植物细胞融合的研究进展_综述_郭学民
【精品】文献综述—植物细胞壁中纤维素合成的研究进展
文献综述—植物细胞壁中纤维素合成的研究进展植物细胞壁中纤维素合成的研究进展摘要纤维素是植物细胞壁的主要成分，是植物细胞壁执行生理功能的基础，也是人类生产和生活中必不可少的一类物质。
本文对纤维素合成、合成中所需要的酶以及纤维素沉积中微纤丝的作用等方面进行了综述和探讨，并对纤维素合成的深入研究进行了展望。
【关键词】：纤维素合成纤维素合酶蔗糖合酶微纤丝Recent progress on ellulose synthesis in cell wall of plantsAbstractcellulose is a major component in cell wall and carries out many importnt physiological functions. In addition,it is necessary material for human life and production. The rcwnt progress in cellulose synthesis,the function of relative enzymes and microfibril in proess of cellulose synthesis were reviewed. The studies in cellulose synthesis were propected【Key words】：cellulose synthesis cellulose synthase sucrose synthase microfibril细胞壁是由纤维素和果胶质交结形成的多糖和蛋白质及其它成分构成的三维网络结构，也是植物细胞区别于动物细胞的重要特征之一。
过去，细胞壁被认为是一惰性结构，只具有机械支持和防御功能。
但随着实验技术和方法的不断创新和应用，人们逐渐认识到细胞壁作为植物细胞的重要组成部分，不仅具有保护和支持的作用，还与植物细胞的物质运输、信号传导等生理功能有关[1]。
细胞融合技术研究进展
细胞融合技术研究进展随着生物科技的发展，细胞融合技术已成为重要的研究手段之一。
细胞融合技术是指将两个或多个不同来源的细胞融合成为一个细胞而形成的一种技术。
这种技术可以改变细胞表达的基因、蛋白质和代谢物质等特征，从而产生新的生物功能。
细胞融合技术目前已广泛应用于生物医学、农业、食品工业等多个领域。
本文将从细胞融合技术的基本原理、研究进展和应用前景三个方面进行阐述。
一、细胞融合技术的基本原理1.1 细胞融合机制细胞融合是指两个或多个细胞膜在一定条件下融合成为一个细胞的现象，融合的机制与人体生殖细胞和免疫细胞有关。
其中，生殖细胞是通过卵子与精子的融合而产生的新生命，免疫细胞则是为了对抗病原体而融合形成多核细胞，起到放大杀伤作用。
1.2 细胞融合技术的操作步骤细胞融合技术通常是通过两种或多种不同来源的细胞融合来产生新的细胞，按照操作方式的不同，可分为自然融合和人工融合两种方式。
自然融合：几乎所有人类细胞都可以形成细胞融合状态，如卵子和精子的结合。
人工融合：通常需要特殊条件，比如高浓度聚乙二醇、电脉冲等。
细胞融合技术常用于以下几个方面：构建免疫融合瘤细胞、制备单克隆抗体、制备基因工程生物等。
2.1 核移植技术核移植技术是指将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞的胞浆中，以此产生新的生物体。
这种技术被称为克隆技术的基础。
2.2 基因重组基因重组是指将两种不同的基因或同一基因的不同部分重新组合形成一个新的基因。
借助细胞融合技术可以使共同表达基因的细胞融合，从而实现新的基因重组。
2.3 细胞融合生物的生成细胞融合技术可以产生许多特殊的细胞，如免疫融合瘤、核仁瘤、杂交瘤等细胞。
这些细胞除了具备父母双亲的某些特征外，还拥有一些新的遗传特征，可以应用于生物医学等领域。
3.1 微生物发酵工程利用细胞融合技术可以构建新的高效发酵菌株，改良微生物代谢途径，增加产物产量、提高发酵效率等，实现绿色、可持续的生产方式。
3.2 细胞治疗细胞融合技术可用于干细胞和分化细胞的融合，产生细胞重构或细胞异核瘤等特殊细胞，促进体内细胞再生，缓解或治疗某些疾病。
植物耐盐相关基因克隆与基因工程的研究进展(综述)
摘要： 盐渍化是影 响植物生长 和发育的主要 环境 因素之 一 。 而基 因工程 为 耐盐新 品种 的选育 通 过了一条新途径 ．很多耐盐基 因已经被 克隆和详细研究 。笔者 就与耐盐 性相关的渗透调 节
物 质合成关键基 因 、 盐胁迫 信号传导 以及与相关 的调控元 件和 因子 的克隆 及其 基因工 程应 用
收稿 日期 ：２ ０— １１ Ｉ修改稿收 到 日期 ： ０ ５１—９ ０ ５０ －２ ２ ０ —２０
维普资讯
ｌ 期
杜金友等
