江苏省床边快速诊断(POCT)工程技术研究中心
体外诊断研究报告
体外诊断研究报告体外诊断，这个在医疗领域中日益重要的名词，正逐渐改变着疾病诊断和医疗保健的方式。
它是指在人体之外，通过对人体样本（如血液、尿液、脑脊液等）进行检测分析，从而获取有关健康状况和疾病信息的诊断方法。
体外诊断的重要性不言而喻。
在疾病的早期诊断中，它往往能够发挥关键作用。
通过对体内各种生物标志物的检测，能够在症状尚未明显时就发现潜在的健康问题，为及时治疗争取宝贵的时间。
例如，肿瘤标志物的检测可以帮助早期发现癌症，血糖、血脂的检测有助于诊断糖尿病和心血管疾病等。
体外诊断技术的发展经历了多个阶段。
从早期的简单化学分析方法，到如今高度自动化、集成化的仪器设备和复杂的分子诊断技术，其进步可谓是日新月异。
化学发光免疫分析技术是目前应用较为广泛的一种体外诊断技术。
它具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点。
通过化学反应产生的光信号来检测样本中的目标物质，能够实现对微量物质的精确测定。
分子诊断技术则是近年来发展最为迅速的领域之一。
它以核酸（DNA 和 RNA）为检测对象，能够从基因水平揭示疾病的发生机制和发展趋势。
例如，聚合酶链式反应（PCR）技术可以快速扩增特定的DNA 片段，用于病原体的检测和基因变异的分析。
此外，还有即时检测（POCT）技术，具有操作简便、快速出结果等特点，适用于床边检测和现场快速诊断。
体外诊断市场规模也在不断扩大。
随着人们对健康的重视程度不断提高，以及医疗技术的不断进步，对体外诊断产品的需求持续增长。
全球体外诊断市场呈现出稳步上升的趋势，而在国内，市场也在迅速崛起。
然而，体外诊断行业也面临着一些挑战。
首先是技术创新的压力。
为了满足临床对诊断准确性和灵敏度的更高要求，需要不断投入研发资源，推动技术的升级换代。
其次是质量控制的问题。
诊断结果的准确性直接关系到患者的治疗方案和预后，因此对产品质量的把控至关重要。
再者，市场竞争日益激烈，企业需要不断提升自身的竞争力，以在市场中占据一席之地。
检验医学的新领域——床边检验POCT
ｍｍ×１８
ｍｉｌｌ的盖玻片后镜检。细胞数取１０个高倍视野所见的最低和最高值，管型取２０个低倍 视野平均值报告。将红细胞数在０—３／ＨＰ和白细胞数在 ０．５，ＨＰ的范围内视为正常尿…。
２
方法 按仪器操作说明吸取混匀的新鲜尿液ｌＯ ｍｌ，用优
结果
３
利特ｌＯ项干化学试带沾取后在优利特一２００型尿液分析仪 上进行测定，之后标本离心沉淀（１
５００
０００例尿液经优利特一２００型尿液分析仪尿ｌＯ项测
ｒ／ｒａｉｎ）离心５
ｒａｉｎ，
定与尿沉渣显微镜镜检关系密切的检测结果（表１）。
弃去上清液，剩余沉淀０．２ ｍｌ，混匀后吸取２０斗ｌ，滴入
表１
３
０００例尿液千化学检测与显微镜检查结果比较
３讨论 １）亚硝酸盐（ＮＩＴ）是诊断细菌性尿路感染的过筛 试验【２１。当泌尿系统存在能够还原硝酸盐的细菌时，该 试验呈阳性反应。而有的细菌无此还原能力，该试验 呈阴性。故干化学法检测ＮＩＴ阴性并不能排除泌尿系细 菌感染的可能。统计结果显示干化学法检测ＮＩＴ假阴性
仪更先进。这是因为在大多数场合下，测试都是由未受 过训练的护士、医生及其他工作人员来操作，故仪器要 求减少一切可能带来误差的操作程序，通常只要求操作 者学会启动程序、进样及简单的键盘操作即可。 ３床边检验（ＰＯＣＴ）的质量控制 质量控制是ＰＯＣＴ应用的关键之一，通常由政府、各 医疗组织、临床检验中心或实验和仪器生产商共同完成。 政府部门对ＰＯＣＴ要有正确的认识，鼓励医院采用新 的测试方法。尽管目前不是所有的医院都有ＰＯＣＴ，但毕 竟是医院的一种选择。另一方面．政府还应制定出台相 关的法律、法规或规章，严惩造假者，以确保仪器质量。 质量管理的职责主要由临床检验中心或医院临床实 验室承担，包括对操作人员进行必要的培训，制定操作 规程和定期进行质量控制，并对反馈的数据进行统计处 理，评价各ＰＯＣＴ测试系统的可靠性及稳定性，为用户提 供质量指导。 产品质量主要由制造商来控制，医生在救治病人过 程中时间就是生命，为了提高救治成功率，不可能有时 间进行第二次测试来验证结果的可靠性，制造商必须致 力于产品性能的提高，确保产品质量的稳定性和可靠 性。另外，仪器的功能必须随着科学技术的发展与时俱 进，不断得到完善和提高，改进不利的操作因素。如传 统的血气分析仪在测试前往往预热时间较长，ＰＯＣＴ仪器 则不允许，因此，要么设法缩短预热时间，要么允许在 室温下测试。再如临床实验室可以采用血清样本，但 ＰＯＣＴ必须能直接分析全血，这样才能避免分析误差和节 约分析时间。 总之，确保病人的健康和安全才是ＰＯＣＴ管理的宗 旨。由于ＰＯＣＴ是近几年刚刚发展起来的，相关的管理还 有待进一步健全。在我国，人们还不了解ＰＯＣＴ的应用特 点，假如用ＰＯＣＴ设备来代替传统实验室设备，则应认为 是一种概念错误。因为ＰＯＣＴ设备的测量精度和分析量等
一文读懂POCT床边快速诊断：三家上市公司万孚生物、基蛋生物、明德生物
⼀⽂读懂POCT床边快速诊断：三家上市公司万孚⽣物、基蛋⽣物、明德⽣物免责说明：本⽂是个⼈复盘记录，不构成任何投资意见，⽂中提到的个股不做任何推荐。
股市有风险，投资需谨慎。
成功交易只能增加⾃信，只有失败才能使⼈精进。
顺着医保控费这⼀思路，作为⼩⾲菜的我观察到医院正在推进取消药品加成。
⽬前已经开始试点，部分复诊疾病和慢性病⽤药处⽅的有序外延，⽽这些外流的处⽅药最终都将由合规的连锁药店来进⾏承接。
医院砍掉了15%药品加成的收⼊后，将会切切实实影响医院的待遇⽔平。
⽽医疗器械和医药是天平的两端，药品加成被取消后，国家⿎励医院提⾼服务性收费，那么医⽣就会倾向于让病⼈住院、做CT检查、⼼电图、抽⾎或者⼿术。
这就刺激了医疗器械⾏业的⾼速增长，⽽体外诊断产业IVD则是医疗器械⾏业细分⾥，最具商业价值、利润较⾼、监管宽松同时增速最⾼的⾏业。
以上就是我近期从⾏业⾓度做的选股思路分享，⽤巴菲特的话来说就是：“⼈⽣就像滚雪球，最重要之事是发现厚厚的雪和长长的⼭坡。
”体外诊断⾏业再继续细分下去的话，床边快速诊断（POCT）⼜是IVD ⾏业增速最快的细分领域。
在这条快车道⾥，国内A股的上市公司有三家分别是，万孚⽣物、基蛋⽣物、明德⽣物。
这三家上市公司各⾃的优势、基本⾯情况、以及预期的发展将会如何，这就是本⽂要分析的重点，相信看完后会对投资具有极⼤的参考价值。
POCT⾏业介绍与其他体外诊断产品相⽐，POCT 产品具有三个⽅⾯的鲜明特⾊：1. 检测时间：POCT产品缩短了从样本采集、检测到结果报告的检测周期；2. 检测空间: POCT 属于在被检测对象⾝边的检测；3. 检测的操作者: POCT 的操作者可以是⾮专业检验师，甚⾄是被检测对象本⼈。
