第四章 核酸操作技术
4 核酸操作的技术
离心分离法：超速离心、凝胶电泳
超速离心：
（a）速度区带离心：蔗糖。
沉降速度与样品质量、密度、离 心力大小、介质密度及样品与介 质的摩擦力有关。
（b）密度梯度离心:CsCl。
沉降速度与密度有关。 分辨率：0.02g/mL 蛋白质：1.3g/mL DNA： 1.6-1.7g/mL RNA： 1.75-1.85g/mL
4.1.2 微生物DNA的提取
质粒DNA提取
细菌DNA提取 病毒DNA提取
质粒DNA提取
细菌培养 碱裂解法、 煮沸法、 去污剂裂解法。
菌体收集 裂解
离心去除沉淀 酚氯仿抽提
异丙醇沉淀
细菌DNA的提取
细菌细胞
悬浮细菌 碱裂解或煮沸或去污剂 酚氯仿抽提 12000rpm离心
上层水相 乙醇沉淀
染色：EB
缓冲液：TAE、TBE
聚丙烯酰胺凝胶电泳
分辨率高：可分离相同长度碱 基组成不同的DNA片段；
需要样品量少：银染，可检测 少量样品；
回收DNA纯度高；
脉冲场凝胶电泳
分离超大DNA分子： 1-10Mb用于基因组构建。4.4 核酸的分子杂交
原理：A-T(U),G-C互补配对。 可形成DNA:DNA，DNA:RNA双链分子。 主要步骤： （1）核酸转移；
4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6
基本原理 微生物DNA的提取 动物细胞DNA的提取 植物细胞的提取 核外DNA的提取 RNA的提取
4.1.1 基本原理
步骤：
组织细胞破碎
去除杂质（蛋白、糖类）
去除其他杂质核酸
脱盐、获得纯品
化学试剂提取法：碱裂解法、煮沸法、有 机溶剂抽提法、去污剂法等
核酸技术的知识点总结
核酸技术的知识点总结一、核酸的结构和功能1. 核酸的结构核酸是生物体内储存遗传信息的重要化学物质，它主要分为DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）两种类型。
DNA是双螺旋结构，由磷酸、脱氧核糖和四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘌呤和胸腺嘧啶）组成；RNA是单链结构，由磷酸、核糖和四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘌呤和尿嘧啶）组成。
2. 核酸的功能(1) 存储遗传信息：DNA是细胞内存储遗传信息的主要分子，它携带了生物体遗传信息的全部内容。
(2) 遗传信息的复制：DNA在细胞分裂过程中能够通过复制和分裂，使得每个细胞都包含完整的遗传信息。
(3) 蛋白质的合成：RNA在蛋白质合成中起着重要作用，mRNA用来携带遗传信息，tRNA和rRNA参与蛋白质的合成过程。
二、核酸提取与纯化技术核酸提取是核酸技术的第一步，它是将细胞内的核酸从其他生物大分子（如蛋白质、多糖等）中分离出来的过程。
核酸提取技术的选择直接影响了后续核酸扩增和检测的结果。
常见的核酸提取与纯化技术包括酚氯仿法、硅胶柱纯化法、磁珠分离法等。
1. 酚氯仿法酚氯仿法是一种常见的核酸提取方法，它主要利用酚和氯仿的不同溶解度，将细胞内的核酸分离出来。
具体操作步骤包括：①细胞破碎：细胞颗粒蛋白破碎后，核酸被释放出来；②核酸的分离：将酚和氯仿混合液与细胞溶液混合，形成两相体系，核酸会在两相的交界面上沉淀下来。
2. 硅胶柱纯化法硅胶柱纯化法主要是利用硅胶柱上的硅氧基团与DNA分子之间的亲和性，将DNA固定在硅胶柱上，其他杂质则通过洗涤剂等去除。
操作步骤包括：①向硅胶柱中加入样品，DNA 被吸附在硅胶上；②洗涤过程：用洗涤液去除杂质；③最后用高温的TE缓冲液或水溶解DNA，使其从硅胶上释放出来。
3. 磁珠分离法磁珠分离法是近年来发展起来的一种核酸提取技术，它通过特制的磁珠与核酸上的亲和结合，来对核酸进行分离和纯化。
操作步骤包括：①向样本中加入磁珠，使其与核酸结合；②利用磁场将磁珠与核酸一起沉淀，然后去除上清液；③通过洗涤等步骤对核酸进行纯化。
第四章 核酸操作的基本原理
第一节 核酸的提取与纯化
制取核酸样品的根本要求是保持核酸 的完整性
防止核酸酶对核酸的降解、变性或破坏
一、DNA提取的基本原理与方法
（一）DNA提取的基本原理 DNA是极性化合物，溶于水不溶于乙醇、
氯仿等有机溶剂 DNA多以脱氧核蛋白（DNP)形式存在 提取DNA时用先将DNP抽提出来，在将DNA
