中性甲醛固定液的配置
免疫组化技术(原理分类步骤及主要试剂设备准备
免疫组化技术原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫1酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
10中性福尔马林
产品名称：10%中性福尔马林组织固定液简介：10%中性福尔马林组织固定剂，是由10%中性福尔马林溶液（即4%甲醛）、磷酸盐缓冲液等组成。
用作固定的浓度为10%的福尔马林，实际含甲醛4%，10%福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
配制方法：在病理科、手术室中运用，10%福尔马林固定液具备两个条件。
条件一：福尔马林在溶液中的含量浓度为10%（即甲醛含量为4%），甲醛在水中最高浓度为40%，即10%的中性福尔马林溶液，其中甲醛含量即是10%的40%甲醛。
10%中性福尔马林固定剂条件二：10%中性福尔马林溶液的酸碱度为PH值7.2~7.4之间。
调配标准符合国家标准，具有完善的标准体系。
配制过程中特别注意事项：原料很重要，水、甲醛、磷酸二氢钠，磷酸氢二钠。
一般厂家很不注重水，自来水，蒸馏水、去离子水都不太标准。
康乃欣公司用的水是这样一个流程：自来水经过四次中性树脂过滤，目的是去除水中杂质和离子，接着经过紫外线灭菌，经过微纳米中性树脂过滤去菌体尸体，最后经过双重蒸馏后得到的水，才用于调配10%中性福尔马林固定剂。
康乃欣用的40%浓度甲醛，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠都是分析醇。
在配制10%中性福尔马林固定液使用车间，都是三十万级车间、机械流水线灌装。
康乃欣质量标准高于国家标准，采用国际通用标准。
产品用途：维持保存、固定细胞和组织固原有的形态和结构。
适用范围：用于人体、动物组织标本的固定。
产品成分：10%中性福尔马林溶液（即4%甲醛）、磷酸盐缓冲液等。
产品特点：渗透力强、固定均匀；对组织收缩少，尤其对神经及髓鞘、脂肪、糖等固定效果最佳。
操作步骤：1、先在组织固定剂上编号及写上相关信息；2、将离体组织及时浸入固定剂中，离体时间一般不超多5分钟，固定时间为2—12小时。
产品说明：1、组织标本的体积与液体的比例为1:4，此值效果最佳；不大于1:3.2、小块组织标本﹙小于1.2cm×1.2cm×0.6cm）及各种活检验组织标本，固定2—12小时即可，可直接进行切片、脱水、染色、镜检等操作。
免疫组化的染色操作的质控管理
1、 标本固定
固定液为 4%中性缓冲甲醛( 10 ml 甲醛 +90 ml PBS 缓冲液) 。要求离体后及时固定，固定液的量为标本体积的5 ～ 10 倍。固定不当，固定时间不够或过长，都可引起抗原丧失，尤其是一些较脆弱的膜抗原( 如 CD20 等) ，故固定应及时并充分。取材后小标本固定时间应 ＞ 6 h，肿瘤标本最好 ＞ 24 h。
复染是为了衬托免疫组化的阳性染色，所以苏木精颜色不宜太深，同时由于操作中使用了吸附玻片，所以建议复染的苏木精应勤于过滤，减少人为的背景染色。
8、 染色中的Biblioteka 些细节在整个染色过程中，切片始终保持湿润，不能干片。滴加一抗时应将切片上的水甩干，以免抗体被稀释。滴加抗体时要确保覆盖全部组织，以免边缘未覆盖到抗体，引起边缘效应。同时孵育盒要放平，以免抗体流至组织一端，造成假阴性或局部弱阳性结果。
6、 显色
如果发现配制好的 DAB 显色液中出现棕色沉淀那么此显色液可能失效，建议重新配制。在显色时，一般阳性局部广泛或阳性定位在胞质的组织，显色非常迅速，1 ～ 3 min 即可见明显的棕色，应及时终止显色。阳性局部稀少且定位在胞核的组织，那么需要显微镜下观察，时间不宜过长以免造成背景染色。
7、 复染
综上所述，质控工作总是发生在实验检测前才能生效。
如标本制作前的处理固定以及制作中的质控流程和切片质量对免疫组化的染色效果，都是相互影响、相互依存的。在免疫组化操作过程中，有许多至关重要的步骤，都是一环扣一环，每走一步都要进行有效监控，才能做出高质量的切片。因此要求操作人员有高度的责任心，严格遵循操作标准，为病理诊断提供表达准确、染色清晰的高质量的免疫组化染色。
4%中性甲醛固定液制备及质量评价
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几种细胞固定方法-细胞固定液选择标准
几种细胞固定方法选择最佳固定液标准是：（1）最好地保持细胞和组织的形态结构；（2）最大限度地保存抗原的免疫活性。
一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的；（3）不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光；（4）固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果。
单纯固定液（1）4%中性甲醛固定液：最常用的固定液，能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作（Job）。
中性甲醛是以的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液。