POCT（Point of Care Testing，即时检测）就是以后⼈⼿都有⼀个检验科⼩的集成化的智能设备，可以随时随地做检测，没有必要到医院排队抽⾎等结果。
譬如怀孕，买⼀个尿条在家⾥⾯就可以⾃⼰测试，⼀分钟不到就可以出现结果阳性还是阴性。
POCT(即时诊断)行业研究报告
POCT(即时诊断)行业研究报告POCT（即时诊断）行业研究报告近年来，POCT（即时诊断）技术的快速发展，为医疗行业带来了巨大的变革。
POCT是指在临床现场进行的即时检测，可用于快速诊断、监测和治疗。
本文将对POCT行业的发展现状以及未来趋势进行研究。
POCT技术的发展源于对即时诊断的迫切需求。
传统的诊断方法需要将样本送至实验室进行分析，整个过程费时费力。
而POCT技术可以将检测设备直接放置在临床现场，将分析结果即时呈现给医生，极大地提高了诊断的效率和准确性。
在POCT行业发展的初期，主要应用领域是临床血液检测。
随着技术的不断创新和突破，POCT已经扩展到血液、尿液、体液、呼吸道和遗传物质等多个领域。
例如，POCT现在可以用于心肌梗死、传染性疾病、肿瘤标志物等多种病症的快速检测。
POCT行业的发展不仅受益于技术进步，也得益于政策法规的支持。
各国政府和卫生部门纷纷推出支持POCT技术的政策，鼓励医疗机构和企业投资研发。
这些政策有助于推动POCT技术的快速应用和普及，促进了整个行业的发展。
与传统诊断方法相比，POCT技术具有多个优势。
首先，POCT技术可以重塑医疗的时间线。
传统检测需要等待几小时甚至几天才能得到结果，而POCT检测只需几分钟甚至几秒钟。
这种即时诊断的特点可以对急诊患者进行快速救治，提高生命救治率。
其次，POCT技术的检测设备小巧便携，可以方便地用于各个医疗环境和场所。
另外，POCT技术还具有高度的准确性和灵敏度，有助于提高诊断效果和治疗质量。
然而，POCT行业也面临一些挑战。
首先是技术标准和质量控制。
由于POCT设备和试剂的种类众多，质量参差不齐，标准和监管的建设相对滞后。
其次是成本问题。
POCT设备和试剂的价格相对较高，对医疗机构的投资成本较大。
此外，POCT技术的推广和应用还需要更多的临床验证和实践经验支持。
未来，POCT行业将面临巨大的发展机遇。
随着人们对健康的关注度提高，对即时诊断的需求也将增加。
POCT在心血管疾病诊断中的应用
POCT在心血管疾病诊断中的应用心血管疾病，简称“心梗”，是我国乃至全球范围内导致死亡的主要原因。
随着医疗技术的不断发展，心血管疾病的早期诊断和治疗变得日益重要。
在此背景下，床边快速检测（POCT）技术应运而生，并在心血管疾病诊断中发挥着重要作用。
POCT技术是指在医疗机构中非实验室环境中，通过便携式检测设备，为临床医生提供快速、准确的检测结果，以便于医生对患者病情作出及时判断和处理。
近年来，随着生物传感技术、分子诊断技术等方面的突破，POCT技术在心血管疾病诊断领域得到了广泛应用。
POCT在心血管疾病急性发作时的诊断具有重要意义。
例如，在急性心肌梗死（AMI）的诊断中，传统的血清心肌标志物检测方法需要12小时才能得到结果，而POCT设备可以在短短1530分钟内检测出心肌肌钙蛋白I（cTnI）或心肌肌钙蛋白T（cTnT），从而为医生提供快速诊断依据，及时采取救治措施。
POCT技术在心血管疾病的风险评估和干预策略制定方面发挥着重要作用。
例如，在冠心病患者中，通过POCT设备快速检测血脂、血糖等指标，可以帮助医生评估患者心血管疾病的风险，并根据检测结果制定个性化的治疗方案。
对于心血管疾病的慢性患者，POCT设备可以实现对病情进展的实时监测，以便于医生调整治疗措施。
POCT技术在心血管疾病诊断中的应用还体现在手术术中和术后监护方面。
例如，在心脏手术中，医生可以通过POCT设备实时监测患者的心肌损伤程度、出血情况等指标，以确保手术顺利进行。
在手术术后，POCT设备可以继续监测患者的心血管状况，及时发现并处理可能的并发症。
1. 便捷性：POCT设备体积小巧、重量轻，便于携带和操作，可以在床边或家庭环境下进行检测，为患者提供更加便捷的医疗服务。
2. 时效性：POCT技术可以在短时间内获得检测结果，有利于医生快速作出决策，提高救治效率。
3. 安全性：POCT设备采用一次性使用耗材，降低了交叉感染的风险。
同时，POCT检测过程中无需复杂操作，降低了医疗事故的发生概率。
医疗机构快速检测(POCT)管理制度及法律规范
医疗机构快速检测〔POCT〕治理制度及法律标准治理总则第一条、为了标准和强化现场快速检测〔Point-of-care testing，POCT〕医学装备(以下简称POCT)治理，促进POCT 在医院内合理配置、平安有效利用，充分发挥使用价值，保证医疗卫生事业健康开展，依据有关法律法规，制定本建议。
第二条、POCT 是指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方法。
该检测方法在医院内广泛应用于急诊科、病房、重症监护科、心内科、内分泌科、呼吸科等各个临床科室。
医疗机构内使用的POCT 因直接作用于诊疗行为，存在诊疗程序、效果和法律等问题，有别于院外治理。
第三条、开展POCT 的目的：缩短诊疗的时间，提供能满足临床需求的、可信的、低本钱的、并能即时反响病人情况的POCT 检测装备平台。
第四条、开展POCT 的科室和人员需接受医院相关部门的认可和质量督导，检测人员必须接受相关的培训、并且有考核记录，考核合格者可以上岗。
不合格者必须重新培训直至合格，否则将被取消开展现场快速检测的资格。
快速检测〔point-of-care testing, POCT〕是利用便携式装备直接在最贴近病人的地点完成标本采集、检测和结果汇报等整个流程的检验。
POCT具有检验周转时间短和方便有用的优点，但由于是分散检测，假设操作不够标准和质量操纵把握不好，检验结果的精确性将大受影响。
为此，根据《执业医师法》、《医疗废物治理条例》、《医疗机构临床实验室治理方法》、《即时检测质量和能力的要求》和《医学实验室质量和能力的专用要求》等制定本标准。
医疗机构开展的POCT，必须按照本标准的要求，做好全面质量治理。
一、组织领导〔一〕各级卫生行政部门负责领导、监督和检查辖区内的医疗机构POCT质量治理工作。
〔二〕市卫生厅托付各区临床检验中心对全区医疗机构POCT质量治理工作进行技术指导，指导内容包含：〔1〕培训考核；〔2〕质量操纵；〔3〕验证和推举适当的POCT工程、仪器、方法。
