实验一 小鼠睾丸、附睾及输精管精子采集、运动能力检测与结构观察
实验一 精子的制片、活力及密度测定
实验一精子的制片、活力及密度测定一目的1. 掌握小鼠精子的制片方法。
2.了解评定精液品质的方法。
3. 掌握精子活力的估测方法及血球计数器进行精子密度测定的方法。
二小鼠精子制片及观察1.仪器和试剂眼科手术剪、镊子、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、带橡皮头吸管、载玻片、盖玻片、生理盐水、甲醇（分析纯）、2%伊红溶液2.动物选择成熟的大鼠、小鼠均可使用。
一般采用雄性小鼠，年龄6-8周。
3.制片用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml 的生理盐水平皿中，以眼科剪将附睾剪成小块，用吸管将悬液轻轻吹打5-6次，静置3-5分钟，用四层擦镜纸滤除组织碎片，制得精子悬液。
左手食指和拇指向上捏住载玻片两端，使载玻片处于水平状态，取此精子悬液滴至载玻片右侧。
右手拿一载玻片或盖玻片，使其与左手拿的载玻片呈向右的45度角，并使其接触面在精液滴的左侧。
将载玻片向右拉至精液刚好进入两载玻片形成的角缝中，然后平稳地推至左边（不得再向回拉），做成精液抹片。
必须注意精液抹片不要太厚，同时要防止用力过大而造成人为的畸形精子数增多。
抹片后，使其自然风干。
晾干后用甲醇固定5分钟，干燥后即可镜检。
也可用2%的伊红溶液染色1-2小时后再做镜检。
三精液品质检查(一) 直观检查1. 精液量：将采得的精液倒在有刻度的试管或杯中，测其容量。
各种常用实验动物的射精量平均为：大鼠0.05～0.2毫升，豚鼠0.4～0.8毫升，兔0.4～6.0毫升，犬2.0～15.0毫升。
2. 观察精液的色泽并嗅闻气味。
色泽：正常精液一般为乳白色或白色，密度越高，乳白色程度越浓，其透明度也越低。
其它颜色均为不正常颜色。
气味：一般为无味或略带腥味。
3.精液的云雾状翻腾滚动。
云雾状显著者以“＋＋＋”表示，有云雾状以“＋＋”表示，云雾状不明显者以“＋”表示。
(二)精子活力检查精子的活动有三种类型：前进运动、旋转运动和振摆运动，评价精子活力是根据精液中呈直线前进运动的精子数占总精子数的百分率。
实训2公畜生殖器官观察课件.
4．阴茎和包皮。观察各种公畜阴茎的外形特征，尤
其注意比较各种公畜的龟头形状和尿道突特点。
5．睾丸组织切片的观察。先用低倍镜观察，分出睾 丸白膜、纵隔，进一步观察睾丸中隔、小叶及许多曲精细 管的断面。然后在高倍镜下观察睾丸小叶中曲精细管及间 质细胞的形状，选一清晰的曲精细管进一步观察复层上皮
和致密结缔组织。注意支持细胞和不同发育阶段生精细胞
三、方法步骤
1.睾丸和附睾的形态观察。注意观察睾丸的前后端
及附着缘。认识附睾头、附睾体和附睾尾。比较各种公 畜的睾丸，注意它们各自的特征。 2.精索、输精管的观察。了解其相互关系和精子经 过路线，注意观察比较各种公畜输精管壶腹之异同。
3.副性腺的观察。比较各种公畜精囊腺、前列腺、
尿道球腺的大小、形状、位置。
的形态特点。
四、实训报告
1.按下列表所列项目，将 各种公畜生殖器官的观察结果 填于表内。(见实训指导） 2.标出图-1中数字所示睾 丸的各部分名称并简要说明各 自的生理功能。
3．按图-2中数字所示，标出公牛副性腺的各部分名 称，画出精子排出体外的路径。
4．描述精液形成的过程。
实训二、公畜生殖器官的观察
实训二、公畜生殖器官的观察
一、目的和要求 1.认识公畜生殖器官的解剖位置和形态结构。
2.知道精子形成、成熟部位。
3.能描述出精子生成、精液形成、排出的路径 。
二、材料与器械
1.各种公畜生殖器官的实体标本、挂图。 2.公畜生殖器官活体和离体照片。 3.睾丸、输精管的组织切片。 4.大方盘、解剖刀、剪刀、镊子、探针等。 5.生物显微镜。
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点;掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。
二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿,记号笔。