此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间不超过一个月。
（2）乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜，具有硬化、固定、脱水等作用，对组织渗透力较弱，因此很少单独使用，但其保存组织中的核酸强于中性甲醛，故常用于有核酸操作的实验或检查，假如用于证实尿酸结晶和保存糖原，可用于100%乙醇固定组织。
（3）4%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定。
混合固定液（1）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定。
该固定液有固定兼脱水作用，固定后的标本可直接入95%乙醇脱水。
（2）B5（醋酸钠-升汞-甲醛）固定液：多用于固定淋巴组织。
染色前应进行脱汞沉淀处理。
（3）Bouin固定液：非凡适用于睾丸活检组织的固定。
Bouin液对组织固定较均匀，收缩很少，不会使组织变硬变脆。
需现配现用。
（4）Carnoy固定液：穿透能力强，可很好的固定细胞质和细胞核，非凡适用于固定外膜致密的组织，也适用于糖原及尼氏小体的固定。
（5） Zenker固定液：经此液固定的标本，细胞核和细胞质染色颇为清楚，但成本较高且需非凡处理汞。
该固定液要避免接触阳光，以免引起化学变化而失效。
中性甲醛钙固定液(10%)
北京雷根生物技术有限公司
中性甲醛钙固定液(10%)
简介：
固定的目的在于保存细胞和组织的原有形态结构，固定剂能阻止内源性溶酶体酶对自身组织和细胞的自溶、抑制细菌和霉菌的生长。
固定剂通过凝固、生成添加化合物等使蛋白质内部结构发生改变，从而使酶失活。
固定剂对细胞核细胞外成分发生物理改变。
Leagene 中性甲醛钙固定液(10%)主要由甲醛、钙盐、磷酸盐、去离子水组成，pH 为7.2～7.4，该固定液适合于绝大多数组织的固定。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 按实验具体要求操作。
一般标本固定时间控制在1～4h/mm ，大标本应适当延长固定时间。
2、 固定好的组织，可在中性甲醛钙固定液(10%)或70%乙醇中长期保存。
注意事项：
1、 Leagene 中性甲醛钙固定液(10%)有一定刺激性和腐蚀性，请在通风较好的环境下小心操作， 避免吸入。
2、 温度对固定的影响很明显，提高温度可以加速固定作用，但温度不宜过高。
3、 取出新鲜组织后，应及时固定，无法及时固定时，应保存于生理盐水中及时送检。
4、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 12个月有效。
编号 名称 DF0097 Storage 中性甲醛钙固定液(10%) 500ml RT 避光 使用说明书 1份。
福尔马林
一、10%中性缓冲福尔马林
用途：10%中性缓冲福尔马林是一种良好的常规固定剂。
此液是在低渗缓冲离子中pH6.8
固定时间：标本固定1～4小时/mm，大标本应延长固定时间。
步骤：
1．多数外科病理标本都能接受甲醛固定。
2．标本可以无限期的保持在10%福尔马林中或转移到70%乙醇中。
二、4%多聚甲醛固定液：
用途：进行免疫组织化学方法研究时常选用该固定液。
动物灌注固定及后固定（动物器官经该液灌注后，然后取材，再用该液浸泡2-24小时）也常选该固定液固定。
混合后加热至60℃，搅拌并滴加1N NaOH 至清亮为止，冷却后加PBS 至总量1000 ml，调整PH为7.2-7.4。
几种细胞固定方法-细胞固定液选择标准
几种细胞固定方法选择最佳固定液标准是：1最好地保持细胞和组织的形态结构；2最大限度地保存抗原的免疫活性..一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用的；3不要用可能带有自发荧光的固定剂;如带有苦味酸的固定剂;还有甲醛升汞固定液;会使上皮细胞产生非特异性荧光；4固定剂的选择、固定时间、温度和PH值都会影响实验结果..单纯固定液14%中性甲醛固定液：最常用的固定液;能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作Job..中性甲醛是以PH7.2-7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的;其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%甲醛固定液..此固定液配制后应密封并保存在阴凉处;保存时间不超过一个月..2乙醇固定液：使用时以80%-95%的浓度为宜;具有硬化、固定、脱水等作用;对组织渗透力较弱;因此很少单独使用;但其保存组织中的核酸强于中性甲醛;故常用于有核酸操作的实验或检查;假如用于证实尿酸结晶和保存糖原;可用于100%乙醇固定组织..34%多聚甲醛固定液：主要用于培养细胞的固定..混合固定液1乙醇-甲醛乙醇-福尔马林;AF固定液：适用于皮下组织中肥大细胞的固定..该固定液有固定兼脱水作用;固定后的标本可直接入95%乙醇脱水..2B5醋酸钠-升汞-甲醛固定液：多用于固定淋巴组织..染色前应进行脱汞沉淀处理..3Bouin固定液：非凡适用于睾丸活检组织的固定..Bouin液对组织固定较均匀;收缩很少;不会使组织变硬变脆..需现配现用..4Carnoy固定液：穿透能力强;可很好的固定细胞质和细胞核;非凡适用于固定外膜致密的组织;也适用于糖原及尼氏小体的固定..5 Zenker固定液：经此液固定的标本;细胞核和细胞质染色颇为清楚;但成本较高且需非凡处理汞..该固定液要避免接触阳光;以免引起化学变化而失效..。
