石蜡切片技术介绍

合在一起进行固定如：
单纯固定：
? 福尔马林formalin:10%的甲醛（37%——40%） ? 醋酸（0.3%~5%） ? 苦味酸（饱和溶液，三硝基苯酚） ? 铬酸0.5~1% ? 锇酸1~2% ? 升汞（氯化汞饱和水溶液约7%）
混合固定：
? 用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如： ? 卡诺氏固定液
（一）取材
杀生（动物） ? 1.目的：动物必须杀生，然后取出所需组织 ? 2.方法：一般采用乙醚（氯仿）麻醉后解剖，
取出所需组织。 ? 3.注意事项：
? 性别合适 ? 麻醉前动物生活正常，以免影响其代谢活动，
进而影响细胞结构 ? 取材部位要准， ? 速度快
（一）取材
1.目的：得到所需要的组织 2.方法：a.用剪刀剪下组织
（二）固定
1.目的： 为了使取样的细胞在形态结构和成分方面
保持与生活的状态一样，就必须迅速杀死细胞 避免失水变形，自溶破坏结构等。
固定液的选择：快；不溶解；不收缩膨胀； 软硬适中；增加折光度；增加染色能力；长期 保存等7项。
2.方法
? （1）固定剂的种类：一般采用化学固定 单纯固定：只用一种试剂固定： 混合固定：用两种或两种以上的试剂混
3.固定时应注意的事项
固定条件的选择： 种类、浓度、温度和时间 固定要快否则会自溶： 组织快，不能太多，否则固定不透：
（三）冲洗
1.冲洗的目的 除去固定剂，主要是防止固定的毒害作用，
固定时间太长，组织收缩变脆。
2.冲洗的方法
⑴ 冲洗液随固定液而定，冲洗的选择：不形 变提取，不反应，有效除去固定液。 ? ①固定液为水溶液时，以水或低浓度的酒精冲 洗； ? ② 固定液是酒精多以不同浓度的酒精冲洗， 以酒精冲洗，浓度要低于固定液的酒精浓度Байду номын сангаас 材料与酒精的比例一般为1：10（加入的体积） （70%乙醇换洗3次，每次20~60min ）
? 卡诺氏固定液 (Carnoy's Fluid) 适用于一般植物 组织和细胞的固定 ,常用于根尖 ,花药压片及子房 石蜡切片等 .有极快的渗透力 ,根尖材料固定 15—
20min即可,花药则需 1h左右,此液固定最多不超过 24h,固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止 ;如 果材料不马上用 ,需转入70%酒精中保存 .固定液的 重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染 色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱 性，达到优良染色效果。
? F.A.A固定液 又称标准固定液,万能固定液.适 用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片.在植 物形态解剖研究上应用极广;
? FAA固定液的优点在于：兼有保存剂作用,冰醋 酸既能抵消酒精和甲醛对组织的收缩作用又是 细胞核的优良固定剂，沉淀核蛋白，且对免疫 组化无碍更无掉片之理。FAA固定液具有强大 的固定效能，较之单纯固定更科学更快更好！ 对染色体的观察效果较差.
b.冲洗动物组织，动物（生理盐水、糜蛋白酶溶 液）植物（缓冲液或水）冲洗干净，防止失水，避免压挤 损伤，用生理盐水、糜蛋白酶冲去表面的血、粘液和赃物。
c.切成小块 3注意事项：
? 要准 ? 要快 ? 避免损伤（方向，刀要快，不能挤压） ? 植物取材：用剪刀剪下材料时一定要植物生活正常，不要 因缺水、营养和温度光照发生明显改变，影响细胞结构， 同时发育程度、部位要准。
（2）固定方法
? 静置固定： 将组织块放入盛有固定液的小的 称量瓶、小烧杯或青霉素瓶中，在室温或低 温（0~4℃）固定一段时间，不断摇动能增 加固定效果，植物和动物经常使用这种方法。
? 灌注固定： 常用于动物，将固定液通过已麻 醉的动物血管中，让血液流动，固定所需细 胞，该方法有点，固定均匀，不出现自溶现 象，但较繁琐。
第二章 石蜡切片技术
一、显微切片技术产生的原因
? 光学显微镜发展到一定程度之后，渴望知道细胞 结构
? 由于组织太厚，光线很难穿过 ? 压片可使组织变薄，但引起变形、易位，除核外，
看不到其他结构，因此需要切片变薄。 ? 因细胞水多，太软，无法切片
? 鉴于上述情况找到一种方法使 细胞水被替代， 变硬，能直接切片的方法，最广泛使用的就是 石蜡切片技术
3.注意事项
(1) 冲洗彻底——否则收缩、变硬、抽取 (2)不能时间太长太急——变软，肿胀（吸水） (3) 摇动有利于冲洗干净——加快分子运动
（四）脱水
1. 目的： 因石蜡与水不混合，在用石蜡透入前必须将细 胞中的水彻底脱掉，否则石蜡进不去材料，无 法让细胞变硬，无法进行切片。
2.方法
? 脱水剂的选择 原则：①凡与水和石蜡亲和性好的②且不使细胞剧
酒精：冰醋酸（3：1） 酒精：冰醋酸：氯仿（6：1：3）适用于动植物一 般组织细胞。 ? FAA 福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收缩;还 可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸发和材料变硬. ? 但单细胞及丝状藻类除外，也不适于细胞学研究
（2）冲洗方法
? 静置冲洗：加入冲洗液，静置一段时间，倒出 该液，加入新的冲洗液，反复几次（5~6次）， 每次30分钟左右，振荡有好处。（时间开始一 次为20~30分钟，以后几次可延长1~2h，）具 体时间与材料性质、大小和温度有关。
? 流水冲洗：将小瓶用纱布蒙住，放入盆中，流 水冲洗，效果较静置冲洗为好，时间为12~24h， 但流水不能太大太急，也不能太长，太长使组 织变软肿胀，冲洗时间有时长达24h左右，如 木本植物的木质部。
二、石蜡切片技术的优点
为什么选择这一技术呢？主要因为它有 以下优点：便于推广、经济、适用、简 便。
? 经济,价格低，可反复使用； ? 技术难度不大，容易掌握，但要精通也不
容易；
? 设备要求不高 ； ? 可长期保存； ? 染色容易，而且都能被染色，形成好的反
差和好的选择性。
三、石蜡切片的主要过程
杀生（取材）——固定——冲洗——脱水— —保存——透明——石蜡透入——包埋—— 切片——复水——染色——脱水——封藏— —观察保存 ? （一）取材、固定、洗涤、脱水 ? （二）透明、透蜡、包埋 ? （三）切片、贴片 ? （四）染色、封藏