第三节 基因及基因表达的定量及定性分析
转录组和代谢组
转录组和代谢组转录组和代谢组是生物学中常用的两个重要概念，它们在研究生物体内基因表达和代谢物变化方面发挥着重要作用。
下面将分别介绍转录组和代谢组的相关内容。
一、转录组转录组是指在特定条件下，生物体内全部或某一部分基因被转录成mRNA的总和。
转录组研究的主要内容包括基因表达的定量和定性分析、基因功能的预测、转录调控机制的研究等。
1. 基因表达的定量和定性分析转录组研究可以通过高通量测序技术，如RNA-seq，对某一细胞或组织内的所有mRNA进行测序和分析。
通过对比分析转录组数据可以定量和定性地研究基因表达在不同时间、空间和条件下的变化，从而发现调控基因表达的关键因子。
2. 基因功能的预测转录组数据的分析可以通过比对已知基因组数据库，对新基因进行注释和功能预测。
通过对基因表达模式的分析，可以找到与特定生物过程相关的基因集合，进一步解析基因功能和相关生物学过程。
3. 转录调控机制的研究转录组研究可以揭示基因调控网络的结构和功能。
通过对转录组数据的分析，可以找到可能参与基因调控的转录因子和其结合位点。
进一步研究这些调控因子和位点的功能和相互关系，可以深入理解基因调控的机制。
二、代谢组代谢组是指在特定条件下，生物体内所有代谢物的总和，即包括小分子有机物、离子和小分子代谢产物等。
代谢组研究的主要内容包括代谢通路的发现与分析、代谢物定性与定量分析、代谢调控机制的研究等。
1. 代谢通路的发现与分析代谢组研究可以通过质谱技术、核磁共振技术等对生物体内的代谢物进行检测和分析。
通过对代谢物的测定和比较，可以发现新的代谢通路和代谢物之间的相互关系，揭示代谢网络的结构和功能。
2. 代谢物定性与定量分析代谢组研究对于了解生物体内代谢物的种类和含量具有重要意义。
通过质谱技术等定性和定量分析方法，可以鉴定代谢物的结构和测定其浓度，进而研究不同条件下代谢物的变化以及代谢通路的调控机制。
3. 代谢调控机制的研究代谢组研究可以揭示代谢调控的机制和关键因子。
基因表达的定量检测分析42页PPT
基因表达的定量检测分析
26、机遇对于有准备的头脑有特别的 亲和力 。 27、自信是人格的核心。
28、目标的坚定是性格中最必要的力 量泉源 之一， 也是成 功的利 器之一 。没有 它，天 才也会 在矛盾 无定的 迷径中 ，徒劳 无功。- -查士 德斐尔 爵士。 29、困难就是机遇。--温斯顿．丘吉 尔。 30、我奋斗，所以我快乐。--格林斯 潘。
基因表达的定量检测分析报告
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧 光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号 到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）
几个常用名词概念
1. Ct 值的定义
C代表Cycle，t代表threshold（阈值，临界值），Ct值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
2. 荧光域值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的 缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15
3. Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性 关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出 标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此， 只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的
•
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系
中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增
生物信息学中的基因表达谱分析
生物信息学中的基因表达谱分析基因表达谱是指在不同时间、不同环境或不同组织中，基因转录和翻译产生的RNA和蛋白质的数量和种类的一种定量和定性描述。
基因表达谱分析是研究生物学中基因表达的重要手段，可以帮助科学家研究基因功能、诊断疾病和开发新药。
生物信息学的发展为基因表达谱分析提供了许多新的方法和工具，让科学家能够更加快速、高效地分析和利用基因表达谱数据。
1. 基因表达谱分析的类型基因表达谱分析可以分为两种类型，即定性分析和定量分析。
定性分析主要依赖于基因表达谱的图形化展示和样本的聚类分析。
图形化展示可以帮助科学家快速地查看基因表达的变化趋势，如差异基因的表达，而聚类分析则可以将不同样本中的基因表达谱分为几类，有助于发现它们之间的相似性。
定量分析可以测量基因表达水平的数量，此类分析方法包括将基因表达谱数据和生物样本的方法学特征进行归一化，以便进行生物信息学方法的比较分析。
这些方法包括微阵列、RNA测序和蛋白质组学等技术，这些技术都可以更加准确地测量基因表达量，并能够比较不同样本之间的差异。
2. 基因表达谱分析的步骤基因表达谱分析需要经过多个步骤，通常包括数据预处理、探测器注释、归一化处理、差异基因筛选和生物功能的验证等步骤。
数据预处理涉及去除噪声、正规化和探针的标准化。
在预处理时，我们可以使用质控图来确保数据质量，同时，使用探测器注释，即对基因定位信息的注释，可以保证数据的准确性。