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中性甲醛固定液的配置免疫组化技术的关键问题1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。
如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。
组织及时取材组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h 内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm×5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。
固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。
从而完好的保存抗原和组织细胞形态。
) x! R; ^" s)2、固定固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。
所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。
固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构与生活时相仿。
另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加组织韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。
所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的4倍。
固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。
对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。
随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。
1）4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）：该固定液适用于免疫组织化学方法。
动物先用此液进行灌注固定，取材后，再用该液浸泡固定2-24h。
固定液配方1：40g多聚甲醛，溶于1000ml，0.1mol/L的PB液，不容易溶解，放于密封瓶中，60℃温箱过夜即可溶解，也可以加温至60℃，搅拌溶解。
固定液配方2：多聚甲醛40g，PBS0.1 mol/L PH 7.4 500 ml ，混合后加热至60℃，搅拌并滴加1N NaOH 至清亮为止，冷却后加PBS 至总量1000 ml。
注固定时间24小时。
2）4%多聚甲醛-磷酸二钠/氢氧化钠液：该固定液适用于光镜和电镜免疫组织化学方法。
用于免疫电镜标本时，应加入新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5-1%。
此固定液性质温和，可长期保存组织。
固定液配方：甲液-多聚甲醛40g，蒸馏水400ml；乙液-NaH2PO4?2H2O 16.88g，蒸馏水300ml；丙液-NaOH3.86g，蒸馏水200ml。
先将甲液中多聚甲完全溶解，乙液倒入丙液混合后倒入甲液，用1mol/LNaOH或1mol/L HCL 将pH调至7.2-7.4。
补充蒸馏水至1000ml，充分混合后，4℃保存。
3）中性缓冲甲醛液：对大多数抗原保存较好，是免疫组织化学最常用的固定液，组织穿透性好，组织收缩小。
最常用的固定液，能满足常规HE 及免疫组化、PCR等工作。
一般无特殊要求的病理标本均适用。
尤其值得注意的是，中性甲醛是以pH 7．2～7．4的磷酸缓冲液为溶剂配制的，其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4％甲醛固定液。
此固定液配制后应密封并保存在阴凉处，保存时间固定时间以24h以内为宜，不要超过一个月。
固定液配方1：40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的PBS90ml。
固定液配方2：40%甲醛120ml，蒸馏水880ml，磷酸二氢钠（NaH2PO4?H2O）4g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）13g。
固定液配方3：甲醛(40%) 100 ml，无水磷酸氢二钠 6.5 g，磷酸二氢钠 4.0g，蒸馏水900 ml。
固定液配方3：10%中性福尔马林固定液1000ml，Na2HPO4?12H2O 16.3g，NaH2PO4?2H2O 4.5g，福尔马林100ml。
