人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆研究

发表时间：2014-08-01T17:32:41.840Z 来源：《中外健康文摘》2014年第21期供稿作者：杨勇1 林琳2

[导读] 过表达的蛋白酶抑制因子或者人工合成的蛋白酶抑制因子都能有效地阻断蛋白酶活性。

杨勇1 林琳2

(1大连市妇幼保健院检验科辽宁大连 116033；2大连市友谊医院心内科辽宁大连 116001)

【摘要】目的：阐明人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆过程，获得人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽克隆载体，为后续构建Hespintor原核表达载体奠定基础。方法：提取pMD19-T Simple Vector-Hespintor克隆质粒后，应用RT-PCR法扩增Hespintor成熟肽基因片段，对Hespintor成熟肽克隆载体进行构建，及双酶切反应鉴定。结果：琼脂糖凝胶电泳，在约230bp处可见1条特异性条带；蓝斑和白斑斑点数量比对大约为1：1，说明转化效率大约为50%左右；经Bam HⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，约230bp处的条带为所克隆的人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因片段。结论：重组克隆质粒pMD19-T Simple Vector-Hespintor成熟肽基因构建成

功。

【关键词】人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因克隆 RT-PCR

【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）21-0078-02

在肿瘤的生长、血管生成以及侵润和转移过程中，除了生长因子与抑癌基因突变、细胞周期改变等尚有机制的参与外，蛋白酶扮演了最终共同途径的角色，并且在功能性或病理性组织重建过程中起到重要的作用[1]。蛋白酶的活性可由多个层次进行调控[1-3]，但最直接的方法还是阻断蛋白酶的活性。过表达的蛋白酶抑制因子或者人工合成的蛋白酶抑制因子都能有效地阻断蛋白酶活性，防止细胞外基质的降解[1,2,4]。因此，蛋白酶抑制因子的作用被更多的研究和关注，其中对组织金属蛋白酶抑制因子的研究最为深入，遗憾的是其临床应用效果并不理想[2]。

丝氨酸蛋白酶抑制因子是一类丝氨酸蛋白酶活性调节因子，参与血凝、纤溶、炎症、免疫反应、胚胎发生和个体发育过程。根据它们的序列、二硫键数目和三维结构，至少可以归类为18个非同源蛋白质家族。其中，Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子是较为保守的家族之一，目前已发现10多种，其成员主要包括PSTI、TATI、RECKA、ECRG2以及鸟类的卵清蛋白、顶体蛋白抑制因子、弹性蛋白抑制因子、溶血酶抑制因子等[5-7]。

应用抑制性差减扣除杂交技术研究了HBV DNA聚合酶反式调节靶基因，从肝母细胞瘤细胞系HepG2中筛选得到一未知功能新基因，经RT-PCR验证后，结合生物信息学确定该新基因属于一种新Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子，命名为hespintor[8]。同源分析表明，hespintor 具有与食管癌相关基因2高度同源的serpin基本结构。由于ECRG2具有抑制肿瘤细胞的增值、侵袭及转移等作用，因此提示hespintor可能也具有抑制肿瘤的侵袭与转移的能力，它在细胞中的生物学功能以及抗肿瘤作用有待于深入研究[9-11]。

为了研究hespintor对肿瘤细胞的增值、侵袭和转移的抑制作用，采用基因克隆技术建立hespintor的原核表达体系及纯化方法，观察hespintor重组表达蛋白在体内外是否对肿瘤细胞而行增值具有抑制作用。本文主要是阐明人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆过程，从而获得人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽克隆载体，为后续构建Hespintor原核表达载体奠定基础。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与质粒

（1）大肠杆菌菌株E.coil DH5α感受态细胞由本大连大学医学院中心实验室提供。

（2）pMD19-T Simple Vector购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2引物设计与合成

根据GenBank上公布的人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因序列, 通过运DNAman version4.0软件设计引物扩增人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因。引物F1、F2自行设计交由宝生物工程（大连）有限公司合成。

F1 5'-GGATCCGCCTAAGCCCCG-3'

F2 5'-GCGCAAGCTTATCACATTTTCCATATTTTTC-3'

1.1.3 主要试剂

1.1.4主要设备

1.2方法

1.2.1提取pMD19-T Simple Vector-Hespintor克隆质粒

质粒提取试剂盒由TaKaRa公司提供，操作过程严格按照说明书进行,产物置于-40℃保存。

1.2.2 PCR扩增Hespintor成熟肽基因片段

采用2×Taq PCR MasterMix，以pMD19-T Simple Vector-Hespintor克隆质粒为模板， F1/F2为引物，扩增Hespintor基因片段。

丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展教学提纲

丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展

丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展梁化亮（生物与食品工程学院，江苏常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体内，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。[关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御

1 丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主内环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体内的蛋白酶抑制剂在机体内与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体内免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体内的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体内环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体内的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞内蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类

(人)胰蛋白酶

重组人胰蛋白酶 Cat.No.:RHT03 CAS:9002-07-7 EC:3.4.21.4 来源：人胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达 1.重组生产，无动物源性重组人胰蛋白酶，氨基酸序列及性质与人胰蛋白酶完全相同。无动物源性，无病毒污染。可用于干细胞治疗、肿瘤的细胞治疗等过程中，无抗原性。 2.优势安全性高重组生产，无动物源性的病毒污染，如猪流感病毒、猪细小病毒等；特殊工艺，无内源性病毒污染，无细菌、真菌、支原体污染；冻干粉，运输及储存安全，活性不易损失；不含任何蛋白酶抑制剂，如PMSF等。上海雅心生物技术有限公司

?纯度高 HPLC纯化；活性特异，无其它蛋白酶活性。 ?活性高比活性不低于2500USP u/mg。 3.用途范围胰蛋白酶是一种内肽酶，可用于赖氨酸及精氨酸C末端剪切肽键，从而将大分子蛋白裂解为小肽。胰蛋白酶广泛用于各种生物技术过程中，如：细胞培养各种组织的细胞分离；变性蛋白质的降解；蛋白质的酶解、测序；干细胞、肿瘤的细胞治疗等。 4.特性纯化HPLC 产品性状白色或类白色冻干粉纯度（HPLC）≥95% 比活不低于2500USP u/mg 其他酶含量无糜蛋白酶、羧肽酶A等污染及活性不含任何蛋白酶抑制剂无PMSF、EDTA等任何蛋白酶抑制剂上海雅心生物技术有限公司

5.信息产品名称比活包装产地重组人胰蛋白酶≥2500USP u/mg10mg,100mg,1g上海雅心活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml(1cm光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。 6.相关产品重组猪胰蛋白酶；重组胰蛋白酶细胞消化液。上海雅心生物技术有限公司

胰蛋白酶分离工艺

1、集落刺激因子（G-CSF ）组成结构：是一种含有二硫键的单链糖蛋白，由175个氨基酸残基组成的单链非糖基化多肽链理化性质：①性状：无色澄明液体 ②分子量：20000，等电点为5.8～6.6 ③溶解度： ④稳定性：生理作用与临床适应症：作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能，主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症，分离纯化工艺： G-CSF 为无菌冻干粉剂，由含有10mM 醋酸钠pH 为4的蛋白溶液经0.2um 过滤后分装冻干。由含有高效表达人G-CSF 的原核表达系统（E.coli ）经发酵、分离和高度纯化后经冻干制成。纯化液聚乙二醇浓缩洗脱液柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀沉淀蛋白质盐析洗脱液纤维素柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀饱和度至加入硫酸铵透析液透析滤液超滤浓缩正常成人尿液150 ephadexG -%8020000 S DEAE 2、超氧化物歧化酶（SOD ）：组成结构：理化性质：①性状：淡蓝色冻干粉结晶体 ②分子量：32000左右 ③溶解度： ④稳定性：耐热性强，90℃ 环境120分钟酶活几乎没有损失，100℃环境60分钟酶活保持90%以上；稳定性高，在pH4.0—11.0范围内酶活稳定。生理作用与临床适应症：是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞分离纯化工艺：血液预处理,洗涤红细胞和溶血;去除大部分杂蛋白得SOD 粗品;再经柱层析分离得到精品。猪血经血液预处理、洗涤红细胞、溶血、乙醇一氯仿混合液除去血红蛋白，然后用坟柳043HZO 萃取、丙酮沉淀、55一65℃热变性得到粗酶液。粗酶液上阴离子DEAE 一Cellulose52交换层析柱、分子筛SephadexG-75柱,最终获得了纯化的铜锌超氧化物歧化酶。