操作液（M2），成熟培养液（M－199）,激素(PMSG和HCG)，石蜡油.2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。
三、实验内容1。
小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠.注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1—1)，以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时,再注入药物。
随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位.皮下注射时防止药液从针孔处逸出。
腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。
注射针头宜选用小号细针头。
注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。
2.卵巢的采集方法在注射PMSG 后46h 利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上,鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部,或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。
用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。
将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。
然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上.图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠,在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部(图1—2）。
剪开腹膜,向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1—3）。
家畜繁殖学实验1和2
卵泡发育模式图
四
作业
• 画出曲细精管的横断面，说出间质细胞的 作用。 • 画出生长卵泡的形态，标注各部分名称。 （要求写放大倍数）
A．母牛的生殖器官 B．母马的生殖 器官 C．母猪的生殖器官 D．母羊 的生殖器官 1．卵巢 2．输卵管 3．子宫角 4．子宫颈 5．直肠 6．阴道 7．膀 胱
雌性动物的生殖器官
雌性动物生殖系统
子宫
各种家畜的子宫都分为子宫角、子宫体和子宫颈三部分。牛、 羊的为对分子宫；马、猪为双角子宫；人为单子宫；啮齿类 为双子宫。子宫角有大小两个弯，大弯游离，小弯供子宫阔 韧带附着，血管神经由此出入。子宫颈前端以子宫内口和子 宫体相通，后端突人阴道内(猪例外)，称为子宫颈阴道部， 其开口为子宫外口。
兔
牛
马
牛
猪的子宫
生殖激素
子宫的类型
①单子宫：无明显的子宫角部分， 子宫体直接与输卵管相连。如 人，灵长类（无子宫角） 。
②双子宫：子宫体有两个，每个 子宫体有一个子宫角，有两个子 宫颈外口开口于阴道。如兔子、 小鼠、狸獭的子宫
①
②
子宫的类型
③对分子宫：子宫体里面角间够的纵 隔延续很长，将子宫体里面大部分空 间分成了左右两个部分，但只有一个 子宫颈开口于阴道；如牛、羊、梅花 鹿的子宫。 ④双角子宫：子宫体内纵隔不明显。 如猪、马、驴、狗、狐狸、水貂、大 熊猫的子宫。
• （一）阴茎 • 阴茎为雄性的交配器官， 主要由勃起组织及尿生殖 道阴茎部组成。阴茎的后 端称阴茎根，前端称阴茎 头(龟头)。 • （二）包皮 • 包皮是由游离的皮肤凹陷 而发育成的阴茎套。保护 阴茎免受损伤。
各种雄性动物的龟头 1. 公牛的 2．公牛的(示刚交配 后的形状) 3．公马的 4．公猪 的 5. 公绵羊的 6．公山羊的
实验一小鼠睾丸附睾及输精管精子采集运动能力检测与结构观察
实验用品
3. 实验动物： 选择60日龄以上，体重达到32-35g的昆明种 公鼠。
实验方法
1. 精子采集：
