细菌性食物中毒的快速检验
细菌性食物中毒检测
的病原体的统一性。
常见细菌性食物中毒 实验室诊断
沙门氏菌食物中毒 实验室诊断
从可疑食品、病人呕吐物或腹泻便中检出血清学型
别相同的沙门氏菌。如无可疑食品，从几个病人呕吐 物或腹泻便中检出血清学型别相同的沙门氏菌也可。
有必要时可观察分离出的沙门氏菌与病人血清的凝 集效价，恢复期应比初期有所升高(一般约升高4倍)。
食物中毒物资准备
培养基准备
C-B保存液：保存病原菌
亚硒酸盐增菌液：培养沙门菌 普通肉汤：培养金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌 1%葡萄糖肉汤：培养链球菌 7.5%NaCl肉汤：培养金黄色葡萄球菌 嗜盐增菌液：培养副溶血性弧菌
食物中毒物资准备
培养基准备
碱性蛋白胨水：培养霍乱弧菌 肠道增菌液：培养致泻大肠埃希菌
食物中毒物资准备
采样用物品
4.患者呕吐物采集：无菌平皿和特殊采样棉球各20 个以上。 5.血样采集：一次性注射器、灭菌试管各10支以上。 6 .保藏样品的冷藏设备。 7.防污染的工作服或隔离衣、帽、口罩、手套、靴 子等。 ８.其他必备物品：75％医用酒精、酒精灯、酒精 棉球、洗耳球 、打火机、记号笔 等．
志贺菌食物中毒 实验室诊断
从可疑食品、病人吐泻便中检出志贺菌。
观察分离出的志贺氏菌与病人血清的凝集 效价，恢复期应比初期有明显升高(一般约升高 4倍)。
食物中毒检验
食物中毒检验工作是食物中毒调查的重要组成部分， 检验技术水平与食物中毒致病物质查明率密切相关， 检验结果对提供疾病临床确诊依据、中毒食品和病原 因子污染来源等方面具有重要意义。实验室检验工作 技术性较强，检验结果的正确性不仅取决于实验室的 条件和技术水平，同时还与检验样品的采集、保存、 送样方法等方面有关。因此在分析检验结果时，除了 应考虑结果是否符合有关实验室判定标准外，还应综 合考虑各种困难影响检验结果的因素。有时阳性检验 结果不一定都能说明病原因子在食物中毒中的致病作 用。阴性结果也不一定能完全否定某种病原因子。
食物中毒的判别及检验
传统手工鉴定
• 3.血清学鉴定 • 3.1多价菌体抗原（O）与多价鞭毛抗原（H）鉴定 • 在玻片上划出2 个约1 cm×2 cm 的区域，挑取1 环待测菌，各
放1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1 滴 多价菌体（O）抗血清或多价鞭毛（H）抗血清，在另一区域下 部加入1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将 两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并 对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
关于收集到的病患的检验
一：粪便 粪便常规：病患粪便标本：在接收到的病患粪便标本之后，进行粪 便常规检查，并且对其增菌培养后进行病原学检查
冷藏食品
食品：定性培养 操作者：粪便培养 动物：粪便，生病动物的 尸检材料培养
上吐下泻，泻出物呈“米 泔水样”并含大量弧菌
感染者污染的食物或 食品： 血清分型 从污染的环境获得 病例： 血清分型
骤起腹痛、腹泻、水样便， 调味酱、米粉、布丁、 食品：定性培养
恶心，呕吐较少，少数患 香肠、肉块 者有发热。
• 细菌性食物中毒：WBC增加，中性粒细胞增加； • 病毒性食物中毒：淋巴细胞和单核细胞增高
• 根据流病资料、病例的三间分布，与患者临床表现、病患 血常规检查结果：
• 1.病患有共同进餐史； • 2.病例潜伏期最短为5小时，最长为47小时。中位数为13
小时，具有明显的时间聚集性； • 3.案例皆来自于学校，具有地点聚集性； • 4.呕吐或24h内腹泻3次及以上，恶心、腹痛、（典型的胃
• 将已挑菌落的平板储存于2 ℃～5 ℃或室温至少保留24 h，以备 必要时复查。
传统手工鉴定
• 2.3 初步生化结果判定
• 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌 属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3 项 中有1项异常，按表4 可判定为沙门氏菌。 如有2 项异常为非沙门氏菌。
细菌性食物中毒的实验室支持
采样前的准备(3)