人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆研究

人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆研究发表时间：2014-08-01T17:32:41.840Z 来源：《中外健康文摘》2014年第21期供稿作者：杨勇1 林琳2 [导读] 过表达的蛋白酶抑制因子或者人工合成的蛋白酶抑制因子都能有效地阻断蛋白酶活性。杨勇1 林琳2 (1大连市妇幼保健院检验科辽宁大连 116033；2大连市友谊医院心内科辽宁大连 116001) 【摘要】目的：阐明人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆过程，获得人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽克隆载体，为后续构建Hespintor原核表达载体奠定基础。方法：提取pMD19-T Simple Vector-Hespintor克隆质粒后，应用RT-PCR法扩增Hespintor成熟肽基因片段，对Hespintor成熟肽克隆载体进行构建，及双酶切反应鉴定。结果：琼脂糖凝胶电泳，在约230bp处可见1条特异性条带；蓝斑和白斑斑点数量比对大约为1：1，说明转化效率大约为50%左右；经Bam HⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，约230bp处的条带为所克隆的人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因片段。结论：重组克隆质粒pMD19-T Simple Vector-Hespintor成熟肽基因构建成功。【关键词】人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因克隆 RT-PCR 【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）21-0078-02 在肿瘤的生长、血管生成以及侵润和转移过程中，除了生长因子与抑癌基因突变、细胞周期改变等尚有机制的参与外，蛋白酶扮演了最终共同途径的角色，并且在功能性或病理性组织重建过程中起到重要的作用[1]。蛋白酶的活性可由多个层次进行调控[1-3]，但最直接的方法还是阻断蛋白酶的活性。过表达的蛋白酶抑制因子或者人工合成的蛋白酶抑制因子都能有效地阻断蛋白酶活性，防止细胞外基质的降解[1,2,4]。因此，蛋白酶抑制因子的作用被更多的研究和关注，其中对组织金属蛋白酶抑制因子的研究最为深入，遗憾的是其临床应用效果并不理想[2]。丝氨酸蛋白酶抑制因子是一类丝氨酸蛋白酶活性调节因子，参与血凝、纤溶、炎症、免疫反应、胚胎发生和个体发育过程。根据它们的序列、二硫键数目和三维结构，至少可以归类为18个非同源蛋白质家族。其中，Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子是较为保守的家族之一，目前已发现10多种，其成员主要包括PSTI、TATI、RECKA、ECRG2以及鸟类的卵清蛋白、顶体蛋白抑制因子、弹性蛋白抑制因子、溶血酶抑制因子等[5-7]。应用抑制性差减扣除杂交技术研究了HBV DNA聚合酶反式调节靶基因，从肝母细胞瘤细胞系HepG2中筛选得到一未知功能新基因，经RT-PCR验证后，结合生物信息学确定该新基因属于一种新Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子，命名为hespintor[8]。同源分析表明，hespintor 具有与食管癌相关基因2高度同源的serpin基本结构。由于ECRG2具有抑制肿瘤细胞的增值、侵袭及转移等作用，因此提示hespintor可能也具有抑制肿瘤的侵袭与转移的能力，它在细胞中的生物学功能以及抗肿瘤作用有待于深入研究[9-11]。为了研究hespintor对肿瘤细胞的增值、侵袭和转移的抑制作用，采用基因克隆技术建立hespintor的原核表达体系及纯化方法，观察hespintor重组表达蛋白在体内外是否对肿瘤细胞而行增值具有抑制作用。本文主要是阐明人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆过程，从而获得人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽克隆载体，为后续构建Hespintor原核表达载体奠定基础。 1.材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株与质粒（1）大肠杆菌菌株E.coil DH5α感受态细胞由本大连大学医学院中心实验室提供。（2）pMD19-T Simple Vector购自宝生物工程（大连）有限公司。 1.1.2引物设计与合成根据GenBank上公布的人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因序列, 通过运DNAman version4.0软件设计引物扩增人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因。引物F1、F2自行设计交由宝生物工程（大连）有限公司合成。 F1 5'-GGATCCGCCTAAGCCCCG-3' F2 5'-GCGCAAGCTTATCACATTTTCCATATTTTTC-3' 1.1.3 主要试剂 1.1.4主要设备 1.2方法 1.2.1提取pMD19-T Simple Vector-Hespintor克隆质粒质粒提取试剂盒由TaKaRa公司提供，操作过程严格按照说明书进行,产物置于-40℃保存。 1.2.2 PCR扩增Hespintor成熟肽基因片段采用2×Taq PCR MasterMix，以pMD19-T Simple Vector-Hespintor克隆质粒为模板， F1/F2为引物，扩增Hespintor基因片段。