植 物耐盐相关 基因克隆与基 因工程 的研究进 展（ 综述 ）
６ ９
器 官中表达 ， 但在 分 裂细胞 中沉 默 ； 定位 于 ３号染 色体 １１ ３位置 上的 Ａｔ ５ Ｓ 基 因转 录产物 ， ０． ＰＣ ２ 占植 物 组织 中 Ｐ Ｃ ｍＲＮＡ 总量 的 ２ ～４ ， ＳＳ Ｏ， Ｏ， 并在 分裂 细胞 中负责 合成 Ｐ Ｃ ｍＲ ９ ６ ９ ６ Ｓ Ｓ ＮＡ。Ｉａａｈ 等口 也从 水 ｇｒｓｉ
稻（ ｒｚ ｔ ａＬ ） Ｏ ｙ ａ ａｉ ． 品种 Ａ ｉａｃ Ｎ （Ｏ Ｐ Ｃ ） 由 Ｄ Ａ ｃ ｓＳ Ｓ ，
其 推测 的 Ｐ Ｃ Ｓ Ｓ氨 基酸 序列 与 拟南 芥 的 Ｐ Ｃ ５ Ｓ具有 ７ ． ％的 同源性 。Ｎｏｔｅｎ印迹 分 析 表 明 Ｐ Ｃ ４２ ｒｈ ｒ ５ Ｓ基
的研究进展作 了概述 ． 以期为相关人员 的研究 提供参考。 关键词 ： 物耐盐性 ｌ基 因克 隆ｌ基因工程 植
中 圈分 类 号 ： ５ ３ ０ ￥ １． １ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１ ７－９ ３ ２０ ） １０ ６。５ ６ ２７ ８ （０ ６ ０ 。０ ８０
高盐 环境 是影 响植 物 生长 和 发育 的主要 环境 因子 之一 ， 我 国就 有盐 渍 土 壤 约 ３３０万 ｈ 仅 ０ ｍｚ其 中
植物细胞融合应用的原理
植物细胞融合应用的原理1. 背景介绍植物细胞融合是一种重要的生物技术方法，它能够实现不同种植物细胞的融合，产生新的杂种细胞。
这种细胞融合技术在植物育种、基因工程和植物再生等领域得到了广泛的应用。
本文将介绍植物细胞融合应用的原理及其相关技术。
2. 细胞融合的原理细胞融合是将两个或多个细胞融合为一个细胞的过程。
在植物细胞融合中，常用的方法是通过电融合或化学诱导剂来破坏细胞壁，使细胞融合成一个新的细胞。
细胞融合的原理主要包括以下几个方面：•细胞壁破坏：细胞融合需要先破坏细胞壁，以允许细胞间的物质交流和融合。
电融合通过施加高压电场来破坏细胞壁，而化学诱导剂则通过化学作用来达到相同的效果。
•融合液体的作用：细胞融合需要在一定的环境中进行，在这个过程中添加了融合液体，它能够促使细胞融合，并提供必要的物质和能量。
•融合发生的条件：细胞融合需要一定的环境条件才能发生，例如适当的温度、酸碱度和光照条件。
3. 植物细胞融合的应用植物细胞融合技术在农业和科研领域具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：•植物育种：通过细胞融合可以将两个不同品种的植物细胞融合成一个新的细胞，从而产生杂种。
这种杂种继承了父本的优点，具有更好的抗病性、耐逆性和产量等特点，可用于改良植物品种。
•基因工程：植物细胞融合是制备转基因植物的重要手段之一。
通过融合含有目的基因的细胞和植物细胞，可以将目的基因导入到植物中，并使其表达。
这样可以在植物中引入新的功能基因，用于增强植物的营养价值、抗病能力等。
•植物再生：植物细胞融合可以促进植物再生过程。
通过将单个植物细胞融合成一个新的细胞，可以促进植物组织的生长和再生。
这对于繁殖难度较大的植物或者植物组织的无性繁殖有重要意义。
•基因互补：通过植物细胞融合可以实现不同基因型之间的基因互补。
例如，在一些果树繁殖中，通过将两种具有互补优点的果树细胞融合，可以产生一种新的杂种，从而获得更好的果实品质和产量。
4. 结论植物细胞融合是一项重要的生物技术方法，它通过将不同的植物细胞融合成一个新的细胞，实现了植物在性状、抗性等方面的改良。
细胞融合技术及进展
细胞融合技术及进展摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。
本文综述了关于细胞融合的基本理论并重点综述了细胞融合的基本方法及最新进展。
关键字：细胞融合生物技术方法综述前言细胞工程是生物工程主要组成之一，出现于20世纪70年代末至80年代初，是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。
细胞融合技术不仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发生生物学，特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的意义。
细胞融合使细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合，使远缘杂交成为可能，因而是改造细胞遗传物质的有力手段。
它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。