床旁快速检测,POCT简介,
POCT方式给临床医疗带来的效益
缩短治疗周期、改进治疗 效果和提高医疗效率；减 少患者就诊等待时间
快速
POCT
降低再就诊率戒再 住院率，提高患者 的生命质量
床旁
简便
不受场所和操作人员 限制，提高医生和患 者满意度
中国POCT发展趋势
杨振华教授（前任国家临床检验中心主 任）认为： “将来的检验将更接近患者并分布在整 个医院和社区门诊部，美国在近期多到 80％的实验室工作将在距离患者只有几 步远的仪器上完成，即POCT的快速检 测。”
testing）等，最常用的是POCT，即我们所说的床旁检测
主要内容 POCT与中心实验室 POCT 相对中心实验室的特点
国家863重大项目申报指南
新型临床即时检验分 析仪器试剂一体化检 测系统的研制
863计划立项项目过程管理交流研讨会
体外诊断技术 产品开发
主要内容
POCT的政策环境
相关规定：临床科室检查费用比例要求达到17%以上；
卫医政发2009-50号《急诊科建设与管理指南（试行）》 急诊科室仪器设备：配备快速床边检测设备；急诊医师技术和技能要 求：熟练使用快速床旁检验（POCT）技术；
自上世纪末的3～5年间，POCT已遍及浙江省城乡各级医院，为全面 加强省内各级医院POCT的监督管理，自2003年起浙江省卫生厅已将 此项目纳入《浙江省综合性医院评审标准》。
POCT目前尚无确切的中文解释，宽泛地说是指近患者床旁进行的一种快速检 测分析技术，它能在床旁、病房或中心实验室之外的其他地方开展。
床旁检测是检验医学发展的一种新趋势，国外对其有多种表述，如床边检测 （bed side testing），家庭检验（home use testing），实验室外检
基于CRISPR
第38卷第2期2024年3月山东理工大学学报(自然科学版)Journal of Shandong University of Technology(Natural Science Edition)Vol.38No.2Mar.2024收稿日期:20230301基金项目:江苏省高校 青蓝工程 项目(2023);江苏省高职院校青年教师企业实践项目(2021QYSJ063);江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学)开放课题(SDGC2239)第一作者:谢钰珍,女,295842442@;通信作者:覃鸿妮,女,qinhn@文章编号:1672-6197(2024)02-0067-06基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株谢钰珍1,覃鸿妮1,2,吴凡1,孙曙光1,孟丽君3(1.苏州工业园区服务外包职业学院生物科技学院,江苏苏州215123;2.江苏省精准诊疗药物创制工程研究中心(苏州大学),江苏苏州215000;3.苏州东岭生物技术有限公司,江苏苏州215123)摘要:利用CRISPR /Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD -L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP )序列,构建含有PD -L1-GFP 报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株㊂根据CRISPR -Cas9靶点设计原则,针对PD -L1基因终止密码子设计两对sgRNA ,退火形成双链后连接至Lenti -V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证㊂对于正确的Lenti -V2-sgRNA 重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率㊂根据靶点位置设计左同源臂+GFP +右同源臂序列合成Donor 片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证㊂将验证成功的Lenti -V2-sgRNA 和pUC19-donor -GFP 共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP 表达情况,菌落PCR 及基因测序验证GFP 报告基因的靶向插入效果㊂经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD -L1的Cas9载体Lenti -V2-gRNA 和含GFP 基因的Donor 质粒pUC19-donor -GFP 构建成功㊂两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察㊁多克隆验证㊁单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP 成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR 均检测到特异条带,表明在PD -L1终止密码子前成功插入了GFP 片段,细胞株构建成功㊂通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD -L1-GFP 报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD -L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂关键词:PD -L1;CRISPR /Cas9;报告基因;GFP 中图分类号:TB532.1;TB553文献标志码:AConstruction of HT29cell line with PD -L1-GFPreport gene by CRISPR /Cas9systemXIE Yuzhen 1,QIN Hongni 1,2,WU Fan 1,SUN Shuguang 1,MENG Lijun 3(1.School of Biotechnology,Suzhou Industrial Park Institute of Services Outsourcing,Suzhou 215123,China;2.Jiangsu Province Engineering Research Center of Precision Diagnostics and Therapeutics Development,Soochow University,Suzhou 215000,China;3.Suzhou