●现场快速检验、测量设备：食物中毒快速检样箱，食品 温度测试计、消毒剂浓度检测试纸等。 ●调查用表：食物中毒事故个案调查登记表、调查笔录、 样品采集记录表、样品送检单、调查结果汇总表、空白 纸等 ●参考资料：食物中毒诊断标准、有关卫生部规章、参考 书籍等。 ●其它有关物品：如便携式电脑、手机或对讲机等通讯设 施以及用于保存运送培养基的冰箱、冰块等 ● 取证工具：照相机、摄像机等
概况
• • • • • • • 1880年发现，至今已有2600种 有动力（除鸡-雏沙门菌） 大多产H2S （除副甲伤寒沙门菌等） 产酸大多产气（除伤寒、鸡-雏沙门菌） 靛基质-、蔗糖-、乳糖甘露醇+ 符合肠杆菌科特征（葡萄糖+、硝酸盐还原+、 氧化酶-）
血液、骨髓
粪便、肛拭子
食品25g
分离血清
采样前的准备(1)
• 人员的准备：一般要指派2名以上专业人员赶
赴现场，必要时还需要检验人员和其他部门有 关人员协作前往。 • 交通工具准备： 在接到疑似食物中毒报告后 ，在城区1小时、郊区2小时内到达现场。
采样前的准备(2)
●调查采样箱准备：属常用的物品，应提前准备
，定期检查，及时补充。常备以下物品： 1、采样工具：注射器、肛拭子、消毒棉签、消 毒纱布、调匙、勺子、夹子、镊子、剪刀、酒 精灯、标号用品、 75%酒精、其他消毒灭菌器 具、吸管、火柴等。 2、样品容器：灭菌塑料袋、广口瓶、灭菌试管 、灭菌粪便盒、样品冷藏设施等。
阳性反应弧菌科
阴性反应肠杆菌科
接触酶试验
用于分辨葡萄球菌及链球菌 革兰阳性球菌
阳性反应葡萄球菌
阴性反应链球菌
沙门氏菌检测
沙门氏菌食物中毒主要特征
第1章细菌性食物中毒
第一章细菌性食物中毒第一节概述一、食源性疾病WHO指出：凡是通过摄入食物而使病原体进入人体，以致人体患感染性或中毒性疾病，统称为食源性疾病。
食源性疾病包括食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、肠源性病毒感染以及经肠道感染的寄生虫病等。
二、食物中毒摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或把有毒有害物质当作食品摄入后所出现的非传染性(不同于传染病)急性、亚急性疾病。
(一)食物中毒的发病特点(1)发病潜伏期短，来势急剧，呈爆发性。
(2)发病与食物有关。
(3)中毒病人以恶心、呕吐、腹痛、腹泻等胃肠道症状为主。
(4)人与人之间无直接传染。
(二)食物中毒的分类（1）细菌性中毒食品指含有细菌或细菌毒素的食品。
（2）真菌性中毒食品指被真菌及其毒素污染的食品。
（3）动物性中毒食品将天然含有有毒成分的动物或动物的某一部分当作食品。
在一定条件下，产生了大量的有毒成分的可食的动物性食品。
(4）植物性中毒食品将天然含有有毒成分的植物或其加工制品当作食品（如大麻油等）。
在加工过程中未能破坏或除去有毒成分的植物当做食品（如木薯、苦杏仁等）。
在一定条件下，产生了大量的有毒成分的可食的植物性食品（如发芽马铃薯等）。
（5）化学性中毒食品被有毒有害的化学物质污染的食品。
指误为食品、食品添加剂、营养强化剂的有毒有害的化学物质。
添加非食品级的或伪造的或禁止使用的食品添加剂、营养强化剂的食品，以及超量使用食品添加剂的食品。
营养素发生化学变化的食品（如油脂酸败）。
2008年，卫生部收到的食物中毒事件中，细菌性食物中毒人数最多，占总中毒人数的45.8％我国细菌性食物中毒常见的致病菌和食物：沙门氏菌（禽、畜肉）、副溶血性弧菌（水产品）、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌（剩饭）、肉毒梭菌（发酵制品、肉制品）、单核细胞增生李斯特菌（水产品、乳制品、冷藏食品）、大肠杆菌O157:H7（肉制品）等。
三、细菌性食物中毒的特点1、病程短、恢复快、预后好、病死率低但李斯特菌、肉毒梭状芽孢杆菌等食物中毒病程长、病情重、恢复慢。
食物中毒调查处理程序介绍
食物中毒调查处理程序介绍食物中毒调查处理程序第一条为做好食物中毒调查处理工作,根据《中华人民共与国食品卫生法》、《食物中毒事故处理办法》、《食品卫生监督程序》等法律、法规及规范性文件制定本程序。
第二条食物中毒的管辖（一）由直接提供可疑中毒食品的食品生产经营者所在地的卫生监督机构负责管辖，不能确定食品生产经营者的食物中毒由进食地点所在地的卫生监督机构负责管辖。
（二）接到报告的卫生监督机构应立即向有管辖权的卫生监督机构通报情况,并开展初步调查,将调查资料的原件及时移交有管辖权的卫生监督机构，有管辖权的卫生监督机构需要跨区域调查时,应将情况及时通报市卫生监督机构及有关卫生监督机构，并做好有关资料的转接工作，有关卫生监督机构务必积极协助调查处理。
（三）食物中毒调查处理管辖有争议时,由市卫生行政部门指定管辖。