胰蛋白酶抑制剂的测定.doc - NY

NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T1103.2－2006 转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定 Safety assessment of genetically modified plant and derived products Part 2: assay of anti-nutrients pancreatic typsin inhibiter 2006-07-10发布2006-10-01实施中华人民共和国农业部发布

前言本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、农业部科技发展中心、中国农业大学、天津市卫生防病中心。本标准主要起草人：杨月欣、王竹、韩军花、李宁、汪其怀、黄昆仑、刘克明、刘培磊、连庆。本标准首次发布。

转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定 1 范围本标准规定了转基因植物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定方法。本标准适用于转基因大豆及其产品、转基因谷物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定。其他的转基因植物，如花生、马铃薯等也可用该方法进行测定。 2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。 2.1 转基因植物genetically modified plant 指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的植物。 2.2 转基因植物产品products derived from genetically modified plant 指转基因植物的直接加工产品和含有转基因植物的产品。 3 原理胰蛋白酶可作用于苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPA），释放出黄色的对硝基苯胺，该物质在410 nm下有最大吸收值。转基因植物及其产品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应，使吸光度值下降，其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。用分光光度计在410 nm 处测定吸光度值的变化，可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。 4 试验材料转基因植物及其产品、受体植物及其产品。如果对转基因植物产品中的胰蛋白酶抑制剂进行测定，转基因植物产品和受体植物产品的处理条件应相同。上述材料的水分含量和种植环境应基本一致。

常见蛋白酶抑制剂

当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全日期：2012-06-13 来源：互联网标签：相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统广州赛诚生物基因表达调控专题蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;

丝氨酸蛋白酶抑制物在2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者中的意义

丝氨酸蛋白酶抑制物在2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者中的意义目的分析血清丝氨酸蛋白酶抑制物（vaspin）在2型糖尿病（T2DM）合并颈动脉粥样硬化（CAS）患者中的意义。方法根据有无CAS，将197例T2DM 患者分为CAS T2DM组（A组）和单纯T2DM组（B组）与正常对照组（NC 组）比较血清vaspin水平。结果T2DM患者vaspin高于NC组（P＜0.05）；B 组vaspin较A组高（P＜0.05）。结论vaspin在T2DM合并CAS患者血管病变中有保護作用。标签：Vaspin；血管病变；糖尿病，2型 [Abstract] Objective To analyze the significance of serine protease inhibitor in patients with type 2 diabetes and carotid artherosclerosis. Methods 197 cases of T2DM patients were divided into the CAS T2DM group （A group）and simple T2DM group （B group）according to whether there was CAS，and the serum vaspin level was compared with that in the normal control group. Results The vaspin in the T2DM patients was higher than that in the NC group（P＜0.05），and the vaspin in the group B was higher than that in the group A（P＜0.05）. Conclusion The vaspin has a protection effect in the vascular lesion of patients with T2DM and CAS. [Key words] Vascular；Vascular lesion；Diabetes；Type 2 2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者死亡原因中大血管病变占59%[1]。丝氨酸蛋白酶抑制物（vaspin）参与了糖尿病大血管病变的发生发展的过程。该研究探讨T2DM患者血清vaspin与颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis，CAS）的关系，并探讨其机制。 1 资料与方法 1.1 一般资料选取2016年1—5月于保定市第一中心医院内分泌一科住院治疗的T2DM 患者197例（T2DM组），均符合WHO1999年推荐的T2DM诊断与分型标准。其中男性107例，女性90例。按照有无CAS分为T2DM合并CAS组（A组）111例和单纯T2DM组（B组）86例，其中A组男56例，女55例，B组男51例，女35例。排除标准：其他类型糖尿病者；合并严重其他系统疾病者；糖尿病急性并发症者；应激状态者；近期有创伤、手术者。正常对照组（NC组）70名，为同期健康体检者，NC组男45名，女25名。 1.2 方法