但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性，致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要求的性状出现，直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。
细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂，投资少，有利于广泛开展研究和推广，有着重大的实践意义，正得到科学界的日益重视。
随着细胞融合技术研究的不断深入，细胞融合技术的发展前景及其产生的影响将日益显著。
1关于细胞融合的基本理论及概念所谓细胞融合就是指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization) 。
如取材为体细胞则称体细胞杂交(somatic hybridization)。
植物细胞融合实验
7 mmol/L 0.7mmol/L 3 mmol/L
甘露醇
0.5 mmol/L
用重蒸馏水溶解，调pH5.6，定容为酶
储备液，灭菌备用。
植物细胞融合实验
植物细胞融合实验
PEG诱导原生质体融合的机理： 带有大量负电荷的PEG与水之间的氢
键结合，使溶液中自由水消失，由于高度 脱水引起原生质体凝集，形成大小程度不 同的凝集物。原生质体发生皱缩并大大扭 曲变形，邻近原生质体之间紧密接触。
植物细胞融合实验
在原生质体细胞膜与膜紧密接触的部 位，膜内蛋白质颗粒易位并凝聚。接着可 能是相邻的剥去蛋白质的细胞膜间的类脂 质与类脂质反应。继之，类脂质分子的扰 动和重排导致接触的细胞膜局部发生融合， 形成很小的细胞质桥，之后它逐渐扩大， 两个原生质体最终融合。
主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、 二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂 质、Ca2+配合物等。 （三）电处理融合法
植物细胞融合实验
聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG)融合 在众多的化学试剂中，PEG应用最为
广泛，因PEG液比病毒更易制备和控制、 活性稳定、使用方便、而且促进细胞融合 的能力更强。PEG是一种多聚化合物。
在外力（诱导剂或促融合剂）作用下，两个或两 个以上的异源细胞或原生质体相互接触，从而发生 膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象。
通过细胞培养技术，这个细胞有可能发育成完 整的生物个体，这个杂种后代有可能兼有两个上代 的一些优良性状。
植物细胞融合实验
细胞在融合过程中发生的主要变化：
呈致密状态的体细胞在促融合剂的作用 下，细胞膜的性质发生变化。 首先出现 细胞凝集现象；然后部分凝集细胞之间的 膜发生粘连；继而融合形成多核细胞；在 培养过程中多核细胞又进行核的融合而成 为单核的杂种细胞，而那些不能形成单核 的融合细胞在培养过程中逐渐死亡。
细胞融合论文
细胞融合技术班级：生工（2）学号：姓名：摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。
文章综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒、诱导法、聚乙二醇/ 化学诱导法、电融合诱导法、激光诱导法及此技术的最新研究进展：基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片等，并对它们的优缺点进行讨论。
并综述了有利于细胞融合技术完善的基础理论研究：细胞同步性和单方的染色体丢失现象。
同时提出了未来研究方向的设想。
关键词：细胞融合；应用研究；常用方法；基础理论研究；设想正文：细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术。
细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉骨骼胎盘的发育。
[2肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供了有力的手段。
[3]被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单克隆抗体。
[4] 动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。
一.细胞融合的常用方法1生物法自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新台阶。
解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。
2 化学法盐类融合法。