（四）市卫生监督机构负责或者参加下列食物中毒的调查处理（详见《食物中毒、生活饮用水污染事故应急处理总则》（三）现场调查处理：3、发生下列食物中毒、生活饮用水污染事故时，市卫生监督机构应到达现场指导、参与现场调查处理的规定。
（五）有管辖权的卫生监督机构负责食物中毒的全面调查,并写出调查报告。
（六）有管辖权的卫生监督机构负责对造成食物中毒的单位（或者个人）进行行政处罚。
第三条接报与上报按《食物中毒、生活饮用水污染事故应急处理总则》规定的标准、时限、程序执行。
第四条食物中毒调查处理的前期准备（一）各级卫生监督机构应成立专（兼）职食物中毒事故处理队伍，接到事故报告后，迅速赶往现场，进行调查处理，每次事故应由一名领导或者监督员全面负责。
事故处理队伍的成员与人数，视本单位实际情况而定，以能同时到达发病现场与可疑事故现场开展工作为标准。
（二）调查处理必备物品1、食品：包含固体、液体无菌容器（灭菌塑料袋、广口瓶等）、刀、剪、勺、镊子、吸管等。
2、涂抹：灭菌生理盐水试管(5ml) 20个以上,有条件的单位应配备选择性培养基，消毒棉拭子若干包。
细菌性食物中毒检验结果分析
细菌性食物中毒检验结果分析摘要目的对本疾控中心细菌性食物中毒检验结果进行分析，了解其发生的特点，为更好地制定预防及控制食物中毒措施提供科学依据。
方法选取62例细菌性食物中毒人群，进行细菌性食物中毒的微生物学检验，观察其细菌性食物中毒症状、细菌性食物中毒潜伏期、可疑来源以及食品情况、病原学鉴定结果。
结果62例细菌性食物中毒人群，其中呕吐27例，占43.5%，腹泻62例，占100.0%，发热18例，占29.0%，腹痛36例，占58.1%。
潜伏期最短1 h，最长15 h，平均潜伏期（7.41±2.13）h。
进行病原学鉴定发现，最多的病原菌类型为金黄色葡萄球菌27例，占43.5%。
结论依据样品的合理采集以及检验方法，对病原学进行正确鉴定，可显著提升诊断细菌性食物中毒的病原学几率。
关键词细菌性食物中毒；病原学鉴定；样品采集；检验在我国，每年都会发生多起细菌性食物中毒事件，食品安全的形势比较严峻，也是影响社会稳定的因素[1-3]。
本次研究62例细菌性食物中毒人群作为研究對象，分析细菌性食物中毒的微生物学检验，现报告如下。
1 资料与方法1. 1 一般资料选取本中心2015年5月～2017年5月的62例细菌性食物中毒人群作为研究对象，其中饭店中毒4例，小学食堂中毒3例，中学食堂中毒55例。
男37例，女25例。
年龄22～49岁。
对其呕吐物、粪便及肛拭子等样品进行采集并检验。
①食物中毒事故个案调查登记表；②食物中毒调查报告；③食物中毒现场采抽样品。
1. 2 仪器与试剂所用仪器设备及耗材包括棉拭子、无菌生理盐水试管、温箱、冰箱、恒温水浴箱。
所用试剂均由本疾控中心提供，包括营养琼脂培养基、XLD琼脂、MAC琼脂、B-P琼脂、肉汤培养基、碱性蛋白胨水、伊红美蓝培养基、显色培养基。
其中，分离培养基与增菌均产自于青岛高科园海博生物技术有限公司。
诊断血清产自于天津生物制品研究所，而生化微量管、细菌生化鉴定条产自于北京陆桥技术有限公司，均在有效期内进行使用。
食物中毒及其快速检验
病因子 ❖ 临床特征为急性中毒性或感染性表现
食源性疾病
食源性疾病的特点：
❖ 食源性疾病的发病形式有暴发和散发两种。 ❖ 食源性疾病中的肠道传染病存在人与人之间
的传播。 ❖ 食源性疾病的种类多，潜伏期各有不同。 ❖ 食源性疾病不一定出现明显的消化道症状。
2、对中毒食品控制处理（封存、追回、无害化处理或销 毁） 。
3、对中毒场所采取消毒处理
细菌性食源疾病的处理
❖ 接报 ❖ 卫生学及流行病学现场调查 ❖ 采样 ❖ 检验 ❖ 检验结果判定及报告 ❖ 调查报告
处理基本程序—接报
❖ 首接单位可能是区县疾控中心或区县卫生监 督所
❖ 卫生监督所负责调查处理，疾控检验机构配 合检验
食源性疾病
食源性疾病主要包括：
❖ 食物中毒
❖ 经食物而感染的肠道传染病 ❖ 食源性寄生虫病 ❖ 食物中有毒、有害污染物所引起的中毒
性疾病。
食物中毒（food poisoning）
定义：
摄入了含有生物性、化学性有毒有害物
质的食品或把有毒有害物质当作食品摄入后所
出现的非传染性（不属于传染病）的急性、 亚急性疾病。
食源性疾病（food borne disease）
❖ WHO的定义 “食源性疾病是指通过摄食进入人体内的各种致病因 子引起的、通常具有感染性质或中毒性质的一类疾 病”。
❖ 美国CDC的定义 “食源性疾病是由于食用了受污染的食品或饮料而引 起的疾病”。
❖ 联合国粮农组织强调 “食源性疾病是一组重要的传染病和中毒性疾病”。