胰蛋白酶抑制剂对Wnt信号通路的作用

万方数据

胰蛋白酶抑制剂对Wnt信号通路的作用作者：伊凤双， YI Feng-shuang 作者单位：山西大学生物技术研究所,太原,030006 刊名：国际肿瘤学杂志英文刊名：JOURNAL OF INTERNATIONAL ONCOLOGY 年，卷(期)：2010,37(5) 参考文献(21条) 1.Fogarty MP;KesslerJD;Wechsler-Reya RJ Morphing into cancer:the role of developmental signaling pathway in brain tumor formation 2005(04) 2.Moon KC;Cho SY;Lee HS Distinct expression pattems of E-Cadherinand beta-cateninin signetring cell carcinoma components of primary pulmonary adcnoesrcinoma 2006(09) 3.Khor TO;Gul YA;Ithnin H A comparative study of the expression of Wnt-1.WISP-1 sundvin and cyclin-D1 in colorectal carcinomas[外文期刊] 2006(04) 4.Luo W;Zou H;Jin L Axin contains three separable domains that confer intramolecular,homodimeric,and heterodimeric interactions involved in distinct fuctions 2005(06) 5.Krieghoff E;Behrens J;Mayr B Nucleo-cytoplasmic distribution of beta-catenin is regulated by retention[外文期刊] 2006(Pt7) 6.Li YY;Zhang Z;Wang ZH rBTI induces apoptosis in human solidtumor cell lines by loss in mitoehondrial transmembrane potential and caspase activation[外文期刊] 2009(02) 7.Kennedy AR;Billings PC;Wan XS Effects of Bowman-Birk inhibitor on rat colon carcinogenesis[外文期刊] 2002(02) 8.李卓玉;袁静明肿瘤抑制蛋白APC的结构与功能[期刊论文]-生命的化学 2006(02) 9.While SR;Williams P;Wojcik KR Initiation of apoptosis by actin cytoskeletal derangement in human airway epithelial cells[外文期刊] 2001(03) 10.Avizienyte E;Wyke AW;Jones RJ Scr-induced deregulation of E-cadherin in colon cancer cdlls requires integrin signaling[外文期刊] 2002(08) 11.Kim PJ;Plescia j;Clevers H Survivin and molecular patho-genesis of colorectal cancer[外文期刊] 2003(9379) 12.Zhang T;Otevrel T;Gao Z Evidence that APC regulates survivin expression:a possible mechanism contributing to the stem cell origin of colon[外文期刊] 2001(24) 13.Hoffman WH;Biade S;Zilfou JT Transcriptional repression of the anti-apoptotic survivin gene by wild type p53 2002(05) 14.Masur K;Lang K;Niggemann B High PKC alpha and low E -cadherin expression contribute to high migratory activity of colon carcinoma cells 2001(07) 15.Le TL;Joseph SR;Yap AS Protein kinase C regulates endocytosis and recycling of E-cadherin 2002(02) 16.Chen CL;Chen HC Functional suppression of E-cadherin by protein kinase Cdelta 2009(Pt 4) 17.Kobayashi H;Suzuki M;Tanaka Y Suppression of urokinase expression and invasiveness by urinary trypsin inhibitor is mediated through inhibition of protein kinase C-and MEK/ERK/c-Jun-dependent

蛋白酶抑制剂的研究进展

蛋白酶抑制剂的研究进展郭川微生物专业，200326031 摘要：自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，本文就各大类蛋白酶抑制剂的结构特点，活性部位的研究概况及其在各领域应用的原理及进展。关键词：蛋白酶抑制剂；结构；应用天然的蛋白酶抑制剂(ＰＩ)是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,由于其分子量较小,所以在生物中普遍存在。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化有活性的酶。在一系列重要的生理、病理过程中:如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等，PI发挥着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成部分。从Ｋｕｎｉｔｚ等最早分离纯化出一种ＰＩ至今,已有多种ＰＩ被发现,根据其作用的蛋白酶主要分以下几类:抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂,抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶Ｄ等的羧基蛋白酶抑制剂、抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂等。而根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性,可将自然界发现的PI分为四大类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[1]。 1 结构与功能 1.1丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Protease Inhibitor,Serpin）丝氨酸蛋白酶抑制剂是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年演变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂。Sepin为单一肽链蛋白质。各种serpin大约有30％的同源序列，疏水区同源性高达70％。血浆中的serpin多被糖基化，糖链经天东酰胺的酰胺基与主链相连。位于抑制性serpin表面、距C端30～40个氨基酸处的环状结构区RSL（reactive site loop）中，存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P1[2]；近C端与P1相邻的氨基酸为P1’，依此类推，即肽链结构表示为N端-P15～P9～P1-P1’～P9’～P15’-C端。在对靶酶的抑制中。Serpin 以RSL中的类底物反应活性位点与靶酶形成紧密的不易解离的酶-抑制剂复合物，同时P1-P1’间的反应活性位点断裂。几种perpin氨基酸序列比较发现，serpins各成员的抑制专一性是由P1决定的，且被抑制的酶特异性切点一致。如抗凝血酶，抑制以Arg羧基端为敏感部位的丝氨酸蛋白酶，其中P1为Arg[2]。 1.2巯基蛋白酶抑制剂（Cytsteine Proteinase Inhiitor，CPI）对于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)已有大量研究,巯基蛋白酶抑制剂(CPI)的研究则相对要晚一些。而动物和微生物来源的CPI已有一些研究,发现它们在结构上具有同源性,Barrett等将CPI统称为胱蛋白超家族,并按分子内二硫键的有无与数量,分子量大小等将此家族分为3个成员(F1、F2、F3)。在3个家族中,大多数F1和F3的CPI中都有Glu53-Val54-Val55-Ala56-Gly57保守序列,其同源序列在其它CPI中也被发现,如Ｆ2中的Gln-Ｘ-Val-Ｙ-Gly和CHα-ras基因产物中的Gln-Val-Val肽段。人工合成的Glu-Val-Val-Ala-Gly 短肽也显示对木瓜蛋白酶有抑制活性,因此可以认为这一保守区段在抑制活性中起着全部或部分的关键作用[3]。对植物来源的ＣＰＩ研究的不多,已有报道的有水稻、鳄梨和大豆。水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) 具有102个氨基酸残基,有典型的Glu-Val-Val-Ala-Gly保守序列,应与动物CPI同源进化而来。从OCI没有二硫键来看,它应归为F1成员,但从序列比较看,则更接近F3。对OCIGlu---Gly保守序列进行点突变试验表明,突变使其抑制活性大幅度下降,其中当Glu被Pro替代时则活性全无,由此说明,这一段保守序列在OCI的抑制活性中,同动物CPI一样必不可少。除Glu---Gly保守区域外,OCI序列中其

丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展

丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展梁化亮（生物与食品工程学院，常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。 [关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御

1 丝氨酸蛋白酶抑制剂免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体的蛋白酶抑制剂在机体与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类目前，典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂基于其序列、拓扑结构及功能的相似性，至少可分为18个家族[5]，如表1－1所示。不同家族抑制剂的空间结构也不同。通常这类抑制剂是β片层或混合了α螺旋和β片层的蛋白质，也可能是α螺旋或富含二硫键的不规则蛋白质。但它们都拥有规的反应活性位点环的构象，从而使这些非相关的蛋白质具有相似的生物学功能[6]。因此典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂最明确最广泛地代表了蛋白质的趋同进化。 1.2 Serpins Serpins是一类分子量较大的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，氨基酸残基数为

常见蛋白酶抑制剂

蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全标签：相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统广州赛诚生物基因表达调控专题蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9; 3)溶液在4℃稳定六个月以上;

4)工作浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml); 5)加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。胃蛋白酶抑制剂(pepst anti n) l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶; 2)1mg/ml溶于甲醇中; 3}储存液在4℃一周内稳定，-20℃稳定6个月; 4)1作浓度:0.7ug/ml(1umol/L) 5)在水中不溶解。亮抑蛋白酶肽(leupeptin) 1)抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶B; 2)lOmg/ml溶于水; 3)储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度0.5mg/ml。胰蛋白酶抑制剂(aprotinin) 1)抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶; 2)lOmg/ml溶于水，pH7~8 3}储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度:0.06~2.0ug/ml(0.01~0.3umol/L); 5)避免反复冻融: 6)在pH>12.8时失活。蛋白酶抑制剂混合使用 35ug/ml PMSF…………………………………丝氨酸蛋白酶抑制剂 0.3mg/ml EDTA…………………………………金属蛋白酶抑制剂 0.7ug/ml胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)…………酸性蛋白酶抑制剂 0.5ug/ml亮抑蛋白肽酶(Leupeptin)……………广谱蛋白酶抑制剂