3、样品的：组织标本固定于4%多聚甲醛中，4℃过夜后，移入PH7.4 ，0.O1MPBS,4 ℃过夜，换液1次，置低温冰箱-40℃冷藏保存待测。
4、样品的渗透和包埋：注入30%蔗糖4℃渗透至组织沉底，用包埋剂包埋，切片。
5、切片的保存：可放在-20℃冷藏保存待测。
二、免疫组化：（1）抗原修复6 p#1)抗原热修复% ?& g! r5 N& D- T' b在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
2)煮沸热修复, b- v# B$ }# J* v电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
3)微波热修复9 U2 x" K. i& y; O* J1 z2 E在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
4)酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。
适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
（2）免疫组织化学染色 3 Z. C/ S4 `. {! g9 ISP法1)水化；2) PBS洗2～3次各5分钟；7 E4 G& Y9 K% a A! S+ \3)3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟* l9 M( A; d' g- q3 @2 p7 W4)PBS洗2～3次各5分钟；: i2 u) W+ ?6 U1 i8 Y2 g5)抗原修复；; V3 j7 N5 l! F6)PBS洗2～3次各5分钟；& `4 {' G/ Q2 a" C" N* [9 P7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。
甩去多余液体。
8)滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
0 I. C, V/ X6 y# [10)PBS洗3次各5分钟；11)滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；12)抗中可加入0.05%的tween-20。
3 }$ [$ P& f6 C/ u: c1 R13)BS洗3次各5分钟；0 g# {7 u6 x8 E# W" P14)DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；15)PBS或自来水冲洗10分钟；16)苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17)自来水冲洗10～15分钟；& T ]4 I7 P' r( B$ X18)脱水、透明、封片、镜检。
SABC法* {1 x$ v- r+ A2 A! ~1)脱蜡、水化。
5 R8 K/ ]! S4 ~; h2 B3 S2)PBS洗两次各5分钟。
6 Y- C" `; E F( i+ E8 X3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
+ s8 o, P8 k$ g2 t, w4) 抗原修复。
5) PBS洗5分钟。
* `: y2 Z6 D! K4 p( }6) 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。
甩去多余液体。
l8 n; Z8 v) Z-Q7) 滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
9 T" n* |$ R% C1 P6 _! q8) PBS洗三次每次2分钟。
9) 滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。
# m% h; X/ M% g" a11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
" S3 I/ |6 u% i; k0 g12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14)蒸馏水洗。
苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
$ R" g! @1 Q- u15)脱水、透明、封片、镜检。
三、组织固定的注意事项1．及时取材：由于甲醛对组织的平均穿透速度只有0.8 mm/h，因此手术切除的送检标本应及时切开进行取材，以便保证重要的镜检部位能及时地得到固定。
2．及时固定：完成取材的组织块应立即投入固定液以便尽可能地保存组织细胞的形态结构和抗原性。
3．液量充分：一般情况下要求固定液的量应为组织体积的6～10倍。
4．适度固定：现代固定的要求是，在良好保存组织细胞形态结构的同时尽可能较好地保存组织细胞的抗原性。
长时间的固定会导致某些组织抗原性的逐渐丧失，因此，适时固定可以在保存细胞结构和抗原性之间取得必要的平衡。
对于较大的送检标本而言，在及时切开固定的基础上，应尽可能在24 h以内取材进入组织脱水程序。
5．适宜温度：低温可以降低固定的速度，反之可以加快固定进程。