Dongling Biotechnology Company Limited,Suzhou 215123,China)Abstract :Using CRISPR /Cas9and homologous recombination technology to tap green fluorescent protein (GFP)sequence at specific position of PD -L1gene,we constructed human colon cancer cell (HT29)㊀stable cell line containing PD-L1-GFP reporter gene.According to the design principle of CRISPR-Cas9target,two pairs of sgRNAs were designed for the stop codon of PD-L1gene.After annealing,the sgRNAs were connected to the Lenti-V2plasmid.The plasmid was extracted and verified by sequencing after amplification of the receptor cells.For the correct Lenti-V2-gRNA recombinant plasmid,the effi-ciency of gene editing was verified by T7E1digestion.According to the target location,Donor fragment was synthesized from left homologous arm+GFP+right homologous arm sequence,which was ligated to pUC19after double enzyme digestion.Plasmid extraction and sequencing were also performed after re-combinant vector transformation and amplification.HT29cells were co-transfected with Lenti-V2-gRNA and pUC19-donor-GFP,and the expression of GFP protein was detected by fluorescence microscopy. Finally,the targeted insertion effect of GFP reporter gene was verified by colony PCR and gene sequen-cing.The Cas9vector Lenti-V2-gRNA and Donor plasmid pUC19-donor-GFP containing PD-L1were successfully constructed by enzyme digestion and sequencing.After the two recombinant plasmids were transfected into HT29cells,the results of microscopic observation,polyclonal verification,monoclonal screening and identification showed that GFP was successfully transferred into HT29cells and expressed, and the monoclonal cells screened by limited dilution method had uniform fluorescence.Moreover,com-pared with the control group,specific bands were detected in the genomic PCR of the clones of positive cells,indicating that the GFP fragment was successfully inserted before the PD-L1stop codon,and the cell line was successfully constructed.HT29colon cancer cell line with stable expression of PD-L1-GFP reporter gene was successfully constructed by gene editing technology,and a system was established to di-rectly observe whether PD-L1is expressed and the degree of expression,which laid a foundation for sub-sequent in vitro and in vivo screening of upstream new targets and drugs regulating PD-L1. Keywords:PD-L1;CRISPR/Cas9;reporter gene;GFP㊀㊀PD1(programmed death-1,程序性死亡受体-1)为PDCD1基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达于活化的免疫细胞表面,如T细胞㊁B细胞㊁NK细胞以及单核细胞等㊂PD1是维持自身耐受性的重要因子,在生理条件下可通过TCR识别抗原,调节外周组织中T细胞的功能,从而应对和清除外源病菌及内源异常细胞㊂PD-L1(程序性死亡配体-1)也称CD274,是PD1的配体之一,是由CD274基因编码的一种细胞表面糖蛋白,多过度表达于肿瘤细胞表面[1]㊂作为重要的负性免疫调节因子,当T细胞表面PD1受体与肿瘤细胞表面表达的PD-L1配体结合后,可向细胞内传递调控信号,抑制T细胞活化与增殖,从而帮助肿瘤细胞逃脱宿主的免疫监视,因此,抑制PD1/PD-L1通路或者通过特异性靶点抑制PD-L1蛋白的表达,可有效增强肿瘤治疗效果㊂近年来的临床研究结果显示,由PD1/PD-L1通路介导下的免疫抑制在非小细胞肺