归一化处理用于保证基因表达量在样本之间具有可比性。
差异基因的筛选旨在发现基因表达谱中存在的显着差异，我们可以使用t-test、方差分析（ANOVA）和Pearson相关系数等统计方法来确定这些基因。
生物功能的验证是确定差异基因的生物作用和分子机制，以及它们在生物学过程中的重要性。
3. 基因表达谱分析的应用基因表达谱分析可以应用在许多领域，包括医学、农业、环境和食品安全等方面。
在医学领域中，基因表达谱分析可以用于研究基因在癌症和其他疾病中的功能，以及开发新的药物。
基因表达的测量和分析
基因表达的测量和分析随着人类基因组的测序技术的不断完善，我们已经能够获取每个个体的基因信息。
然而，真正影响生物个体的并不是基因本身，而是基因表达。
基因表达是指基因通过蛋白质转录的方式表现出来的生物特征。
通过测量基因表达水平，我们可以深入了解生物个体的生存状态，生长、分化、细胞增殖、蓄积、代谢等等生命过程中的各个环节。
基因表达的测量是通过转录组技术来实现的，这类技术首先需要提取样品中的RNA，然后通过RNA测序来获取转录组信息。
基因表达水平的测量可以在两个水平进行，一个是转录水平，另一个是蛋白质水平。
转录水平的测量可以通过 RNA-seq技术、microarray或者qPCR等技术实现，而蛋白质水平的测量则可以采用质谱技术或其他蛋白质测量技术。
RNaseq技术是一种快速、高灵敏度的方法，可以检测到全基因组的所有转录本，并且有高水平的准确性和可靠性。
Microarray技术则可以将全部的转录本与DNA探针结合，然后通过荧光标记检测信号强度来测量不同基因转录本的表达水平。
而qPCR技术则是一种单基因转录本检测技术，可以对单个基因分子进行量化测量。
基因表达的分析，一般可以分为两种类型：差异表达和聚类分析。
通过差异表达分析，我们可以比较两组不同样品（如正常人和病人），以分析出哪些基因在这两组样品中是不同的。
而聚类分析则可以将每个样品根据基因表达的相似性进行聚类。
差异表达分析可以帮助我们寻找在不同生理状态或病理状态下的关键调控因子。
例如，在与某种病毒感染的细胞样本和健康的细胞样本中测量基因表达，可以发现哪些基因与病毒感染有关，这可以用于预测病毒感染的机制，为新药物研发和基础医学研究提供支持。
聚类分析则可以将我们的样品分为不同的类别，这些类别的基础是根据某些确定的维度而形成的。
例如，根据转录本的表达水平，我们可以将一大组的放线菌进行有意义的聚类，然后对于每组放线菌，我们可以检测在不同条件下它们生长的速度和产生多少有效化合物等多个方面的表现进行分析，从而预测可能更好的生产条件并最大化产量，同时保证化合物的表现和纯度。
基因表达分析
Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面 开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……
PCR不只是一个方法改进 1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关 专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此 后的经营中又获得了数亿美元的分红
生物芯片
生物芯片（biochip）是近年来在生命科 学领域中迅速发展起来的一项高新技术， 主要是指通过微加工技术和微电子技术在 固体芯片表面构建的微型生物化学分析系 统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生 物组分的准确、快速与大信息量的检测。
生物芯片的分类
(1) DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray) (2) 蛋白质芯片(Protein chip)
影响杂交的因素
核酸分子的浓度和长度
浓度大，复性快；分子量大，复性慢
温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应
预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA
分子杂交的基本方法
Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交
Sanger双脱氧末端终止法
Maxam-Gilbert 化学裂解法
（二）基因拷贝数的分析
Southern blot
PCR技术
核酸分子杂交
分子杂交（简称杂交，hybridization）是核酸研究 中一项最基本的实验技术 杂交的基本原理就是应用核酸分子的变性和复性的 性质，使来源不同的 DNA（或RNA）片段，按碱 基互补关系形成杂交双链分子（heteroduplex）
基因表达定量原理
基因表达定量原理
基因表达定量是一种用于确定特定基因在细胞中的表达水平的方法。
该方法可以帮助研究人员了解基因在不同组织、发育阶段以及疾病状态下的表达程度。
在基因表达定量中，首先需要收集细胞或组织样本，并提取其中的RNA。
然后，利用逆转录酶反转录RNA为cDNA，以便
后续的定量分析。
接下来，通过定量PCR技术测量目标基因
在cDNA中的拷贝数目。
定量PCR通常使用荧光探针或
SYBR Green等荧光染料来检测PCR扩增的过程中的目标基因
拷贝数目。
为了准确测量基因表达量，必须选择一个合适的内参基因（也称为参考基因或内部控制基因），以作为基准来标准化实验结果。
内参基因应具有稳定的表达水平，并且在不同样本之间不发生变化。