对检验结果下结论时，应以事实为依据，客观地作 出结论，不能绝对化。
如结果为阴性，应报告为“按XX方法试验，未检 出xx”，而不能报告为 “无”、“0”等字样。
食品中沙门氏菌的快速检验方法
86·FOOD INDUSTRY分析 检测 陈文财 惠州市食品药品检验所食品中沙门氏菌的快速检验方法泛用于遗传病诊断和微生物检验中。
（我个人认为沙门不会用）荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检验法基于沙门氏菌ｆｉｍＹ基因序列，进行引物和探针的设计，利用基因重组技术对检测的定量标准品进行构建，可借助荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ法对沙门氏菌进行检测。
该方法操作简单、检验快速、适用范围广，在临床诊断、商品检验、食品卫生监管等领域均有运用。
多重ＰＣＲ快速检验法多重ＰＣＲ快速检验法基于质粒毒力基因ｓｐｖＣ、１６Ｓ ｒＲＮＡ、ｆｉｍＡ、致病基因ｉｎｖＢ序列设计引物，多重ＰＣＲ检测沙门氏菌株基因组ＤＮＡ，以此实现对沙门氏菌的快速检验。
多重ＰＣＲ快速检验法可对沙门氏菌的多种毒力因子进行鉴定，是沙门氏菌株检验和鉴定的新方法。
变性高效液相色谱检测法 变性高效液相色谱结合多重ＰＣＲ反应技术可对食品中的沙门氏菌进行快速检测。
该方法以ｆｉｍＹ基因为靶基因，选择引物可实现对多重ＰＣＲ体系的优化，由此可对沙门氏菌进行快速鉴别。
该方法的特异性、灵敏性较高，其扩增产物为２８４ｂｐ，可对沙门氏菌进行快速检验，并能进一步验证多重ＰＣＲ的特异性。
沙门氏菌是食物常见的病原菌，具有传播媒介多、途径繁复等特点，容易污染食品而危害人体健康。
另外，沙门氏菌是多种有紧密联系细菌的泛指，包括导致伤寒、胃肠及引起食物中毒的众多细菌。
文中提到的几种快速检验法与传统检验法相比，具有操作简单、特异性强、灵敏度高等特点。
但这些方法也存在各自缺陷，试纸快速检验法检验纯菌时，若目菌＞１０３ｃｆｕ／ｍｌ时，纸片菌斑密集，可导致假阴性反应的发生。
ＰＣＲ检验的特异型取决于所选扩增的靶序列，若为保守的特异片段，所选引物就会显示出特异型。
ＬＡＭＰ技术的产物复杂多样，引物设计要求较高，目标单链ＤＮＡ的分离困难，无法对扩增产物的序列进行分析；其在同一温度条件下采用多条引物扩增非特异性条带，可能会出现假阳性结果。
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体系组成
– 一段长的双链DNA，是待扩增的目的片段 ，作为扩增反应的原始模板(template)
– 两段单链寡核苷酸，其序列与待扩增片段 的两端相同，作为反应的引物(primer)
– 有四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）作为合 成DNA的原料
– 有DNA聚合酶(polymerase)，催化DNA 的合成
进行的酶联荧光免疫分析。像吸液管的装置是固相
容器（SPR），在分析中既作为固相也作为吸液器
。SPR包被有高特异的单克隆抗体混合物。将一定
量的增菌肉汤加入试剂条，肉汤中的混合物在特定
时间内循环于SPR内外。如果有E.coli O157:H7抗原
存在则与包被在SPR内的单克隆抗体结合，其他没
有结合上的化合物被冲洗掉。结合有碱性磷酸酶的
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食物中毒诊断标准主要以流行病学调 查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现 为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病 因而进行的。
食物中毒诊断标准及技术处理总则 GB14938-1994
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中毒特征
名称 沙门氏菌
副溶血弧菌
变形杆菌
致泻性大肠 蜡样芽孢杆 菌 葡萄球菌 粪链球菌 1肉2/毒26梭/20菌19
– 有合适的盐、缓冲液以及温度循环参数， 以提供酶促反应的最佳条件并保证反应的 产量。
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• 在PCR体系中，相对于模板DNA，引 物大量过剩，模板变性后退火时，它 们以3’末端相对分别结合于模板DNA 的两条互补链上，在DNA聚合酶催化 下，合成新的、引物对之间的DNA片 段。在第一个循环中，以两条互补的 DNA为模板，从引物3'端开始延伸， 其5'端是固定的，3’端则没有固定的止 点，随延伸时间的增加而增长，因此 该循环的产物长度是不定的；