在低电压(5v/cm)时, 迁移速率与电压成正比
5、嵌入染料
溴化乙啶使线状DNA迁移率降低15％。
6、 离子强度影响
pH 影响DNA分子所带的电荷 (TAE TBE)
二、琼脂糖变性胶电泳
未变性的RNA，电泳时与电泳迁移率没有严格的相 关性
在变性条件下电泳，才能使RNA移动距离与其相对 分子量对数成正比。
2. 琼脂糖凝胶电泳法
核酸分子是多聚阴离子, 在电场中向正电极 的方向迁移
在一的电场强度下，DNA分子的电泳迁移 率，取决于核酸分子本身的大小和构型。
原理： DNA与溴化乙锭（EB）形成
的络合物 在紫外光照射下能发 射荧光，荧光的强度与DNA的含 量成正比。
因此可十分敏感而方便地检 测出凝胶介质中 DNA 。
5.水抽提法
• 利用核酸溶解于水的性质, 用低盐溶液 除去RNA
• 此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一 般不用.
（三）核外 DNA 的提取
核外DNA包括： 质粒DNA
碱裂解法 煮沸法 去污剂裂解法
线粒体DNA 叶绿体DNA
先分离完整的 细胞器
提取纯化原理 与质粒DNA相同。
二、 RNA提取的基本原理与方法
紫外分光光度法 琼脂糖凝胶电泳法
1.紫外光度法原理： DNA或RNA分子在260 nm处有特异
核酸杂交技术全解
（二）Southern印迹杂交
Southern印迹杂交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指DNA与 DNA分子之间的杂交。 可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒 和噬菌体的分析等。
（二）Southern印迹杂交
包括两个主要过程： 将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到 一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上， 即印迹（blotting）。 固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的 温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
Southern印迹
凝胶中DNA分离带
凝胶中DNA 的NaOH变
性
探针杂交带曝光显 影
Southern杂交的应用
应用 单基因遗传病的基因诊断
基因点突变的检测
临床应用－－用于下列疾病的产前诊断 镰型细胞贫血 苯丙酮酸尿症 珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良 血友病 慢性进行型舞蹈病
(4) cDNA探针的标记 (5) 寡核苷酸探针的标记 (6) 单链DNA探针的标记 (7) RNA探针的标记
（1）DNA随机引物标记
随机引物：含有各种可 能排列顺序的寡核苷酸 片段的混合物。
DNA聚合酶ⅠKlenow片段： 保 留 5’→3’DNA 聚 合 酶 活性,弱3’→5’外切酶 活 性 ， 无 5’→3’ 外 切 酶活性。
根据杂交探针标记 • 同位素杂交 • 非同位素杂交
根据杂交介质 • 液相杂交 菌落杂交
Southern印迹杂交 • 固相杂交 Northern印迹杂交
点杂交 • 原位杂交 狭缝杂交
分子杂交技术一般过程
☆ 探针制备及标记（同位素或非同位素） ☆ 待测核酸样品制备（分离，纯化） ☆ 杂交（液相，固相，原位杂交） ☆ 杂交后处理（去掉非特异杂交分子） ☆ 显示结果（显色，发光，放射自显影） ☆ 结果分析
核酸pcr操作流程
核酸pcr操作流程
核酸PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的技朧，广泛应用于分子生物学、医学诊断、法医学等领域。
下面将介绍核
酸PCR的操作流程。
首先，准备PCR反应体系。
通常包括DNA模板、引物（primer）、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液和水。
DNA模板是待扩
增的DNA片段，引物是用于引导DNA合成的短链DNA片段，dNTPs
提供DNA合成所需的四种碱基，聚合酶是催化DNA合成的酶，缓冲
液用于维持反应的pH值。
其次，进行PCR反应。