α1-抗胰蛋白酶缺乏症发病机理

α1-抗胰蛋白酶缺乏症发病机理 *导读：α1-抗胰蛋白酶缺乏症是血中抗蛋白酶成份-α1- 抗胰蛋白酶(简称α1-AT)缺乏引起的一种先天性代谢病，通过常染色体遗传。临床特点为新生儿肝炎，婴幼儿和成人的肝硬化、肝癌和肺气肿等。…… α1-抗胰蛋白酶缺乏症是血中抗蛋白酶成份-α1-抗胰蛋白酶 (简称α1-AT)缺乏引起的一种先天性代谢病，通过常染色体遗传。临床特点为新生儿肝炎，婴幼儿和成人的肝硬化、肝癌和肺气肿等。【发病机理】蛋白电泳时α1-AT位于α1球蛋白带内，α1-AT为一种肝脏合成的糖蛋白，半衰期约4～5日。血清中有对胰蛋白酶活性起抑制作用的物质，其中α1-AT起90%的作用。除抑制胰蛋白酶活性外，α1-AT还可抑制糜蛋白酶、凝血因子Ⅻ辅助因子及中性粒细胞的中性蛋白水解酶作用。α1-AT存在于泪液、十二指肠液、唾液、鼻腔分泌物、脑脊液、肺分泌物及乳汁中，羊水中α1-AT 浓度相当于血清的10%，炎症刺激、肿瘤、妊娠或用雌激素治疗可使血清α1-AT浓度增加2～3倍，但这些刺激对α1-AT缺乏症患者则几乎无效。正常人体内常存在外源性和内源性蛋白酶，如细菌毒素和白细胞崩解出的蛋白酶对肝脏及其他脏器有破坏作用，α1-AT可拮抗

这些酶类，以维持组织细胞的完整性，α1-AT缺乏时，这些酶均可侵蚀肝细胞，尤其是新生儿肠腔消化吸收功能不完善，大分子物质进入血液更多，α1-AT缺乏的婴儿肝脏更易受损害。此外，α1-AT还具有调节免疫应答、影响抗原-抗体免疫复合物清除、补体激活以及炎症反应的作用，并可抑制血小板的凝聚和纤溶的发生。α1-AT缺乏时上述机体平衡的机制失调，导致组织损伤。

DTT水解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究_赵美琳

大豆蛋白是人类最主要的植物蛋白质来源，但豆类植物在提供丰富营养的蛋白质资源的同时，又广泛存在着各类营养限制性因子，其中STI 就是其中之一。一些学者研究发现STI 是导致大豆利用率下降的最根本的原因，它限制了人体和动物对豆类蛋白质的吸收和利用，STI 分子内含有跨链的二硫键，使得STI 结构稳定，耐热耐酸。许多植物STI 的一个分子可以同时结合两分子的蛋白酶，这就造成了蛋白酶失去与蛋白质底物结合的机会，因此我们必须通过特定的方法除去或克服STI 所带来的不利影响，才能充分利用豆类蛋白质资源。本文主要选择DTT 对STI 的水解作用，采用分光光度法、SDS-PAGE 和GPC 色谱法相结合，对STI 的水解程度进行分析研究。1实验材料与方法1.1实验材料1.1.1主要试剂 DTT 溶液、TGase 溶液、Tris-Hcl 缓冲液(50moI/L ，pH7.5)、大豆胰蛋白酶抑制剂溶液（5000BAEE/mL ）、BAPNA 溶液（0.4mg/mL ）、胰蛋白酶溶液（5,000BAEE/mL ）、30%(v/v)冰醋酸溶液、电泳试剂等1.1.2主要仪器电子分析天平、电子恒温水浴锅、PHS-25型酸度计、78-1型电磁搅拌器、752分光光度计、DY-III 型电泳仪、Waters 高效液相色谱仪、凝胶成像系统等。1.2实验方法 1.2.1DTT 对STI 的水解 DTT 对STI 的水解步骤如图l 所示。图1DTT 水解STI 的方法对照样为0.25ml 大豆胰蛋白酶抑制剂加入1mL 的TGase(1U/mL)，然后50℃水浴恒温8h 后，100℃灭酶5min,反应液4℃储藏以备后用。 1.2.2采用分光光度法测定STI 水解程度实验方法如图2所示。图2测定DTT 对STI 的水解步骤对照样为不经处理的STI 原溶液，其余操作相同。用空白样做参比，分别取样液及对照样溶液，通过比较处理的STI 与不经处理的STI 原液反应的样品在410nm 的吸光值，就可由残留的胰蛋白酶活性间接检测出DTT 及TGase 对STI 的水解程度。另外，用0.lmL 胰蛋白酶溶液加上0.31mLTris-Hcl 缓冲液，混匀后与2mLBAPNA 溶液于75℃水浴反应15min ，然后加入0.lmL30%冰醋酸中止反应，在410nm 下比色，测定胰蛋白酶的活力(A 410表示)。当STI 完全水解时，胰蛋白酶表现出最高活力，这时反应液的吸光值最大；当STI 未被水解时，胰蛋白酶表现出最低活力，这时反应液的吸光值最小；当STI 部分钝化时，反应液的吸光值介于他们之间。因此，可用下式表示STI 钝化的相对活力大小: STI 的相对失活（%）=（样液的A 410值－对照样的A 410 值）／胰蛋白酶活力（A 410值）1.2.3SDS-PAGE 分析将STI 与反应液进行SDS-PAGE 分析，电泳胶按表l 所四川职业技术学院学报 2010年8月Journal of Sichuan Vocational and Technical College Aug ．2010 第2０卷第3期vol．2０No．3 收稿日期：２０１０—０６—０８作者简介：赵美琳（１９６８—），女，漯河职业技术学院食品工程系，副教授。主要研究方向：食品生物技术。 DTT 水解大豆胰蛋白酶抑制剂的研究赵美琳，张素霞（漯河职业技术学院，河南漯河 462002）摘要；大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)可以抑制一些来源于动物或植物的蛋白酶的活力，使之降低水解蛋白质的效力，降低蛋白质的利用率。本文主要选取二巯基苏糖醇（DTT ）采用分光光度法、SDS-PAGE 和GPC 色谱法相结合测定DTT 对大豆胰蛋白酶抑制剂的水解程度进行研究。关键词；DTT ；水解；大豆胰蛋白酶抑制剂中图分类号:Ｑ５５６．３文献标识码:A 文章编号:1672-2094(2010)03-0120-03 ·１２０ ·