左手捏小鼠尾部，右手持镊子，或以图3-1所 示方法，以颈部脱臼法处死小鼠。使处死的小鼠 仰卧，用75%的酒精棉球消毒腹部开口部位被毛 及皮肤。剪开腹壁，暴露生殖系统。无菌分离睾 丸、附睾及输精管。在含培养液的表面皿中，用 眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂 肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨 碍精子观察。
实验方法
采集附睾尾精子时，将其剪成几段。采集输精管 精子时，由于小鼠输精管非常细，不能直接冲洗 管腔，将输精管放入含有1ml培养液的表面皿内， 在实体显微镜下，用一只眼科异物针固定输精管， 用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管，精 子会浮游到培养液中。将大块输精管组织拨开， 用吸管连同精子吸出液体部分，装于乳动物的精子在睾丸内形成，并必须经过 在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的 变化而最终达到成熟，才能获得向前运动的能 力，这种向前运动能力的获得是精子受精能力 的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部两 个主要部分，颈部介于头部和尾部之间，形成 头部和尾部的连接。精子头部主要由核组成，
实验目的
1. 认识雄性小鼠睾丸、附睾、输精管等 生殖器官结构及位置特点；
2.掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采 集方法；
3.掌握血细胞计数板法精子计数和运动 能力检查的方法；
4.通过睾丸、附睾及输精管精子运动能 力检测，认识精子在睾丸产生后，在 附睾内成熟的过程；
实验目的
5. 掌握精子抹片方法； 6. 掌握染色法进行精子结构观察和顶体 结构观察的方法，认识精子的正常结构； 7. 使学生得到小鼠精子操作的基础训练。
实验方法
小鼠的解剖及组织观察实验报告
小鼠的解剖及组织观察实验报告一、实验目的1、熟悉小鼠的外部形态和内部结构。
2、掌握小鼠的解剖方法和操作技巧。
3、观察小鼠主要器官的组织形态和结构特点。
二、实验材料1、实验动物：健康成年小鼠若干只。
2、实验器械：解剖盘、解剖剪、镊子、手术刀、大头针等。
3、实验试剂：75%酒精、生理盐水等。
三、实验步骤（一）小鼠的处死1、采用颈椎脱臼法处死小鼠。
用左手拇指和食指捏住小鼠的头颈部，右手拉住小鼠的尾巴，将小鼠头部用力向后上方牵拉，使小鼠的颈椎脱位，迅速死亡。
（二）小鼠的外部形态观察1、观察小鼠的整体外形，包括体型、毛色、头尾、四肢等。
2、注意小鼠的性别特征，雄鼠的生殖器距离肛门较远，有明显的睾丸；雌鼠生殖器距离肛门较近。
（三）小鼠的解剖1、将处死的小鼠仰卧固定在解剖盘上，用大头针固定四肢。
2、用酒精棉球擦拭小鼠腹部的皮毛，使其湿润。
3、用手术刀在小鼠腹部正中线从胸骨剑突下至耻骨联合处做一个纵切口，然后沿两侧腹股沟向左右横切，小心地剥离腹部皮肤。
4、沿腹白线切开腹壁肌肉，暴露腹腔。
注意不要损伤腹腔内的脏器。
5、观察腹腔内的脏器位置和形态，依次辨认肝、胃、肠、脾、肾等器官。
（四）小鼠器官的观察和组织取样1、肝脏：观察肝脏的颜色、质地和分叶情况。
用镊子轻轻夹取一小块肝脏组织，放入盛有生理盐水的培养皿中，用于后续的组织切片制作。
2、胃：观察胃的形态和位置，区分胃的贲门、幽门和胃体。
3、肠：观察小肠和大肠的区别，注意肠壁的结构和肠系膜的分布。
4、脾：观察脾的形状和颜色，注意其与周围组织的连接。
5、肾：观察肾的位置、形态和颜色，区分皮质和髓质。
（五）小鼠胸腔的解剖1、用剪刀小心地剪断肋骨，打开胸腔，暴露心肺等器官。
2、观察心脏的外形和位置，区分心房和心室。
3、观察肺的形态和颜色，注意其与气管的连接。
（六）小鼠组织切片的制作和观察（如有条件）1、将取好的组织块经过固定、脱水、包埋、切片等步骤制作成组织切片。
2、用苏木精伊红（HE）染色法对切片进行染色。
小鼠输精管结扎和简单精子操作
小鼠输精管结扎和简单精子操作121140052 王哲迪 174一、实验目的1、掌握小鼠手术的基本技巧2、学习雄性小鼠生殖系统特点3、练习显微操作技术二、实验结果及分析1、以腹部横切法剪开小鼠腹壁后，用镊子夹住脂肪垫将睾丸、附睾和输精管拉出切口。