常用的内参基因包括β-actin、GAPDH和18S
rRNA等。
在定量PCR反应中，需要设立标准曲线来确定目标基因的拷
贝数。
标准曲线通常由一系列已知浓度的DNA标准样品构建
而成。
将标准样品的Ct值与其对应的DNA浓度绘制成曲线，可以通过测量实验样品的Ct值与标准曲线的交叉点来确定目
标基因的拷贝数。
最后，通过比较不同样本中目标基因的表达水平，可以了解不同条件下的基因调控情况。
例如，研究人员可以比较疾病组织和正常组织中某个基因的表达差异，以便探索该基因在疾病发
生发展过程中的作用。
总之，基因表达定量是一种重要的实验手段，可以帮助研究人员了解基因的表达调控机制，从而深入研究生物学过程和相关疾病。
生物化学第12章-分子生物学常用技术
第十二章分子生物学常用技术及应用【授课时间】3学时【目的要求】1．掌握基因工程与重组DNA技术相关概念，核酸分子杂交、探针、PCR、DNA 芯片技术、基因诊断和基因治疗的概念。
2．熟悉重组DNA技术、PCR的基本原理及基本反应步骤。
3．了解基因工程在医学中的应用，PCR 的主要用途。
4．了解DNA芯片技术的原理与方法，基因诊断与基因治疗的应用。
【教学内容】1．一般介绍：基因工程2．一般介绍：核酸分子杂交技术3．一般介绍：聚合酶链反应4．一般介绍：DNA芯片技术5．一般介绍：基因诊断与基因治疗【授课学时】3学时第十二章分子生物学常用技术及应用第一节基因工程第二节核酸分子杂交技术第三节聚合酶链反应第四节 DNA芯片技术第五节基因诊断与基因治疗第一节基因工程噬菌体(bacteriophage，phage)是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，所以称为噬菌体。
用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。
（一）目的基因的制备目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是需要克隆或．基因组DNA文库cDNA文库．聚合酶链式反应（polymerase chain reaction．化学合成（二）目的基因与载体的连接将目的基因或序列插入载体，主要通过DNA（二）Northern 印迹杂交Northern 印迹杂交是指将待测RNA 样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交，检测的方法。
其基本原理和基本过程与印迹杂交主要用于检测各种基因转录产物的大小、转录的量及其变化。
（三）斑点及狭缝印迹杂交分子杂交实验①②③目录三、探针的标记（一）探针的特征探针的特点：①要加以标记、带有示踪物，便于杂交后检测，②应是单链，若为双链用前需先行变性为单链；③具有高度特异性，只与靶核酸序列杂交；④标记的探针应具有高灵敏度、稳定、标记方法简便、安全。
（二）探针的种类及制备探针第四节 DNA芯片技术第五节基因诊断与基因治疗。
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原理:
核酸分子杂交的碱基互补配对
用途:
鉴定DNA片段
步骤:
DNA分离→DNA变性→转膜→ 杂交→洗
膜→放射自显影
关键技术: 核酸探针标记和DNA的转移。
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是一种利用非放射性的荧光信号对原位 杂交样本进行检测的技术
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二、RNA的定性与定量
第三节 基因及基因表达的定量及定性分析 一、DNA的定性和定量分析 二、RNA的定性和定量分析
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1
一、DNA的定性和定量分析
1. Southern印迹（Southern blot） 2. 基因组PCR反应 3. 荧光原位杂交
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1.Southern印迹（Southern blot），DNA印迹
用途
mRNA定量
mRNA末端定位
mRNA剪切部位
内含子位置的确定
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类别
用途
基因组芯片 表达芯片（cDNA芯片） 测序芯片
表达芯片↘ 定量分析 RNA
测序芯片↗
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基因芯片使用流程
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1.Northern印迹 2.RT-PCR 3.实时PCR 4.RNA酶保护试验 5.芯片技术
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1.Northern印迹， RNA印迹
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实时PCR的基本原理
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10Leabharlann 原理利用RNase A和RNase T1能专一性降解单链 RNA而双链RNA受到保护的特性，分析受到保护的 RNA片段的大小，估计待检测mRNA的情况