丝氨酸蛋白酶 (2)

丝氨酸蛋白酶摘要：丝氨酸蛋白酶是一种种类丰富的酶类【1】，之所以以此命名是因为在酶的催化活性位点上包含丝氨酸在内的丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸组成的催化三联体。有些丝氨酸蛋白酶类如凝血酶类蛋白酶，其中包括凝血酶，组织纤维蛋白溶酶原激活剂、血纤维蛋白溶酶，它们参与凝血的发生以及炎症应答反应；也有些如胰蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶类的参与消化的酶类，包括胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶；还有一些表达在神经系统中的丝氨酸蛋白酶类，这些酶类与神经系统正常的维持或是介导病理情况的发生。其实丝氨酸蛋白酶类在执行功能的时候也受到许多因素的限制，如受一些抑制剂的影响等，这些物质对蛋白酶功能的执行起到重要的作用。关键词：丝氨酸蛋白酶催化机制功能调节酶的功能已知所有的蛋白分解酶类丝氨酸蛋白酶占到了其中的三分之一，这些酶又可以细分成很多种类有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂、神经源类的丝氨酸蛋白酶等。这些酶类具有消化凝血、纤溶、消化、受精、生长发育、凋亡、免疫等方面都有重要的作用。酶的催化位点由于丝氨酸蛋白酶的种类很多根据其催化的特点以及种树亲疏性可以分成不同的类别，不同的组织器官，不同的生物种系中酶的分布与种类是不同的(见表格)。但是其催化特点通常都是其反应的催化三联体，丝氨酸的亲核攻击，即丝氨酸的羟基攻击酰胺键的羰基碳，但是在生物进化的长时间了这种催化活性结构也发生了改变。如在有些酶中其催化三联体不在是固定的丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸，而是只有丝氨酸与天冬氨酸或是组氨酸的一种组成催化活性位点，也有的如组氨酸成对出现于丝氨酸组合形成新的催化结构，但是无论怎样其上的丝氨酸残基是固定保守的。酶的活化对于丝氨酸蛋白酶类的活化，一般来说是通过对酶前体【2】的加工使其形成具有催化活性的酶，或者是通过一些辅助因子的协同作用使其由闭合的非活化状态转成活性状态，也有通过信号的捕获诱发一系列的级联反应从而活化蛋白，或是通过一些关键因子的作用使得构想发生改变来实现活化等等。通常来说酶的状态一种是抑制非活化状态，另一种是活化的活性状态，但是在一些研究中酶具有新的状态，而这种状态与酶原或是缺少辅因子而显示无活性的酶的状态是不同的，虽然这种状态下的酶也没有活性，但是其结构上出现一些特有的变化，在对凝血酶的研究中发现，这种状态称为E*【3】，其伴有一些氨基酸链陷入酶的催化活性部位从而破坏其中的氧离子空穴，致使没得活性受阻，因此对于这种酶的活化一定有其他的方式，研究发现当E*状态下在远离活性部位连接一种配体时会将这种氨基酸陷入活性位点的状况扭转过来，从而恢复酶的活性位点，并在其他因子的作用下得到活化。酶的催化机制对于丝氨酸蛋白酶类的催化活性，有的是通过前体酶原的活化，比如胰蛋白酶类