实验时我们将下面图片中镊子夹着的地方剪掉了1cm。
但是在仔细观察过右边这个图后发现，我们错把附睾体当做了输精管。
我们剪掉的是附睾体，而不是输精管。
2、下面这张图片是小鼠腹壁缝合后的照片。
我们采取了方洁的打结方式。
在将睾丸放回腹腔的过程中，发现不管怎么推，都不能把睾丸推回阴囊，这给缝合带来了一定的难度。
缝合腹壁时一定要小心，因为缝合针很容易扎到皮肤和腹腔内的脏器。
3、下图为皮肤缝合后的照片，同样采用的是方结的打结方式。
皮肤相对于腹壁而言较容易缝合。
4、下图为在解剖镜下观察得到的照片。
可能由于角度问题，这张图片上只能分辨出脂肪体和睾丸，并不能看到附睾体和输精管。
取出睾丸时的操作也存在问题，并没有注意到输精管在哪里。
上面剪切输精管时也没有找对输精管，所以实验失败在没有观察到输精管。
脂肪体睾丸4、下图为在显微镜下观察精子得到的照片。
正如细线所指的，图中有着尖尖的头部和一条细长的尾巴的就是精子。
由于载玻片上有一些脂肪体残留的脂肪，所以在显微镜下会看到很多油花，影响精子的观察。
但是仔细看还是可以看到许多在快速无规则运动的精子。
精子三、备注1、本人在实验中操作的部分：对小鼠进行断颈处理切开腹壁夹出睾丸、附睾和脂肪体剪掉1cm输精管（其实剪掉的是附睾）部分缝合操作2、实验要求用乙醚麻醉小鼠，但是实验过程中发现用乙醚麻醉的方法并不好，小鼠经常会醒过来，而且用乙醚操作时间长了，实验人员出现头疼恶心等不适症状。
由于并不需要对小鼠进行回收，所以为了方便操作我们直接采取了断颈处理的方法。
试验六1、小鼠采精方法的研究
实验六、小鼠采精方法中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVEMEDICINE2005年4月第15卷第2期April, 2005 Vol.15 No。
2郑新民,李聚学，魏雁，乔宪凤,周荆荣（湖北省农科院生物技术研究所，武汉430072小鼠是世界上研究最为详尽的哺乳类动物［1］.但是目前人们仍然是通过手术法从小鼠附睾中获取精子，国内外尚无小鼠非手术法采精的报道.手术法采精为众多的科学研究带来了不便：（1)手术法采精必须将雄鼠处死，分离其附睾和输精管来获取精子,过程繁琐，费时费工,且造成不必要的经济浪费［2]。
另外，从附睾中获取的精子由于缺少副性腺中的诸多有益成分，精子品质难以保证[3];（2）不利于小鼠生殖生理的研究,在医学上,人们都是通过“杀鸡取卵”式地宰杀大量的雄鼠来获取精子进行科研分析[4-6],不但造成了很大的经济浪费，而且增加了实验的误差和难度;(3)不利于某些动物模型的建立,例如，由于小鼠精子获取繁琐，人工授精技术不易建立，精子载体转基因技术尚无理想的动物模型,这极不利于该项研究的开展［7］。
由此可见,建立一种方便快速的小鼠非手术法采精技术对解决小鼠手术法采精中存在的问题、小鼠生殖生理的研究和建立某些小鼠动物模型都是很有意义的。
1 材料和方法1。
1 实验动物SPF级昆明小白鼠雄鼠,购自湖北省预防医学科学院。
合格证号为：SYXK(鄂）20035853。
1.2 小鼠假阴道抽吸器的制备小鼠假阴道的制作：取一段长约2 cm,内径8 mm的软质透明塑料管,在其内侧套上一层厚度约0.1 mm的胶膜,胶膜要求透明且有良好的弹性。
在塑料管中部钻一直径为2 mm的小孔,将一外径与小孔相当的硬质插管插入小孔中，深度与塑料管管壁厚度相当,小孔周围用强力胶水密封,向小管中轻轻吹入空气即可将塑料管内侧胶膜充起。
将制好的小鼠假阴道与胶头吸管相连,小鼠假阴道抽吸器即制作完毕。
1.3 电刺激采精仪的制备电刺激采精仪由电刺激发生器和直肠探子两部分组成。
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用姬姆萨工作液染色90min，水洗，风干。置于
1000倍显微镜下用油镜观察，计数顶体异常精子。 镜下可观察到大多数精子顶体结构正常，部分精 子顶体异常，精子顶体异常主要表现为肿胀、缺 损、部分或完全脱落。
实验注意事项
剖开小鼠腹腔时，剪刀头要向上，以避 免剪破腹腔血管和内脏，影响实验结果的 观察。
实验结果及分析
实验用品
3. 实验动物： 选择60日龄以上，体重达到32-35g的昆明种 公鼠。
实验方法