将PCR反应体系加入PCR管中，放入
PCR仪中进行反应。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将反应体系加热至94-98摄氏度，使DNA双链解旋
成两条单链。
在退火步骤中，将反应体系降温至50-65摄氏度，引
物与DNA模板结合。
在延伸步骤中，将反应体系加热至72摄氏度，聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
最后，进行PCR产物的分析。
PCR反应结束后，可以通过凝胶
电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可
以将PCR产物按照大小分离成不同的条带，从而确定PCR反应是否
成功。
实时荧光定量PCR可以实时监测PCR反应的进程，得到更加
准确的结果。
总的来说，核酸PCR是一种快速、灵敏、特异的DNA扩增技术，广泛应用于科研和临床实验中。
熟练掌握核酸PCR的操作流程对于
科研人员和临床医生来说至关重要，可以帮助他们更好地进行实验
和诊断工作。
核酸试剂操作方法
核酸试剂操作方法核酸试剂是用于提取、纯化和测定核酸分子的化学试剂。
核酸试剂的操作方法可以大致分为以下几个步骤：样品处理、溶解、纯化、测定等。
下面我将详细介绍每个步骤的操作方法。
1. 样品处理：在进行核酸提取前，首先需要对样品进行处理。
根据实验的目的和样品的性质，可以选择不同的样品处理方法。
比较常见的样品处理方法包括：细胞裂解、血浆或血清的凝固、骨髓抽提等。
在样品处理过程中要注意采用无菌操作，避免污染。
2. 溶解：将处理后的样品或沉淀加入适当的溶解液中，使核酸完全溶解。
常用的核酸溶解液包括：TE缓冲液、含EDTA的去离子水等。
在样品溶解时，需轻轻摇晃或轻轻慢搅拌，避免生成气泡。
3. 核酸纯化：核酸溶解后，需要进行纯化以去除与核酸有关的杂质，如蛋白质、盐类和酶等。
常用的核酸纯化方法有酚-氯仿法、硅胶柱法、离心柱法等。
不同的纯化方法适用于不同的样品类型和实验需求。
在纯化过程中，需要根据试剂的使用说明进行操作，以保证纯化效果。
4. 核酸测定：核酸纯化后，可以通过一系列测定手段来确定核酸的浓度和纯度。
测定核酸浓度和纯度的方法有：比色法、荧光法、紫外吸收法等。
在进行核酸测定时，需要根据试剂的使用说明和仪器的操作步骤进行操作，确保结果的准确性。
除了上述操作步骤外，核酸试剂的操作还需要注意以下几点：1. 实验室条件：进行核酸实验需要在洁净、无菌的实验环境下进行，避免外源性DNA和RNA的污染。
2. 消毒处理：实验前需要将操作台面、试剂瓶盖、离心管等实验器材进行消毒处理，以避免细菌、病毒的污染。
3. 无菌操作：在进行核酸提取和纯化操作时，需采用无菌技术，包括用纯化的试剂和器皿、带手套、使用滤芯枪头等。
4. 试剂保存：核酸试剂的保存条件需根据试剂的要求进行，常见的存储条件包括-20保存、避光保存等。
5. 操作技巧：在进行核酸试剂操作时，需熟悉试剂的用途和使用方法，并掌握相关实验技巧，以保证试剂的有效使用。
总之，核酸试剂的操作方法涉及样品处理、溶解、纯化和测定等步骤。
第四章核酸操作基本技术
1.
2.
重新纯化DNA，去除蛋 白、多糖、多酚等杂质 （具体方法见前）
重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发 增加70％乙醇洗涤的次 数（2-3次）
对 策
2.
3.
3.
问题二：DNA降解。
原 因
1.
1.
2.
3.
4. 5.
材料不新鲜或反复冻 融 未很好抑制内源核酸 酶的活性 提取过程操作过于剧 烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三
甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核 酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（> 0.7 mol/L NaCl）是可溶的，通过有
机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即 可使核酸分离出来。
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
1.
DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质
DNA在溶解前，有 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 离子
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
吸附材料结合法：
硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 特点：快捷高效。 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
第四章 目的基因的获得-PCR
5’ ATCTTGAAC
模板
Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
4. 1个循环的结果
5. 新一轮循环开始 变性—复性—延伸。
DNA elongation
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2. 亚磷酸三酯法 原理
将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH
与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接， 然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使 用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具 体的合成和延伸过程如图。
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所 要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。
模板
5’ ATCTTGAAC 引物
5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG
TGCATGCAT 3’ 3’ ACGTACGTA 5’
引物
模板
ACGTACGTA 5’
3. DNA链的延伸
72 oC
DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链
(d)
3’
3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链 5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
（四）PCR的特点
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特点是技术简单、速度快、样品悬浮不受用量的 影响，但缺点是很难得到完全纯化样品。
ⅱ沉降平衡法又称密度梯度离心法 （CsCl密度梯度离心） 在离心时混合物各组份不沉至管底而是停留 在事先制好的或在离心中型成的不同密度的介质 中，使之处于平衡状态（此时样品的流动速度为 零）从而使物质分开，比如把样品加在相当稠密 的小分子溶液(CsCl)中，在离心时形成梯度并使大 分子进入与它的力的总和为零的区域（即离心力 和浮力相等）这个区域的密度等于大分子的密度 也称该分子的浮力密度(ρ)此法称浮力密度梯度离 心(BGC)。
植物组织 细胞器缓冲液匀浆 离心(100g, 10’,4℃)除去细胞 核 离心(1800g, 10’,4℃)分离叶绿体 离心(10,000g, 10’,4℃) 分离线粒体 DNase除去细胞器外DNA 加入EDTA使 DNase失活 纯化细胞器 细胞器裂解 提取DNA
2. 载体DNA的分离与纯化
1) 质粒载体DNA的分离
线粒体 藻类 线状 15kb 酵母 环状 19~78 kb 植物 环状 100~150 kb 动物(扁虫到人)环状 15~18 kb 锥虫 网状 6000 kb(幼体) 短膜虫 网状 30,000 kb(幼体) (Kinetoplast）
叶绿体 双子叶植物 121（菠菜）~154kb（豌豆） 单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍） 藻类 132（裸藻）~191kb（衣藻）
Trizol（invitrogen）
3. 多聚核糖体RNA的制备
1) 多聚核糖体的分离 ① 超速离心法（30-40万g，离心2-3 h） ② 镁盐沉淀法（0.1 M Mg++） ③ 分级分离法—分离特异性多聚核糖体
i. 结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。 ii. 核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的 多聚核糖体 iii.核糖体免疫沉淀法 *直接免疫沉淀法 新生肽链+抗体 蔗糖密度梯度离心 **间接免疫沉淀法 新生肽链+抗体+抗-抗体（二抗） 不可 溶复合物 离心分离
5. RNA的质量评估方法
1) 光密度值测定法 A260/A280=2.0 2) 凝胶电泳 3) 体外蛋白质翻译
蔗糖密度 梯度离心
大小分级分离 热苯酚法 凝胶电泳
一定 大小范 围RNA
细胞裂解物 胍盐法
离心 LiCl/ 尿素法
总RNA
分子杂交法— 特异RNA分子
核酸序列 分级分离 亲和层析法— poly（A）RNA分子
a. b. c. d.
上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤 可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片， 保留上清液。 使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心 使RNA分离：RNase处理或超速离心 使DNA与其它可溶物分离
基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图
（3）细胞器DNA的分离(叶绿体、线粒体DNA)
第二节
核 酸 的 检 测 与 保 存
一、核酸的检测
1.紫外光谱分析法 远紫外（10-200nm）：实验中难以实现； 近紫外（200-400nm)：通常意义上。
纯DNA：A260/A280＞1.8 纯RNA:A280/A260≈2.0 A=1，含50μg/ml的双螺旋DNA或40μg/ml单链DNA或 RNA，或20μg/ml寡核苷酸。
***免疫亲和层析法 新生肽链-抗体复合物 不溶性交联抗原基 质亲和层析柱吸附 洗脱 免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%的mRNA，但必须使用 高纯度的抗体，不能发生交叉反应和污染核酸酶 2) 多聚核糖体RNA的分离 纯化多聚核糖体+SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提
4. RNA的分级分离
2) 噬菌体载体DNA的分离
纯净病毒颗粒 病毒载体DNA M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法
四、RNA的分离与纯化
1. 制备RNA的关键—防止内外源RNase的 作用