癌㊁胃癌㊁乳腺癌㊁大肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展中均具有重要作用,PD-L1在以上各种癌组织的表达明显升高,且PD-L1的阳性表达与肿瘤大小㊁转移情况㊁分化程度及远期生存率存在密切关系[2-3];此外,从诱导肿瘤细胞表面高表达PD-L1的相关因素来看,目前已报道的肿瘤细胞中调控PD-L1表达的相关信号通路主要有Akt3信号通路和MAPK信号通路㊁IFN-γ信号通路和AR信号通路[4],而且这些通路的某些抑制剂已被证明可调节PD-L1㊂例如:TGFβR-1抑制剂LY364947可明显降低TGFβR-1诱导的PD-L1mRNA和蛋白表达[5];突变转录因子FOXP3在PD-L1启动子区的结合位点后,胰腺癌细胞PD-L1的表达明显受到抑制[6];但关于结肠癌肿瘤细胞PD-L1表达的具体调控机制仍需进一步研究㊂CRISPR/Cas9系统是一种新型基因编辑技术,通过sgRNA介导核酸酶Cas9对基因组特定位点进行识别㊁切割,从而实现基因编辑,操作相对简便,基因编辑效率高㊂本文利用CRISPR/Cas9技术,在PD-L1基因终止密码子之前插入绿色荧光蛋白GFP基因,通过构建稳定表达PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞株HT29,旨在建立一个可直观观察细胞上PD-L1是否表达以及表达强弱的系统,为进一步研究结肠癌细胞中PD-L1表达的可能调控机制提供帮助,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定基础㊂86山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀1㊀材料与方法1.1㊀材料HT29细胞和293T细胞(苏州东岭生物技术有限公司保存),Lenti CRISPR V2质粒载体和pUC19载体(苏州东岭生物技术有限公司),胶回收试剂盒(Thermo),Stbl3感受态大肠杆菌(TransGen Biotech),DMEM培养基和D10培养基(HYclone), T4连接酶(Takara公司),DNA聚合酶(NEB)㊂1.2㊀方法1.2.1㊀sgRNA引物的设计与合成根据NCBI查询的PD-L1基因序列,使用CRISP在线设计工具(/E-CRISP/),根据靶点设计原则,在PD-L1基因终止密码子处设计sgRNA,并在序列正义链与反义链的5 端添加Esp3I(BsmBI)酶切位点,合成的具体序列如下:sgRNA-1:GAGGAGACGTAATCCAGCAT gRNA-1-F:CACCGAGGAGACGTAATCCAGCA gRNA-1-R:AAACATGCTGGATTACGTCTCCTC sgRNA-2:GTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-F:CACCGTCTCCTCCAAATGTGTATC gRNA-2-R:AAACGATACACATTTGGAGGAGA为检测突变是否成功,设置了一对检测引物,扩增产物为包含sgRNA靶点的基因组DNA片段,检测引物具体序列如下:Test-F:TGGGGGACAAGCCATCCCAA Test-R:ATGATTTGCTTGGAGGCTCC1.2.2㊀LentiV2-gRNA重组质粒的构建及鉴定根据所设计序列合成单链sgRNA,经梯度降温PCR退火形成双链sgRNA㊂退火结束后,将得到的双链gRNA连接到已用Esp3I酶切回收后的线性Lenti-V2空载质粒中,连接产物转化Stbl3感受态细胞,37ħ培养过夜后挑取阳性单克隆进行测序验证,测序引物:LKO1-5(GACTATCATATGCTTAC-CGT)㊂针对序列正确的单克隆,提取其对应菌液中的质粒DNA,即可得到正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒㊂1.2.3㊀pUC19-Donor-GFP重组质粒的构建及鉴定设计左同源臂+GFP+右同源臂序列,序列两端添加酶切位点XbaI/BamHI,送公司合成Donor片段,将合成的Donor片段㊁pUC19分别用XhaI和BamHI双酶切后连接㊂取10μL连接产物转化至50μL Stbl3感受态大肠杆菌中,37ħ培养1h 后,均匀涂在含有Amp的LB平板上,过夜培养㊂次日挑取6个克隆于4mL含有Amp的LB培养基中, 37ħ培养16h㊂16h后取1mL菌液抽提质粒,并对质粒进行菌落PCR,判断选取的单克隆中是否含有目的片段㊂将验证正确的质粒送至测序,测序引物:M13-R(CAGGAAACAGCTATGACC),测序正确后冻存菌种㊂1.2.4㊀细胞培养和细胞转染从-80ħ冰箱中取出冻存的HT29细胞,复苏结束后留2mol/L的细胞量在10cm培养皿中培养,隔天进行传代培养㊂培养至第4天时将HT29转移至24孔板中的2孔(一孔转染,一孔阴性对照),每孔0.5ˑ106细胞㊂转染前1~2h更换新鲜培养基(0.9mL/孔),按Lenti-V2-sgRNA(0.6μg)㊁Donor-GFP(0.4μg)㊁1mg/mL PEI(3μL)㊁DMEM(97μL)配制转染体系,室温孵育30min后,将混合液加入到1孔中,另一个孔无须加入,轻轻摇匀后放入培养箱培养(37ħ,5%CO2)㊂1.2.5㊀多克隆效果验证提取转染后的HT29细胞基因组DNA,利用在PD-L1基因组以及GFP上分别设计的上下游引物,对其进行PCR鉴定,以检测其中是否含有在PD-L1位点成功插入GFP片段的目的细胞㊂引物序列: PD-L1-F(TTCAAATTTATCATTTATCA),GFP-R (CCGGACACGCTGAACTTGTG),PCR体系:模板DNA10ng㊁PD-L1-F和GFP-R各1μL,2X PrimeSTAR HS DNA Polymerase MIX10μL,总体积20μL㊂PCR扩增程序:98ħ预变性20s,98ħ变性10s,55ħ退火5s,72ħ延伸35s,共30个循环,68ħ彻底延伸2min㊂扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析㊂1.2.6㊀单克隆细胞筛选转染72h后,观察细胞生长状况并计数,采用有限稀释法,用D10(10%的FBS+DMEM)按每200μL一个细胞稀释到96孔板中,培养24h 后,显微镜观察荧光及细胞状态,并做好标记㊂继续培养,当上一步标记的单克隆细胞密度达到80%后,消化并收集细胞,用基因组DNA抽提试剂盒提取基因组,作为检测引物(TestF㊁R)的扩增模板,最后将扩增产物送至公司测序,以检测PD-L1-GFP 