1. 精子采集： 左手捏小鼠尾部，右手持镊子，或以图3-1所 示方法，以颈部脱臼法处死小鼠。使处死的小鼠 仰卧，用75%的酒精棉球消毒腹部开口部位被毛 及皮肤。剪开腹壁，暴露生殖系统。无菌分离睾 丸、附睾及输精管。在含培养液的表面皿中，用 眼科剪除去睾丸、附睾及输精管周围的系膜及脂 肪，并冲洗干净，以免血液或脂肪球混入液体妨 碍精子观察。
实验方法
2. 精子运动能力检查：
用滴管吸取精液，放于血细胞计数板的计数室 与盖玻片接触处，使精液自然流入计数室中。计 数中间5个中方格（对角5个或四角及中间）内80 个小方格的精子数，计数值为X0计算时，先计数 死精子的X1值，然后计数板置于50℃水浴锅中的 搪瓷盘中，在50 ℃条件下5～10min杀死精子，计 数总精子数X2值，（ X2－ X1 ）/ X2为表示精子运 动能力的精子活力值。计数时每份精子用3个计数 板重复计数3次，取平均值。
3. 精子整体结构观察： （颈部膨大、纤细、屈折、不全、双体等）、尾 部中段畸形（膨大、纤细、弯曲、屈折、不全、
双体等）、尾部主段畸形，然后分类计数。有的
精子尾部发育未完成，为未成熟精子，可计为畸 形精子。
实验方法
4. 精子顶体结构观察： 精液抹片自然干燥10～20min，以1 ～2ml的福 尔马林磷酸缓冲液固定15min,水洗后自然干燥。
实验目的
5. 掌握精子抹片方法； 6. 掌握染色法进行精子结构观察和顶体
结构观察的方法，认识精子的正常结构；
7. 使学生得到小鼠精子操作的基础训练。
实验原理
哺乳动物的精子在睾丸内形成，并必须经过 在附睾内发生一系列形态、生理和生化方面的 变化而最终达到成熟，才能获得向前运动的能
力，这种向前运动能力的获得是精子受精能力
实验方法
采集附睾尾精子时，将其剪成几段。采集输精管 精子时，由于小鼠输精管非常细，不能直接冲洗 管腔，将输精管放入含有1ml培养液的表面皿内， 在实体显微镜下，用一只眼科异物针固定输精管， 用另一支异物针向相反方向纵向撕开输精管，精 子会浮游到培养液中。将大块输精管组织拨开， 用吸管连同精子吸出液体部分，装于2ml具塞试管 中暂存。
实验九 小鼠睾丸、附睾及输精管精 子采集、运动能力检测与结构观察
任课教师：吴雨龙
任课班级：07级
实验目的
1. 认识雄性小鼠睾丸、附睾、输精管等 生殖器官结构及位置特点； 2.掌握小鼠睾丸、附睾及输精管精子采 集方法； 3.掌握血细胞计数板法精子计数和运动 能力检查的方法； 4.通过睾丸、附睾及输精管精子运动能 力检测，认识精子在睾丸产生后，在 附睾内成熟的过程；
的重要指标。哺乳动物精子包括头部和尾部两
个主要部分，颈部介于头部和尾部之间，形成
头部和尾部的连接。精子头部主要由核组成，
实验原理
头部顶端是顶体，顶体包围核的前端形成帽状。 精子颈部变细并形成头部和尾部的连接。尾部 是精子的运动器官，可以分为中段、主段和末 端。
实验用品
1. 设备与器材：实体显微镜、恒温培养箱、 恒温水浴锅、注射器、注射针头、吸管、 试管架、血细胞计数板、剪刀、解剖刀、 解剖镊、载玻片、盖玻片等。 2. 药品、试剂： 精子操作液（CZB液或KSOM液）、0.5%龙 胆紫酒精液、36%甲醛溶液、磷酸缓冲液 （PH6.8）、精子固定液（福尔马林磷酸盐 缓冲液）、吉姆萨工作液。
1.雄性小鼠的生殖器官主要由哪几个部分组成？ 2.绘制小鼠精子结构图？ 3.从外观上看小鼠精子由哪几部分组成？你都观 察到了哪几种畸形结构？将典型的畸形结构进 行图示。
顶体缺损
顶体脱落
顶体空泡
பைடு நூலகம்
正常精子顶体结构
实验方法
3. 精子整体结构观察： 取1小滴保存精液在载玻片上，将样品滴以拉 的形式制成抹片。用0.5%龙胆紫酒精液染色3min，
自然干燥，水洗后镜检。镜下可观察到大多数为
结构正常的精子，部分为畸形精子，如头部畸形 （如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不明显、 皱缩、缺损、双头等）、颈部畸形
实验方法
实验方法
将分离并清洗干净的睾丸、附睾及输精管，用眼 科剪再分离为睾丸、附睾尾及附带的小段输精管、 其余部分的输精管3部分，弃去附睾头。采集睾丸 精子时，将睾丸横切为如干段或组织块，放在表 面皿中，加1ml培养液，用眼科剪轻轻挤压睾丸组 织块，把精子挤入培养液中，去掉组织块 。置 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育20min，使 精子自行散开。