免疫学检测中的干扰因素

免疫检测技术- 标记物
免疫测定技术均是以标记物示踪作为基 础，同位素、荧光素、酶是经典的三大标记 免疫测定技术。这三大标记技术发展了各种 各样的免疫测定方法，如RIA、ELISA、荧光 免疫测定、免疫化学发光测定等，目前应用 这三大标记技术的检测试剂盒在临床广为应 用。近年来，作为免疫测定发展方向的非同 位素标记技术以其敏感、安全等倍受关注。
免疫学检测方法中的 干扰因素和对策
第二军医大学附属长海医院实验诊断科
沈 茜
随着基础免疫学研究的深入和现代免 疫学理论的建立，使大量免疫学检测技术 被不断地创新、发明；在临床疾病诊治的 应用中也不断地推陈出新。目前应用免疫 学原理检测的检验项目占到三级综合医院 检验科全部检验项目的1／4，医疗收入约 占1／3。这就要求检验人员不断掌握最新 的临床免疫学知识和各种新的检验方法， 了解检验项目的基本原理。
干扰因素和对策- 类风湿因子
收集10份RF31～＞1000IU/L的患者血清， 在美国和欧洲66各临床实验室进行74个项目 的免疫竞争法或免疫夹心法检测，仪器和试 剂均配套。3445个结果中8.7％为假阳性。错 误高值结果中的21％（所有结果的1.8％）引 起了临床的错误诊断，在使用RF吸附剂后再 检测，错误结果得到纠正。39％的假阳性结 果也可在使用RF吸附剂后降低。
干扰因素和对策- 外源性物质
冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩， 分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时 应轻柔，不可强烈振荡。标本的反复冻融所 产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子 产生破坏作用，从而引起假阴性结果。
操作流程不当－造成结果的改变
我们对HBV血清标志物五项指标仅抗HBc总抗体单阳性的血清实行了严格的复检 措施，发现初、复检结果的符合率＜50%。 偏差如此之大是无法用实验人员操作不当解 释的。抗-HBc总抗体采用竞争抑制ELISA法 检测, 日常工作中无论标本多少，必然是先 加完血清标本后再加抗-HBc-HRP。这样， 血清中的抗-HBc与抗-HBc-HRP存在着明显 的‚不公平竞争‛。
148
41 4 3
3.0
0.82 0.08 0.06
干扰因素和对策- 嗜异性抗体
使用Access免疫化学发光检测系统测 定TSH、PSA、βHCG和皮质醇，前三项为 双位点非竞争法，后为竞争法。160份标本 测定HCG有5份（3.1%)假性升高；53份标 本（37.9%)用嗜异性抗体吸附剂吸收后结果 出现差异性下降；有4份标本的结果出现＞ 4SD的显著增高，使临床对结果的解释出现 改变。
干扰因素和对策- 嗜异性抗体
将11261份血清标本使用荧光时间分辨免 疫分析系统（PE公司，二步法、双位点）检 测CEA，将缓冲液中加入小牛IgG 约210个病 人、3.3~4.7%的标本出现假性升高；加入 15mg/L热处理小鼠IgG（MAK33 ）（Roche） 可将干扰降为0.86%；同浓度天然小鼠IgG无 效；去除捕获抗体或标记抗体的Fc段也可将 干扰降至0.1%。

