。

因此，控制毛色表型的基因位点是影响动物个体性情或行为特征的重要遗传因素。

但是每一个位点的个体基因型在行为表现中的反应仍然不清楚。

在本实验中，我们重点关注小鼠新的社会探索行为并测定基因位点与其行为模式的联系。

然后，检测出与行为表达有关的不同位点对每个基因型的影响。

图1. F2代的毛色表型，通过携带野生型agouti毛色的F1代雌雄小鼠交配获得，近交系DBA/2小鼠和封闭群albino ICR小鼠杂交所形成。

2材料与方法2.1实验动物和繁育过程所有实验根据动物实验准则进行。

从日本SLC公司购入近交系雄性DBA/2CrSlc小鼠（基因型：aa bb CC dd）与封闭群雌性albino Slc:ICR小鼠，10周龄。

育种房间温度保持在23±1℃，光暗周期为14h 光\10h 暗（06:00开灯）。

两种小鼠被安置在有寝具的笼子里。

并在笼中提供了饲料和水供其自由采食。

当它们12周龄时，ICR 雌鼠与DBA/2雄鼠交配，其后代表现两种不同类型的毛色即agouti（Aa）和non-agouti （aa）。

agouti毛色的F1代杂种雌鼠和与其具有相同显性毛色的雄鼠在12月龄时随机交配以获得所有的毛色表型。

这些毛色表型在下一代受四个主要基因位点的独立控制。

原则上，将出生3天后的幼崽不论毛色每8只调整到一窝，21日龄断奶。

由此，我们从F2代小鼠中获得了112只雄鼠和9种不同类型的毛色（图1）。

这些小鼠群养（3-4只/笼）到8周龄，然后个别安置。

接下来，动物从育种室移到行为分析室，并保持14h光/10h暗周期（12：00关灯）使其熟悉新环境。

经过一周的适应，进行13:00-16:00的昏暗光照明后，其行为测试描述如下。

2.2新的社会探索性行为测定使用40厘米高的墙和深棕色不透明丙烯作成的60×45cm开放的试验台，其中心放置一个直径为11.4厘米高度为20.5厘米的圆柱管，下半部分用带有许多小洞的不锈钢材料制作，上半部分用透明的丙烯酸板制成。

每只F2代的小鼠被放在实验台的一侧，使其熟悉测试环境3分钟。

在我们的实验室中，由一种杂交生物群体的dd品系鼠作非亲缘交配产生的一只实验鼠在5～7周龄去势，然后把它放在圆柱形管上。

用数字视频摄像机记录新的探索行为和社会互动5分钟。

其分析如下，社会行为的开始标志：第一时间积极靠近社会伙伴（即其它小鼠）。

社会行为：在5分钟测试内跟踪和嗅探伙伴的频率和累计时间。

这些行为参数被认为是社会合作伙伴的指导活动。

试探性教养行为：用后腿的频率和累计饲养时间。

自我刷拭：用前腿刷拭鼻区的频率。

这些行为参数被认为是非合作伙伴的指导活动。

记录这些之后，将小鼠转移回它们所生活的笼子。

并用35%的异丙醇立即清洗测试区域。

行为测试每天进行6次，每次间隔15-20分钟，在进行最后一次测试的一周后，将每只小鼠的整个大脑取出，称重并保存在-80℃环境中。

2.3基因组DNA的制备借助于PCR的基因分型技术，并使用浸泡在100 ng/µlPH值为8.0的TE buffer 中的向导基因组DNA纯化试剂盒（Promega Corporation，Madison，WI）。

从10-20毫克的延髓中提取出基因组DNA。

TE buffer可根据制造商的指导适当作一些修改并通过分光光度法进行量化。

2.4 agouti 和albino 的基因分型程序编码小鼠谷草转氨酶（ASP）的基因有4个外显子和一个包含11KB反转录转座子的损失功能的等位基因（non-agouti等位基因）构成。

此反转录转座子序列位于第一与第二外显子间的内含子中（Bultman 等，1994）。

因此，下面的野生型agouti 和non-agouti alleles 的PCR引物使用Primer3引物设计工具设计（http://www.bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi）；一个共同的正向引物，5′-GCCACACTTAGGGAGTTCACA-3′；野生型agouti等位基因的反向引物，5′-GGTTGGCCACCATGTCTAGT-3′；野生型non-agouti的反向引物，5′-GCTCTGGTCTGTGTGTGCTTTCA-3′（Ensembl Gene ID: ENSMUSG00000027596，图2）。

1µl基因组DNA，10µlPCR Platinum® 混合液（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）与0.5µm 的等位基因特异性引物混合于200µlPCR 反应管中，装上热循环仪进行PCR 反应表达（Px2；Thermo Hybaid，Ashford，UK）。

反应过程：95 ℃变性5 分钟变性30 秒57 ℃退火30 秒72 ℃缓冲60 秒进行40 个循环72 ℃延伸10 分钟PCR 产物在1% 的TBEbuffer和可视化的嗅化二氨乙苯啡啶的2%琼脂糖凝胶中电泳。

位于albino locus 上的野生型等位基因编码酪氨酸酶基因。

在对albino BALB/c 小鼠的酪氨酸酶基因的测序中发现一个点突变（G→C颠换），这个点突变位于第387个核苷酸上。

它创造了一个新的DdeI限制性的内切点（shibahara等，1990）。

以下野生型酪氨酸酶基因和突变等位基因的引物旨在扩大含有限制性内切点的区域（DdeI site）：正向，5′-TCAGGCAACTTCATGGGTTT-3′；反向，5′-GCCTGTGGGGATGACATAGA-3′（Ensembl Gene ID: ENSMUSG00000004651，图3）。

反应过程：95℃变性5分钟变性30秒57℃退火30秒72℃缓冲60秒进行40个循环72℃延伸10分钟在基因扩增之后，取10µl的反应产物，用1µl（10单位）的DdeI酶（R0175S；New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA）在5µl的NEbuffer和34µl不含蒸馏水的血清中消化4小时，维持温度为37℃。

消化后，酶在65℃时失活的潜伏期为20分钟。

消化产物在可视化的嗅化二氨乙苯啡啶与1×TBEbuffer 中的4%琼脂糖凝胶（NuSieve® 3:1 Agarose，Lonza，Rockland，ME）中电泳。

图2. 小鼠野生型agouti和non-agouti等位基因的基因结构示意图与以PCR为基础的基因分型图。

（A）4个外显子作为开放阅读框（灰色部分：蛋白质编码区域）。

在non-agouti等位基因插入的一段11-kb的反转录转座子用一条长的阴影线代表。

引物位置表示如下：（a）共同的正向引物，（b）野生型agouti的反向引物，（c）non-agouti的（Ensembl Gene ID: ENSMUSG00000027596）。

（B）纯合子小鼠野生型agouti等位基因（AA）、non-agouti等位基因（aa）与杂合子小鼠（Aa）的有代表性的多重PCR结果。

PCR扩增子的凝胶电泳结果表明每个引物组合的特异性。

M；DNA 大小水平在100bp的增量中有100-1000bp（100bp分子标尺，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）图3. 小鼠野生型酪氨酸酶基因（外显子1的一部分）序列示意图与以PCR为基础的基因分型图。

（A）albino小鼠的点突变位置（G→C颠换）用箭头只在第387个核苷酸，并创造了新的Ddei位点。