1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗 高温严寒(0~65℃均具活性）；抗变性剂 2) 解决办法： 外源RNase—高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所 有溶液（Tris· HCl除外）和器皿，操作者带手套并 经常换，手是RNase的主要来源 ； 内源RNase—高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase 抑制剂，蛋白酶K等。
1) 分子量大小分级分离
i. 蔗糖密度梯度离心 ii. 凝胶电泳
2) 核酸序列分级分离
i. 分子杂交法：适用于同源性很高的RNA的分离 DNA分子变性 结合到NCF RNA· DNA杂交 洗涤 洗膜 乙醇沉淀
ii. 亲和层析法： 低聚dT纤维素: 用于poly(A)较长的mRNA； 多聚U琼脂糖: 用于poly(A)较短的mRNA（<20A） RNA进样吸附 洗涤 洗脱 收集260nm处吸收峰样品 乙醇沉淀 iii. 无poly(A) mRNA的分离 纯化多聚核糖体 核糖体亚基+mRNP 离心 mRNP 蛋白酶K mRNA 低聚（dT）纤维素层析 洗出液 乙醇沉淀（无多 聚A mRNA）
-20 ℃ -40 ℃ -70～-80 ℃
第三节
核 酸 电 泳
电泳：
带电物质在电场中向相反电极移动的现象。
核酸凝胶电泳的原理： 各种生物大分子在一定pH条件下，可 以解离成带电荷的离子，在电场作用下向 相反的电极移动；在生理条件下，核酸分 子（DNA和RNA）的多核苷酸链呈现多聚阴 离子的特性。当核酸分子被放在电场中时， 它们就会向正极方向移动。
异硫氰酸胍
蛋白质的强变性剂。 氯仿（三氯甲烷） 加速有机相与液相分层；去除核酸溶液中 的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 异戊醇 减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。 异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶 剂相维持稳定。 单价的阳离子（Na+） 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入 单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和 DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同 性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
分离细胞器DNA
RNA poly(A)RNA 特异DNA
感染或转染细胞（病毒型）
分离病毒颗粒 病毒载体DNA分离与纯化
转化细菌细胞（质粒型）
培养转化细胞、收集菌体 破碎细胞
质粒DNA分离与纯化
3、DNA片段的分离
DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定DNA片段的胶回收
三、DNA的分离与纯化
1、供体DNA的分离与纯化
要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。 1) 基因组大小：
染色体 细菌 3300~4200kb 酵母 15,000 kb 果蝇 1.28x105 kb 人 3x106 kb 植物 2x105~1x108 kb 天花病毒 288 kb 痘病毒 196 kb 质体 几~100以上kb
高速离心法 全部多聚核糖体 上清液 镁盐沉淀法 蔗糖密度梯度离心—结合与 游离多聚核糖体 蔗糖连续密度— 一定范围大小核糖体 免疫沉淀法—— 特异性多聚核糖体
分级分离法
多聚核糖体RNA
CTAB
去污剂，溶解细胞膜，高盐溶液中与核酸共溶。 β-巯基乙醇 抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌，避免褐 变，使酚容易去除基因组DNA。 SDS 裂解细胞，释放核酸。 苯酚 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。 （1）水饱和酚又叫水平衡酚；PH小于7，通 常与异硫氢酸胍一起使用，用于RNA的提取； （2）Tris饱和酚一般PH大于7.8，用于DNA 的提取。
第三章
核 酸 操 作技 术
DNA
核酸
RNA
1. 核酸的分离和纯化 2. 核酸的检测与保存
↓
紫外光谱分析法 荧光分析法 凝胶电泳法（常用、重要）
3. 核酸的凝胶电泳 4. 核酸分子杂交
第一节
核酸的分离和纯化
一、一般程序
1、供体的核酸分离
供体细胞培养 收集(菌体)细胞（离心） 细胞破碎（细胞裂解） 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA
在具体工作中介质的选择、浮力密度确定等改 进有很多（例如加EB，线性结合强，可区分线性 和环形。 根据文献在相似的条件比较核酸浮力密度：
ssRNA(单链RNA) ＞dsRNA(双链) ＞ssD
在超离心时样品以不同的速度沉至管底，若两 种或多种界面，从界面的移动（产生）可以测不 同溶质的分子量并把混合物分开称沉降速度法。
(2) CsCl密度梯度离心 上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温下超速离心 (45,000rpm）16小时 穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提 溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀 DNA 离心、洗涤、干燥
*两种方法比较： CsCl法操作步骤少，分 离DNA分子量大，耗财多，且 需超速离心机。 苯酚法耗时少，不需昂贵 仪器，但操作步骤多，易使 DNA分子断裂。 若 小心操作， 所获DNA亦符合要求。
离心分离法——超速离心
最大转速 r/m 普通离心机 高速冷冻离心机 超速离心机 6000 25,000 25,000-75,000 温度
RT -10-4℃ -10-4℃
超速离心机是1940年瑞典物理学家Svedberg （斯韦德伯格）制造。
从原理上，超离心分三种类型： ⅰ差速离心 对一个混合物组份通过改变离心速度（差速） 使各组份分开的技术。
关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开； 原理：质粒DNA比染色体DNA 小得多，在DNA抽提过 程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持 超螺旋构型。
方法：
ⅰ. 超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型 ⅱ. 变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而 质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时， 前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法 上述方法亦可用于ss环状病毒DNA RF型的分离, 质粒 DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）