此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。
盐类融合剂对原生质体的破坏小。
今后研究应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。
高钙和高pH值融合法。
Keller 首先发现高Ca2 + 和高pH值可以诱发融合。
园艺植物原生质体融合技术研究进展
1 引言原生质体融合（protoplast fusion）亦称细胞融合（cell fusion）、体细胞杂交（somatic hybridization）、超性杂交（Para sexual hybridization）或超性融合（Para sexual fusion ），是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程[1]。
植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，以及植株的再生和鉴定等环节。
原生质体融合涉及了双亲的细胞质，它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可使叶绿体基因组或线粒体基因组间重新组合。
原生质体融合还可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远亲杂交中的有性不亲和界限。
原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。
原生质体融合技术起源于20世纪60年代，是基因重组技术的一部分。
经过一定的理化条件处理,使外源目的基因进入受体细胞，并得以表达，以期使得受体细胞在原有性状的基础上，获得所需的新的特殊性状[2]。
1953年we bull首先用肤聚糖水解酶，溶菌酶得到巨大芽胞杆菌的原生质体，1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后，Nagata等首次利用烟草叶分离原生质体，经培养获得再生植株，1972年Carlson等以烟草获得了体细胞杂种[4] ，1974年高国楠发现聚乙二醇（PEG）在钙离子存在的条件下能促使植物细胞原生质体融合，1975年Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株，1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株并从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。
随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。
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河北科技师范学院学报 第19卷第1期,2005年3月Jo ur nal o f Hebei N or mal U niver sity of Science&T echnolog y Co llege V o l.19 No1.1M arch2005植物细胞融合的研究进展(综述)郭学民1,2,徐兴友1,2,王同坤1,王华芳2,尹伟伦2(1河北科技师范学院生命科学系,河北秦皇岛,066600;2北京林业大学生物科学与技术学院)摘要:概述了原生质体分离和培养的影响因素,介绍了近年来国内外原生质体培养与融合及杂种细胞、筛选和鉴定的动态。
关键词:细胞融合;原生质体;筛选与鉴定中图分类号:Q321+.2 文献标识码:A 文章编号:1672-7983(2005)01-0065-05细胞融合(cy to mixis),亦称细胞杂交(cell fusio n),是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程[1]。
植物细胞融合可分为体细胞杂交(somatic hybridizatio n)和配子-体细胞杂交(gameto-somatic hy br idizatio n),前者是指不经过有性过程,而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[2],后者是指性细胞(如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等)原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞,形成愈伤组织,并再生出植株的过程[3]。
植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支,是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径,原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。