报告基因是否插入成功㊂96第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株2㊀结果与分析2.1㊀Lenti -V2-gRNA 重组质粒构建结果重组质粒基因测序结果显示,在酶切位点之间插入的片段位置㊁方向以及序列与预期一致(图1),含有本实验所需要的两条sgRNA 序列,证明LentiV2-gRNA 重组质粒构建成功㊂2.2㊀两条sgRNA 切割效果验证结果为了验证所设计的两条sgRNA 的切割效果,将两种Lenti -V2-gRNA 重组质粒转入293T 细胞后提取基因组DNA,并对其进行T7E1酶切鉴定,结果显示1和2两种sgRNA 都能切下相应大小的条带(图2),证明Lenti -V2-sgR1和Lenti -V2-sgR2都具有切割效果,本实验随机使用其中1条,采用sgRNA2,即Lenti -V2-sgR2㊂图1㊀Lentiv2-gRNA重组质粒测序结果图2㊀T7E1酶切图2.3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒构建结果以挑选的6个单克隆为模板,经菌落PCR 均能扩增出目的片段(图3),说明菌落中含有目标质粒㊂将阳性质粒进一步送至金唯智测序,从图4可以看出,第一行的序列为测序结果,第二行的序列是所需的模板序列,序列比对完全正确,pUC19-Donor -GFP 质粒构建成功㊂2.4㊀Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 细胞转染结果㊀㊀将Lenti -V2-sgR2和pUC19-donor -GFP 转染至HT29细胞,72h 后荧光显微镜下观察细胞状态㊂由图5可知,培养72h后可观察到少量细胞表达绿注:1-6为随机挑取的6个单克隆,M 为DNA marker㊂图3㊀pUC19-Donor -GFP 重组质粒转化质粒菌落PCR 结果色荧光,证明GFP 成功转入HT29并进行了表达㊂2.5㊀PD -L1-GFP 报告基因工程细胞株阳性单克隆筛选结果2.5.1㊀多克隆效果验证结果图6为多克隆PCR 鉴定结果,可以发现实验组在200bp 位置有目的条带,而对照组没有,证明GFP 插入到指定位点㊂2.5.2㊀单克隆细胞筛选结果为将上述验证的插入正确GFP 序列位点的细胞挑选出来,将多克隆细胞进行单克隆筛选,图7为荧光显微镜观察结果,可以看到细胞形成了单克隆并且具有均一的荧光,可以进行后续的验证㊂7山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀图4㊀pUC19-Donor重组质粒测序结果(a)细胞图(b)荧光图图5㊀HT29细胞荧光蛋白表达为验证上述挑选的单克隆中所需的序列存在,对其基因组PCR 之后送至金唯智测序,图8显示与正常HT29细胞基因组相比,敲入的实验组所挑的单克隆在终止密码子前插入了GFP 片段,证明细胞系构建成功㊂3㊀讨论PD1表达于活化的免疫细胞表面,如B淋巴细图6㊀多克隆验证琼脂糖凝胶电泳图图7㊀单克隆细胞荧光状态图胞㊁CD4+T 细胞等㊂PD -L1作为PD1的配体之一,在癌组织上可见异常高表达,如肾癌㊁肝癌㊁肺癌㊁乳腺癌及卵巢癌等;但在肿瘤邻近的正常组织中低水平表达,提示它参与肿瘤发生发展,并在削弱抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用㊂PD1/PD -L1是负性共刺激分子,当肿瘤细胞表面的PD -L1与免疫细胞表面的PD1结合时,可抑制免疫细胞的增殖与活性甚至诱导其凋亡,使癌细胞成功逃脱免疫杀伤㊂近年来,PD -L1及其受体PD1信号通路一直是肿瘤免疫领域的热门研究对象,针对阻断PD1/PD -L1通路的单克隆抗体已然成为了肿瘤免疫治疗的明星产品,目前FDA 已经批准了五种PD -L1抑制剂㊂作为非特异性免疫治疗产品,PD -L1抑制剂的抗癌效应具有广谱性,且在不同癌症疾病中显示出了很好的治疗[7-11],但由于治疗过程中的原发性和获得性耐药,相当大比例的患者无法从中受益㊂相较于单药疗法,近年来越来越多的研究正向着PD1/PD -L1耐药机制研究以及联合用药靶点的筛选上转移[12]㊂在一些研究报道中,针对不同类型免疫检查点的联合疗法已被证明对几种肿瘤有效㊂例如:采用抗PD -1抑制剂抗体㊁抗CD137激动剂抗体和疫苗治疗的三联疗法可以显著增强胰腺导管腺癌的治疗效果[13-14];联合anti -PD -L1和anti -TIGIT 在临床上对转移性NSCLC 患者非常有效[15];增强ITCH 活17第2期㊀㊀㊀㊀㊀谢钰珍,等:基于CRISPR /Cas9基因编辑技术构建PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株性可促进PD -L1泛素化降解从而降低肿瘤细胞PD -L1表达,化合物AK087与MAPK 抑制剂联用可明显增强MAPK 靶向治疗黑色素瘤的效果[16]等㊂但对于其他大部分肿瘤来说,不同疗法治疗过程中肿瘤表面PD -L1的表达量变化情况及产生治疗抗性的关键机制,仍需进一步研究㊂注:斜体为GFP 片段,下划线为PDL1终止密码子,WT 为正常HT29测序序列,Knock -in clone 为实验组测序序列㊂图8 对照组和实验组序列对比图㊀㊀为了探究结肠癌细胞表面PD -L1表达的更多可能调控机制,本研究利用CRISPR /Cas9系统和同源重组的原理,通过两次转染将GFP 荧光基团成功插入到PD -L1基因终止密码子之前,成功构建了PD -L1-GFP 报告基因HT29细胞株,通过荧光信号直观观察细胞上PD -L1是否表达以及表达的强弱程度,为进一步研究结肠癌细胞中PD -L1表达的可能调控机制提供了材料,并为后期体内外筛选调控PD -L1的上游新靶点及药物奠定了基础㊂参考文献:[1]谢丽叶,付杰军,卢奕,等.PD1/PD -L1激活促进癌症发生㊁发展和转移的研究进展[J].肿瘤防治研究,2017,44(6):423-427.[2]车章洪.PD -1/PD -L1通路在肿瘤的发生发展过程中对T 细胞的活化作用研究进展[J].中国新药杂志,2017,26(16):1913-1917.[3]方宇,王海娟,李征洋,等.PD -L1和A2aR 在大肠癌中的表达及意义[J].河北医药,2021,43(3):345-348,352.[4]丰江舟,杨梦梦,朱彬彬,等.人PD -L1基因启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建[J].