干扰因素和对策- 外源性物质
标本管中添加物质的影响： 抗凝剂、酶抑制 剂（如NaN3可抑制ELISA系统中HRP活性）及分 离血清的分离胶等均对免疫检测有一定干扰作用。 应用三种检测系统分别测定100对同时采集的肌钙 蛋白阳性的血清与肝素抗凝血浆两组标本，在两者 测定值差异大于20%的结果中，ACS :Centaur cTnI占11%，Elecsys cTnT占9%，AxSYM cTnI 占2%，其他的抗凝剂如EDTA抗凝的血浆肌钙蛋 白测定结果也比血清低。 Clin Chem 2000;46(9):1338-44
要保证实验结果的正确性和可靠性，必 须对实验整个过程中各个环节中的干扰因素 有比较清楚的掌握和了解。在本次课中主要 生化 讨论的是标本本身内在因素、以及由于人为 因素对标本处理不当等引起的外在因素、对 临检 免疫检测结果造成的影响。在了解这些因素 的同时，如何在临床工作中注意和解决这些 干扰，以保证结果的准确性。
干扰因素和对策- 溶血或黄疸
一项针对溶血对电化学发光法影响的研 究发现，cTnT测定浓度的负偏倚与血清中血 红蛋白浓度相关，血红蛋白浓度每增1g/L ， cTnT＞0.1µg/L的可能性下降2.5% 。
Clinical Biochemistry 2004;37(8):398-701
标本中结合胆红素和未结合胆红素任 一或两者含量的增高都会对采用免疫学原理 的检测系统产生负干扰。
Clin Chem 2005;51(5):848-55
嗜靶抗原自身抗体的干扰－对策
为避免以上情况出现，解决的办法是： 测定前标本需用理化方法将免疫复合物解离 后再测定。解离液组成： 0.3%Triton X－100 1.5%CHAPS 15%SDS 100μl标本、50 μl解离液混匀，56℃ 30分钟 处理。
干扰因素和对策- 自身抗体
Erikssion等人采用针对cTnI中心稳定区 域抗原位点的捕获和检测抗体，开发了新的 cTnI检测方法，有利于具有cTnI自身抗体等 干扰物质的标本。采用新方法和目前一商品化 试剂盒共检测541份胸痛患者的血清，其中 13.5%的标本cTnI两种方法检测均阳性，14.2 %的标本仅采用新方法检测阳性 。上述结果 说明心梗患者存在cTnI自身抗体绝非特例 。
Int J Cardiol 2005;101(1):27-31
纤维蛋白的干扰－对策
为避免上述干扰作用，解决的办法最好是
血液标本采集后必须使其充分凝固再分离 血清，或标本采集时用带分离胶的采血管 或于采血管中加入适当的促凝剂。
怀疑检测结果存在纤维蛋白干扰的标本，
最好将标本4～10℃放臵过夜，离心后再检 测。
干扰因素和对策-纤维蛋白
用Abbott AxSYM分析了3962份血标本 中cTnI 水平，其中307份cTnI升高，将这307 份标本再离心前后测定cTnI的变化，24份标 本在离心后cTnI有>45%的降低，这种现象主 要出现在cTnI含量在2.0~25µg/L的标本。离 心后其中20份样本cTnI值低于正常cutoff值。
干扰因素和对策- 交叉反应物质
待检标本中存在类地高辛、类AFP样
物质等，是一些与检测的靶抗原有交叉反
应的物质。在用多克隆抗பைடு நூலகம்测定抗原时对
测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测
定抗原时 ，如果交叉抗原决定簇正好是所
用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，会出
现假阳性结果。
干扰因素和对策- 外源性物质
外源性物质常常是由于用于免疫测定的 血标本采集、贮存等不当所致。 标本受细菌污染： 因菌体中可能含有内源 性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本在以 辣根过氧化物酶为标记的 ELISA测定中，可 产生非特异性显色而干扰测定结果。
干扰因素和对策- 外源性物质
标本保存不当： 在冰箱中保存过久的标 本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成 二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过 深、甚至造成假阳性；有时抗原或抗体免疫活 性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰， ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能 立即测定，5天内测定的血清标本可存放于4℃， 1周后测定的血清标本应低温冻存。
免疫学检测- 干扰因素
标本自身及前处理所造成的干扰因素
－类风湿因子（RF） －嗜异性抗体 －自身抗体 －补体 －纤维蛋白 －溶血或黄疸 －交叉反应物质 －外源性物质
干扰因素和对策- 类风湿因子
患者体内存在的类风湿因子能显著干扰 许多免疫学检测方法，IgM、IgG型RF可以 与免疫检测系统中的捕获抗体及标记二抗的 Fc段直接结合，从而导致检测结果假阳性或 假性升高。RF对不同检测系统的干扰程度有 所差异，影响程度并不与RF的浓度成正比 。 目前，在临床工作中使用的免疫检测试剂盒 大部分均没有很好地防止RF干扰的措施，国 外著名公司要好于国内公司。
Clinical Chemistry 2002;48(11):2008~2016
RF的干扰－对策

捕获抗体用F(ab`)2替代完整的IgG
标本用连有热变性（63℃，10 min）IgG的
固相吸附剂（Euroimmune公司）处理（将 热变性IgG加入到标本稀释液或血清中同样 有效），4℃过夜离心后在检测；
补体的干扰－对策

用终浓度10～40mmol/L EDTA处理标本， 灭活补体。
用53℃、10 min或56℃、30 min加热血 清使C1q灭活。

干扰因素和对策- 纤维蛋白
在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下， 正常血液采集后1/2开始凝固，2h后完全凝固。 临床检验工作中，有时为了争取时间快速检 测，常在血液还未开始凝固时或未完全凝固 时即强行离心分离血清，此时血清中仍残留 部分纤维蛋白原，在免疫检测过程中可以形 成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结 果，尤其是在使用ELISA检测时。
Clin Chem 2003；49(7):1163～1169
嗜异性抗体的干扰－对策
在标本稀释液或待检标本中加入过量的动 物Ig (s) ，但加入量不足或亚型不同时无 效（要与捕获抗体和标记抗体的Ig亚型相 同）。 捕获抗体使用F(ab`)2，切除Fc段。

干扰因素和对策- 自身抗体
嗜靶抗原的自身抗体，如抗甲状腺球蛋 白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，能与 靶抗原结合形成复合物，在免疫检测系统中 均可对靶抗原的测定结果造成负性干扰。 判断嗜靶抗原的自身抗体对检测的负干 扰，因紧密结合患者的疾病诊断、病史、其 他实验检查的结果综合分析。如甲亢、甲低、 I型糖尿病等。
基本概念
抗原：是一类能刺激机体免疫系统产生特异
性免疫应答、并能与相应免疫应答产物（抗体 或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体： 是由抗原刺激B细
胞经分化增殖形成的浆细胞 合成和分泌的，能与相应抗 原发生特异性结合并具有多 方面免疫功能的球蛋白。