自1960年Cocking[4]用酶法分离出番茄根原生质体后,Natag a和T akebe[5]1970年首次利用烟草叶分离原生质体,经培养获得再生植株;1975年以色列的Vardi等[6]首次从木本植物Sham onti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织,并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株;在禾本科植物中,除在珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料,较早获得原生质体再生植株外,直到1985年Fujim ur a[7]等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株,才出现了重大突破。
现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。
随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进,植物细胞融合获得了巨大成功。
植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养,以及植株的再生和鉴定等环节。
1 原生质体的分离和培养1.1 起始材料起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。
在以往的双子叶植物培养中,大多以叶片为分离原生质体的材料,近年来,起始材料的适用范围有了较大扩展。
目前,以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式;禾本科植物原生质体培养获得成功的试验,几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。
采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。
1.2 基因型同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同,所以在相同条件下,不同品种的再生能力不同。
王光远和夏镇澳[8]在水稻原生质体培养中曾用26个品种进行组织培养,其中仅有3个品种(粳稻农虎6号、国香1号和上农香糯)能成功地用于原生质体培养,获得再生植株。
据统计,小麦获得原生质体再生植株的基因型只有大约10个[9]。
基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用,它不仅影响原生质体的产量和活力,而且还影响植株的再生。
Cheng和Veillenux证明芙薯(Solanum phureja)从原生质体培养到愈伤组织形成受2个独立位点的显性基因的调控[10]。
因此,现有收稿日期:2004-03-09;修改稿收到日期:2004-12-1266河北科技师范学院学报 19卷条件下,并不是所有植物种都能获得原生质体再生植株。
为了提高原生质体培养的成功率,要采用多品种和适当品种作为原生质体培养的起始材料。
1.3 培养基培养基对原生质体培养影响很大。
为了使原生质体能持续生长、分化,最重要的条件之一是选择合适的培养基。
在木本植物原生质体培养中,常用的培养基有M S,M T,WPM,KM8p等。
Crosser等用MT 改进后建立的BH3培养基已成为柑橘原生质体培养中较为通用的培养基[11];利用KM8p经多次改进得到的培养基V-KM已成功地培养了200多种原生质体,是目前适用范围较广的原生质体培养基[12]。
在禾本科植物原生质体培养成功的例证中,常用的培养基是以M S,LS,Du,N6,KM等为基础改进而来的。
无机盐是培养基的主要成分,其浓度要比细胞培养时低。
其中氮源研究较多,马锋旺和罗建平等在原生质体培养中发现高浓度NH+4抑制原生质体分裂[13,14]。
培养基中的碳源和渗透剂在原生质体培养中起重要作用。
渗透压过高,原生质体会发生皱缩直至失去活力;渗透压过低,原生质体吸水膨胀而破碎,故在酶解和初培养时,由于原生质体无细胞壁,培养基保持较高的渗透势状态是必要的。
随着原生体培养时间的延长,可逐步降低渗透势以提高细胞的耐受力[15]。
常用的碳源、渗透剂以葡萄糖较好,可获得较高的植板率,且对细胞毒害也小[16],但有些植物用葡萄糖+山梨醇、蔗糖+葡萄糖、麦芽糖、甘露糖等效果较好[17～19]。
原生质体培养中的激素以生长素和细胞分裂素为主。
不同植物的原生质体培养,对激素的浓度要求差异很大,需要生长素和细胞分裂素的适当搭配[20,21]。
但也有学者证明添加NAA可提高原生质体的分裂率[16]。