皖南医学院学报,2016,35(6):524-526.[5]柯佳,李卓伟,李超,等.TGF -β1对结肠癌SW620细胞及其PD -L1表达的影响[C]//中国解剖学会.中国解剖学会2019年年会论文文摘汇编.昆明:解剖学杂志编辑部,2019:182.[6]王秀超.胰腺癌肿瘤细胞PD -L1表达调控机制及联合干预实验研究[D].天津:天津医科大学,2017.[7]李青丽,唐瑶,李富丽,等.抗PD -L1抗体抑制小鼠非小细胞肺癌移植瘤的生长及其机制[J].肿瘤,2020,40(8):531-540.[8]孙晨,镡云辉,耿波,等.PD -1/PD -L1抑制剂在肾癌中的研究进展[J].国际外科学杂志,2020,47(9):639-643.[9]张丽娜,杨艳芳,姜战胜.PD -1/PD -L1抑制剂治疗三阴性乳腺癌的研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2021,28(8):844-849.[10]李一鑫,路丹.PD -1/PD -L1抑制剂治疗晚期卵巢癌的研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(15):2741-2744.[11]陈茜,周建英,黎扬斯.抗PD -1/PD -L1治疗在晚期难治性肺鳞癌中的疗效和安全性[J].循证医学,2015,15(4):213-216.[12]YUAN Y,ADAM A,ZHAO C,et al.Recent advancements in themechanisms underlying resistance to PD -1/PD -L1blockade immu-notherapy[J].Cancers(BaseⅠ),2021,13(4):663.[13]韩丽炘,黄玉,温娟娟.PD -1/PD -L1抑制剂联合化疗对比免疫单药治疗晚期NSCLC 疗效及安全性的Meta 分析[J].山西大同大学学报(自然科学版),2022,38(4):84-90.[14]汝继轩,吴川林,张占田,等.PD -1/PD -L1免疫检查点抑制剂治疗胰腺癌研究进展[J].中华胰腺病杂志,2021,21(2):143-147.[15]陈丽丽.EGFR 联合PD -L1在可切除或临界可切除胰腺癌中的预后评价作用[C]//第二届中国临床分子诊断大会.第二届中国临床分子诊断大会论文集.成都:出版者不详,2019:73.[16]YANG Z T,WANG Y,LIU S X,et al.Enhancing PD -L1degra-dation by ITCH during MAPK inhibitor therapy suppresses acquiredresistance[J].Cancer Discovery,2022,12(8):1942-1959.(编辑:姚佳良)27山东理工大学学报(自然科学版)2024年㊀。
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一、项目组建的意义及必要性 二、项目实施基础 1、申报单位基本情况 2、现有研发基础条件 3、近 2 年来承担的主要科技项目，取得的知识产权情况等 三、项目主要目标和任务 1、总体目标 2、主要研究开发和工程化方向 3、项目的组织功能构架 4、项目建设地点 5、主要任务及考核指标 （1）硬件建设任务 （2）研究开发主要任务 （3）领军人才引进、人才培养与团队建设任务 （4）管理体制与运行体制建设任务
用前景较好的快速定量检测仪和干式生化分析仪缺乏研究和投入。国内仅有南京基蛋、北京 热景、深圳瑞莱和广州万孚，但北京热景 UPT-3A 上转发光免疫分析仪不是主流产品，深圳 瑞莱是美国 ReLIATM 在中国的独资企业，广州万孚的飞测免疫荧光检测仪属于 OEM 产品。 南京基蛋生物科技有限公司作为一家集专业研发、生产和销售为一体的现代化高新 技术企业，拥有以“135 工程”重点医学人才和江苏省产业教授苏恩本博士为带头人的研发 团队，丰富的管理经验和销售经验的人才队伍。配置了先进的研发、生产设备，2011 年通过 了 ISO13485：2003 国际质量管理体系认证。公司还建立了完善的知识产权管理体系，拥有 注册商标 9 个，授权专利 33 项（授权发明专利 2 项）。然而也存在多方面的问题：仪器设 备的社会化程度不高，研发设备还没有为社会提供良好的服务；专业的人才队伍仍显不足， 与企业保持长期的技术创新不相符；仪器设备需要持续更新以保世界先进水平。 组建本中心就是针对公司现有的不足以及国内重大疾病 POCT 产品研究开发相对落后 和资源集成度不够，加大软硬件投入，建设国内一流的 POCT 平台，多、快、好的开发新技 术、新工艺和新产品，使企业走可持续发展之路，促进我国医疗卫生事业的发展。
2、现有研发基础条件（研发场所、中试基地、仪器装备，市级工程技术研究中心培育时间、人才团队及运行情况）
（1）研发场所、中试基地、仪器装备 南京基蛋生物科技有限公司位于南京市六合区中山科技园内，已经组建了 4 个生产 车间（2 个诊断试剂生产车间及 2 个仪器生产车间）、3000m 的研发实验室（分子实验室、 抗体实验室、酶免实验室、快诊实验室、仪器实验室）、1 个检测中心。其中，1 个诊断试 剂生产车间已经通过了十万级洁净厂房认定，且通过了江苏省食品药品监督管理局质量管理 体系考核，另一个诊断试剂生产车间已完成规划与装修，正在进行设备的配置。 研发实验室已经配制了一批先进的仪器设备，如示波器、信号发生器、直流稳压电 源、频率计、数字万用表、电烙铁、频谱仪、功率计、矢量分析仪、光万用表、光功率计、 耐压测试仪、阻抗测试仪、LCR 测试仪、电路维修测试仪、电磁干扰测试仪、回路校准器、 静电放电发生器、PERKIN ELMER PCR 仪、高速冷冻离心机、高档酶标分析仪、电热鼓风干燥 箱、OLYMPUS 显微镜、Nikon 倒置显微镜、OLYMPUS 荧光显微镜、三用紫外分析仪、 PYX-DHS-600-BS 隔水式恒温培养箱、W-9100 分光光度仪、UV-9100 紫外可见分光光度计、 SW-CJ-IF 超净台、IsoFlow Disperser 蛋白点膜仪、喷金划线双功能仪、Thermo CO2 孵箱、 Index cutter-1 高速切割机 APOINT TECHNGLOGIES、Christ LOC-1 冷冻干燥机、Bio-dot 原 产划线仪等。其仪器装备原值达到近 800 万元。 （2）市级工程技术研究中心培育时间、人才团队及运行情况 公司自成立以来就创建了自身的研发机构，2011 年正式筹备床边快速诊断（POCT） 工程技术研究中心， 并向南京市科学技术局提出申请， 2012 年 8 月我公司工程技术研究中心 被市科技局认定，给予组建通知。 公司不断完善工程技术研究中心的建设，已经完成了 3000m2 研发实验室、检测中心、
