成骨细胞分化调控概览

The Regulatory Landscape of OsteogenicDifferentiationAbstract间质干细胞（MSCs）向成骨细胞的分化是骨发育和动态平衡的一个完整的部分，当它被不恰当地调控时，可能产生疾病，比如骨癌或骨质疏松。

利用无偏倚的高通量方法，我们描述了在人类MSCs向骨谱系分化的过程中，基因表达，组蛋白修饰，以及DNA甲基化方面整体改变的图景。

此外，我们第一次提供了一份基因组范围上的，关于骨主要调控转录因子Runt相关转录因子2（RUNX2）在人类成骨细胞中DNA结合位点的描述，显示出目标基因与增殖，迁移及凋亡调控有关，并与p53调控的基因有明显的重叠。

这些发现扩展了正在出现的证据，这些证据是关于RUNX2在癌症，包括骨代谢，以及p53调控网络中有作用的。

我们进一步揭示了RUNX2结合在远端的调控元件，启动子上，还有很高的频率结合在基因的3’末尾上。

最后，我们识别出了TEAD2和GTF2I是一种新的成骨调控因子。

Introduction间质干细胞或者基质细胞（MSCs）有多谱系潜能，可以向成骨，成脂，成软骨，还有其它谱系分化（1）。

MSCs出现在骨髓和其它间质组织中，可能迁移到损伤或炎症处，参与组织修复（2）。

MSCs可在体外条件下被纯化并向成骨细胞分化，这为从分子上研究成骨提供了方便的工具（1）。

关于这一过程的更多知识，对基础研究及MSCs在骨骼再生医学上的临床应用都是十分重要的（3），同样地，理解它在骨病中失调的情况也很重要，比如说癌症。

在这点上，非常有意思的是骨肉瘤，最常见的骨原发恶性肿瘤，可能是由基因及表观遗传上的改变打断了MSCs向成骨的分化所致（4）。

干细胞分化受基因表达的变化所高度调控，这种变化在转录水平上与DNA 或染色质结合在转录调控子上有关，或是与染色质图像的局部改变有关（5~7）。

高通量方法的发展，比如RNA测序（RNA-Seq），以及染色质免疫沉淀及测序（CHIP-Seq），使人们可以对这种改变。

在基因组水平上进行描述（8，9）举例来说，RNA-Seq可以系统性地发现启动子与外显子的轮流使用（10），而CHIP-Seq显示特定的组蛋白修饰区域，以及这些变化是如何改变基因活性的（5，8）。

CHIP-Seq也使人们可以发现基因组结合位点，并为广泛的转录因子（TFs）寻找目标基因（11，12）。

此外，综合基因组分析可以在整个基因组中识别功能区域，比如启动子和增强子，这些成果又可以被用来丰富新的转录因子结合位点（TFBS）分布，以帮助发现新的生物过程调控因子（5）。

在单倍体RUNX2缺乏患者中的骨骼发育缺陷（13），或是Runx2缺合子（nullizygous）小鼠中骨化骨的缺失（14，15），揭示了RUNT相关转录因子2（RUNX2，即CBFA1）对于骨的发育是不可或缺的。

在成骨中，RUNX2涉及调控增殖，迁移，定型，以及向成骨谱系的分化（16~19）。

RUNX2对上游信号起反应，调控基因的表达，这些上游信号包括TGFB，BMP及Wnt信号通路（20~23）；但是，成骨细胞中的下游目标被描述得就没有那么好。

除了它在发育和失调中的作用，RUNX2还为人所知的是涉及肿瘤形成；RUNX2与MYC原癌基因协同，在造血谱系中启动瘤变发生（24），近期的证据提示在乳腺癌和前列腺癌细胞中，RUNX2的肿瘤生长和代谢属性（25~27）。

在骨肉瘤中，RUNX2常常是过度表达的，这与预后不良有联系（28）。

有趣的是，关于RUNX2和p53相互作用的证据开始浮现，包括因DNA损伤所致的RUNX2抑制p53介导的基因表达（29），以及p53依赖性RUNX2蛋白水平调控的证据（30）。

我们描述了从非肿瘤生成性，不死化的MSC细胞系向成骨分化过程中的转录组及表观基因组上的特征。

此外，我们第一次报导了骨主要调控因子RUNX2在人类成骨细胞中的基因组范围的结合位点，并揭示了2000多个目标基因，这些目标基因为研究骨生物学中RUNX2的转录调控作用提供了新的亮光。

我们也利用组蛋白CHIP-Seq产生的表观基因组特点来识别与分化诱导性染色质改变有关的启动子，并预测TEAD2和GTF2I是这些启动子的新调控因子。

最后，通过沉默TEAD2和GTF2I的表达，我们确认了这些转录因子在调控成骨分化方面的作用。

Materials and Methods暂略RESULTSiMSC#3细胞向成骨谱系分化引起基因表达的整体改变为了研究从MSCs开始的成骨分化，我们使用了我们实验室产生的非肿瘤形成性细胞系（iMSC#3），办法是通过端粒酶的异位表达（Skarn et al.,manuscript submitted for publication）从而不死化。

这个细胞系可以受转录操控，并且在多次传代后仍然有多谱系分化潜能。

甚至，在基因表达水平上，iMSC#3细胞非常像人原始MSCs，提示细胞的不死化没有彻底改变它们的MSC特性（Supporting information Fig.S1）。