在禾本科植物原生质体培养中,培养基中2,4-D的作用十分重要。
1.4 培养方法原生质体的培养方法分为液体培养、琼脂糖包埋和看护培养几种方式。
有些植物适于采用液体浅层培养[22～24],另外,固液双层培养法也被应用于原生质体再生[25]。
1.5 培养密度原生质体的接种密度对培养效果影响很大。
密度过小,原生质体内含物外渗而引起褐变或进行一次分裂后即死亡;密度过高,造成营养不良,再生细胞团很小,而且很快停止生长。
在一定范围内,原生质体具有较强的恢复分裂能力,一般密度以104～105mL-1为宜[26]。
1.6 酶制剂在木本植物中,原生质体的分离常用的酶为纤维素酶(Cellulase Onzuka R-10)、果胶酶(Pectinase)、离析酶(M acerozy me r-10)和半纤维素酶(Hemicellulase)。
但不同植物所用酶的种类有较大的差别。
在苹果和山桃的原生质体分离中只需纤维素酶和果胶酶即可[27],枣树则用纤维素酶和离析酶[20]。
禾本科植物原生质体的分离普遍使用了Y-23果胶酶来消除细胞壁,保证了原生质体的质量。
1.7 材料的预处理许多研究者报道,酶解之前对材料进行预处理有利于原生质体的分离。
在正常培养基中生长的草莓试管苗幼叶,直接酶解仅能产生少量原生质体,如果在分离前将试管苗转入降低了蔗糖浓度的培养基中预处理2～3周,或暗处理1周,原生质体的产量将大为提高[28,29]。
在悬铃木叶片酶解前,将其放在CPW-12M(含质量分数为0.12的甘露醇)中1.5～2h,使细胞质壁分离,缩短了酶解时间[16]。
在实验中,材料是否需要预处理要根据不同的情况而定。
2 原生质体融合2.1 应用原生质体融合技术产生杂种植株自Car lson等[30]在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来,原生质体融合技术在植物中已广泛应用。
据不完全统计,到2003年初,已获得木本植物近100个组合的体细胞杂种植株[26];T erada R.等[31]最早在1987年,将稗草与水稻的原生质体融合,获得了杂种水稻植株,至1999年底,已获得17例水稻体细胞杂交组合的杂种植株[32];现已有10多种植物性细胞的20多个不同组合的配子-体细胞杂交实验,有的已获得再生植株。
2.2 原生质体融合方法原生质体的融合方法经历了一个逐步改进和完善的过程。
在早期原生质体融合的方法有NaNO 3法、高pH /高Ca 2+法、PEG(聚乙二醇)法,后来逐渐发展为PEG 与高Ca 2+、高pH 相结合;20世纪80年代初又开始探索使用电融合法,并发展出一些其他方法。
这些方法各有特点,但目前广泛使用的是PEG 法和电融合法。
1974年高国楠建立了PEG 法,经过不断改进已逐步走向完善,并得到广泛应用[33],其融合频率可达10%～15%,无种属特异性,几乎可诱导任何原生质体间的融合。
在应用PEG 进行融合时,重要的影响因素是PEG 的种类、纯度、浓度、处理时间、原生质体的生理状况和密度。
近年来一些研究建议在PEG 溶液中加入融合促进剂(如伴刀豆球蛋白、二甲基亚砜等),可有效提高原生质体的融合频率。
最近PEG 诱导成对原生质体融合的成功,使得PEG 融合技术更精确化,并有可能免除杂种细胞的筛选[34]。
1979年Senda 建立的电融合法发展迅速,是目前最流行的融合方法[35]。
至今已广泛应用于动植物及微生物细胞的融合。
该方法对细胞没有毒害作用,并且操作简便,融合同步性好,可在显微镜下观察融合的全过程,整个过程中的参数容易控制。
但是电融合法需要昂贵的电融合仪,因此目前仍不如PEG 法适用普遍。
Schw eiger [36]把电融合法与微培养法相结合,建立了单对原生质体融合技术程序,这是近年来融合技术上取得的最突出的成就,它不仅改进了融合方法,而且是两亲本间一对一融合,有可能解决融合细胞的选择问题,是一种有前途的技术体系。
目前正在研究用电脑控制进行自动化操作,以提高操作效率。
配子-体细胞原生质体融合技术主要借鉴了体细胞原生质体的融合方法。
性细胞原生质体对融合处理很敏感,容易与其它原生质体融合[37]。
但是因为它的形态、密度等多不同于体细胞原生质体,其融合技术与体细胞杂交有所差异。
影响因素主要有融合处理方式、原生质体密度与比率、融合诱导剂的浓度等。
性细胞原生质体往往形体小而密度大,为了提高融合效率,通常在提高性细胞原生质体密度的同时,相对降低后者的密度,以寻求最佳比例[38,39]。
2.3 原生质体融合的方式原生质体的融合方式有两种:对称融合和非对称融合。
通过这两种融合方式可产生3种类型的杂种:对称杂种、非对称杂种和胞质杂种。
3 杂种细胞的筛选和鉴定3.1 杂种细胞的筛选在原生质体融合后的群体中,有融合体、未融合体、多元融合体和嵌合体,杂种细胞的筛选就是从中区分出预期的融合重组类型。
目前主要的筛选方法有3种: 突变细胞互补选择法。