心血管疾病、肾脏疾病、传染病等重大疾病为世界范围内死亡的主要原因。全世界 每年约 1500 万人死于心血管疾病,急性肾脏损伤医院内死亡率高达 60.3％,传染病死亡人数 占总死亡人数的 30％。因此，对重大疾病的早期诊断和治疗显得尤为重要。床边快速诊断 （POCT）作为检验医学两极发展的新趋势的产物，因实验技术仪器小型化、操作简单、结果 报告及时化受到人们的关注和亲睐。随着技术的发展，POCT 产品正向小型化、简单化方向发 展，尤其是设备便携式、手持式方向发展。 POCT 常用的分析技术有胶体金免疫技术、荧光免疫技术、干化学技术、多层涂膜技 术、生物传感器技术和生物芯片技术等。进入新千年后，更多的、更先进的技术应用于 POCT 检测， 其产品种类繁多。 目前， 国际上 POCT 产品主要有罗氏公司 （Roche） 、 美国博适(Biosite) 等公司的产品。国内大部分生产厂家只注重生产而不重视核心技术和原料的开发，对市场应
2006 年南京市科技进步一等奖，“抗人心肌肌钙蛋白 I 单抗研制与心肌损伤疾病诊 断及发病的研究”； 2005 年省科技进步二等奖， “心肌损伤疾病诊断、发病与心肌肌钙蛋白 I 的研究”； 2004 年国家新药 II 类证书一项； 2002-2008 获江苏省卫生厅“135 工程”重点医学人才 100 万元资助； 2002 年省卫生厅新技术发明二等奖，“DNA 微卫星技术在亲子鉴定工作的应用”； 2001 年南京医科大学新技术发明二等奖--“亲子鉴定新技术”； 2001 年省科技进步二等奖，“病毒性心肌炎与扩张型心肌病诊断及治疗”； 1999 年南京市科委优秀论文一等奖，“病毒性心肌炎与扩张型心肌病血清抗 M 受体 抗体研究”。 核心团队： 金晶，男，27 岁，东南大学博士（硕博连读）。2006 年至 2009 年主要在生物学国 家重点实验室从事科学研究，参与了“基于磁性纳米粒子的唾液中单胺类神经递质的富集及 其高效液相色谱方法检测”和“基于免疫竞争法的尿液中硝基酪氨酸 SPR 传感器检测及其在 航天员医监系统中的应用”等课题研究。2008 年-2010 年，主持了江苏省普通高校研究生科 研创新计划基金 （项目编号 CX08B-145Z， “神经递质与地震创伤后应激障碍者的关联研究” ） 。 因为科研成绩突出，2009 年 9 月至 2011 年 12 月作为访问学者去美国 University of California, Los Angles 学习与研究，在此期间参与了“基于自组装自交联蛋白纳米胶囊研 究”、“基于自由基聚合的蛋白质纳米胶囊研究”、“基于金纳米粒子表面增强生物发光蛋 白纳米胶囊的肿瘤细胞显影” 和 “人造细胞壁合成与研究” ， 发表了 2 篇 SCI 论文于 Sensors and Actuators B 以及 Current Drug Metabolism，同时申请一篇发明专利，另投稿一篇 SCI 论文于 Angewandte Chemie。2010 年-2012 年 10 月主持了东南大学优秀博士论文基金（项目 编号 BC0905, “蛋白质纳米胶囊的研究及其在纳米金增强生物发光肿瘤细胞显影中的应用” ） 。 2012 年 8 月，加入到南京基蛋生物科技有限公司，担任酶免部部长一职，带领研发团队完成 28 项化学发光试剂的研发、16 项胶乳试剂的研发、15 种微球的研发和全自动化学发光免疫 分析仪样机开发、快速诊断试剂与仪器的开发，取得 10 项产品注册证。在公司就职的这段 时间，还成功申请了两项专利：201220494874.3 以及 201220494844.2，另撰写了三项发明 专利。 张超，男，29 岁，博士。在厦门大学读博期间，承担了国家自然科学基金项目“血
19.2％、12.4％。通过项目的开展，在技术创新与成果转化方面已经取得了长足进步：近 2 年已经申请专利 45 项，已经授权专利 33 项（其中授权发明专利 2 项），推出新产品 17（胶 体金系列产品 9 个，荧光系列产品 8 个）。其中，胶体金系列心血管诊断试剂盒被江苏省科 学技术厅和南京市科学技术委员会分别认定为“江苏省高新技术产品”和“南京市自主创新 产品”。该系列心脏标志物诊断试剂 2010 年末进入市场，促使公司销售收入的大幅度提高， 2011 年实现销售收入 1931 万元，同比增长 856％；2012 年实现销售收入 6309 万元，同比增 长 226％。
二、项目实施基础 1、申报单位基本情况（企业主营业务及在行业中主要优势，上年度销售收入、R&D 投入占销售收入比例等）
南京基蛋生物科技有限公司成立于 2002 年 3 月， 以诊断试剂与医疗器械为主要产业， 现已经发展成为一家集研发、生产、销售于一体的新型生物医药“高新技术企业”、“江苏 省民营科技型企业”、“江苏省医疗器械生产企业诚信单位”、“江苏省科技型中小企业”、 “南京市知识产权培育示范企业”。 公司坐落于中山科技园内，占地四十余亩，总建筑面积达 17000 平方米；现有员工 四百余人， 其中博士 3 人、 硕士 30 人、 其他大专以上人员达 80％以上。 2010 年公司建成 1000 多平方米 GMP 标准厂房，2011 年通过欧盟 CE 暨 ISO13485：2003 国际质量管理体系认证。公 司自成立以来就组建了自己的研发机构，经过多年的发展，建立和完善了胶体金免疫、荧光 免疫、酶联免疫、分子诊断、生化检测等技术创新平台。2012 年该机构被认定为“南京市床 边快速诊断（POCT）工程技术研究中心”。 公司以技术创新作为基础，以产品创新作为发展力量的源泉。近三年公司先后承担 省部级项目 1 项、地市级项目 3 项以及企业自主开发项目 6 项。2010 年、2011 年、2012 年 研发经费分别为 138.09 万元、370.24 万元、784.89 万元，分别占当年主营业务的 67.3％、
（5）主要任务与具体考核指标 四、项目实施计划 1、项目投资规模及建设资金来源与构成比例 2、项目建设经费的支出预算及仪器设备添置清单 3、项目组建的计划进度与阶段性考核指标 4、项目负责人及项目主要技术人员
建设地点：
一、项目组建的意义及必要性 所涉及的技术领域国内外发展现状、今后发展趋势，企业现有的优势和存在的主要问题，项目组建对相关产业发展、企业创新 的作用与意义等。