为了成骨，iMSC#3细胞被放在DM中培养28天，强力茜素红S染色提示矿化基质形成（Fig.1A）。

为了进一步检验分化的程度，用RNA-Seq技术从未分化细胞（Day 0）和分化细胞（Day 28）中测定了基因整体表达情况，并做对比。

我们所发现的在分化中上调或下调的转录物，其所对应的基因分别为1462个和1695个，幅度至少是2倍或更多（Fig.1B）。

复制实验显示出高水平相关性（Supporting information Fig.S2）。

使用精巧路径分析（IPA），我们发现上调基因与增殖，细胞死亡，骨骼发育，以及细胞运动相关，而下调基因与细胞周期调控有关（Fig.1C）。

已知的成骨标志物，包括ALPL（碱性磷酸酶），RUNX2，ATF4（活化转录因子4），OMD（骨调蛋白），以及FOXO1（叉头框O1）被发现是上调的，而MSC标志物，包括MCAM（黑色素细胞黏附分子），ENG（内皮糖蛋白），CLCF1（心肌营养蛋白样细胞因子1），TPM1（原肌球蛋白1α），以及CD44（CD44分子[印度血型]）被发现是下调的（Fig.1D）。

分化iMSC#3细胞的表观遗传分布为了研究成骨过程中基因组范围的表观遗传改变，我们在0天和28天时，利用CHIP-Seq描述了代表着染色质不同功能状态的组蛋白H3修饰的分布情况。

我们检验了H3K4m3的分布，它在启动子中很丰富（8，36），H3K9ac和H3K27ac的分布，它们在活化调控元件中很丰富（37，38），H3K36m3的分布，发现于活化的已转录基因中（36），以及抑制性修饰H3K27m3的分布，典型情况下它分布广泛，覆盖启动子，编码区，以及基因间区（8，39）。

关于0天和28天时ALPL位点的CHIP-Seq及RNA-Seq富集分布图已给出（Fig.2A）。

该图显示转录水平下调，这与H3K4m3和H3K36m3分别在启动子和编码区的富集程度上升相一致。

多个H3K27ac及H3K9ac峰提示转录元件活化，而在基因的上游发现H3K27m3甲基化受抑制（Fig.2A）。

分化伴有染色质图景的变化为了从整体上分析组蛋白修饰的改变，我们计算了整个基因组中读取区域相对于500bp区域的倍数变化（Day 28/Day 0）（the fold changes of reads aligning to 500bp regions throughout the genome was calcuated）。

总的来说，我们发现分化诱导的H3K4m3，H3K9ac，H3K27ac，以及H3K36me3的富集显示出正相关性，而抑制性甲基化的改变很大程度上与活化标志物的改变呈负相关（Fig.2B）。

我们进一步发现分化的诱导伴随着全基因组范围上的H3K9及H3K27的乙酰化缺失，而H3K4m3和H3K27m3的总体水平仍然相对恒定（Fig.2C;所有区域）。

把这种分析限定在基因启动子周围，我们发现乙酰化总体上缺失，但不是基因组范围上的，而H3K27m3富集程度在启动子处是总体上升高的（Fig.2C;±2kbof 5’）。

H3K4m3在启动子处的富集率保持不变（Fig.2C;±2kbof 5’）。

启动子区域数量很大，显示组蛋白富集程度在相应基因转录水平未发生变化的情况下增加或减少了（Fig.2D）。

特别是，数千个启动子处乙酰化的减少，伴有H3K9和H3K27之间极大范围的重叠（数据未给出），影响那些涉及基因调控，细胞生存，生长，以及增殖的基因（Fig.2D,2E）。

有趣的是，在其启动子处H3K27m3水平增高或降低的基因，与肿瘤发生有很强的关联。

H3K27m3富集程度的增加与神经系统发育有很强的关系（Fig.2E）。

对H3K4m3，其富集程度增加与发育过程相关，而降低与细胞周期有关（Fig.2E）。

一般来说，表达上调与H3K4m3，H3K9ac以及H3K27ac富集程度增加呈正相关（Supporting information Fig.S3）。

对H3K27m3的变化与基因总体水平上的表达情况之间没有发现什么相关性（Supporting information Fig.S3），分别只有131个上调的基因和81个下调的基因在其启动子区域显示出明显的富集程度变化（数据未给出）。

IPA分析发现这些基因功能上没有明显的富集。

除了组蛋白修饰，我们还研究了0天和28天时，4500个CpG位点上DNA 甲基化的总体变化，使用的是HumanMethylation450BeadChIP试验。

这种试验覆盖了99%的Refseq基因，每个基因平均覆盖17个CpG位点。

我们发现只有1273个CpG位点的甲基化状态发生了改变，其中1121个位点甲基化程度降低，152个位点甲基化程度增高。

甲基化状态变化与710个基因相关，平均每个基因1.7个CpG位点，只有27个受影响的基因超过了2个CpG位点（Supporting Information Fig.S4; Supporting Information Table S4）。

因此，DNA甲基化保持着相对恒定，在控制MSCs向肿瘤生成方向分化方面，没有表现出重要的调控作用。

RUNX2基因的替代性转录变异已知RUNX2是成骨分化的主要调控者，我们更详细地研究这个基因的表达情况。

在0天细胞中，通过RNA测序发现主要的转录源自P1启动子（Fig.3A）。

在诱导分化时，上游的P2启动子受诱导，正如从第28天的两个第一外显子（first exon）RNA测序数据增加所显示的那样（Fig.3A）。

另外，第28天时P2启动子处的H3K4m3，以及在P2和P1启动子之间的编码区域中的H3K36m3富集程度的增加，支持了P2转录起始位点的分化诱导性激活（Fig.3A）。