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注意事项
减少非特异性扩增及交叉污染
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二、PCR技术的特点
• 高特异性：PCR反应的特异性决 定因素为：①以碱基配对原则使 引物与模板DNA特异正确的结合 ；②DNA聚合酶合成反应的忠实 性；③靶基因的特异性与保守性
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• 高灵敏度：PCR产物量是以指数方式 增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起 始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平 。能从100万个细胞中检出一个靶细胞 ；在细菌的检测中，最小检出率为3个 细菌；在病毒的检测中，PCR的灵敏 度可达3个PFU(空斑形成单位)。
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PCR反应五要素的优化
• 1、多聚核苷酸引物 • 2、Taq DNA聚合酶 • 3、dNTP（三磷酸脱氧核苷酸） • 4、模板核酸 • 5、缓冲液
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其它因素对PCR的影响
1、PCR反应的总体积 2、PCR反应的促进剂
通过加入某些物质稳定酶活性或 有利于DNA的变性与复性，以提高扩 增效率和反应的特异性 。
吞咽困难 复视 失音 食品 呕吐物
2-20d 呼吸困难
血液
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细菌性食物中毒检验
采集样品 检验程序
直接涂片、染色、镜检→活菌数测定→选择 适当的增菌和鉴别培养基进行分离培养→ 生化鉴定→血清学鉴定→毒素测定。
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酶联荧光免疫分析法
• 此E.coli O157:H7的抗原鉴别是基于在VIDAS仪器内
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• 稳定酶活性的有牛血清白蛋白、0.01% 明胶、0.05~0.1% Tween-20及 5mmol/L 二巯基苏糖醇（DTT），但应 注意使用浓度不应过高，只有牛血清白 蛋白的浓度可高达800µg/ml，而对酶活 性仍无抑制。
• 5~10%的二甲基亚砜有利于DNA变性， 5~10%的甘油有利于DNA复性。
常见食物
潜伏期
病程 主要症状
重点采集标本
肉蛋类 水产品
4-48h 3-24h
3-7d
恶心 呕吐 腹痛 腹泻 发热38-40℃
便 食品 血
呕吐 发热 腹痛以上 1-3d 腹部为主 水样便腹 便 食品
泻
肉蛋及水产 品
凉拌菜
米饭、肉、 乳
肉、乳、蛋
5-18h
1-3d
4-44h
1-3d
呕吐型0.5-5h 腹泻型8-16h
抗体在SPR内外循环与结合在SPR内壁上的E.coli
O157:H7抗原结合，最后的冲洗步骤将没有结合的
接合剂冲洗掉。底物—4-甲基伞形磷酸酮被SPR壁
上的酶转换成荧光产物—4-甲基伞形酮。荧光强度
由光学扫描器测定。实验结果由计算机自动分析，
产生基于荧光测试的试验值与标准相比较后打印出
每一个被测样2019
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分子生物学检验技术
• 聚合酶链反应 • 聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定DNA
或RNA片段的技术 • 由变性Template denaturation • 退火Primer annealing • 延伸Primer extension
三个基本步骤构成
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细菌性食物中毒的快速检验
平山县疾控中心
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定义
• 食源性疾病 世界卫生组织将食源性疾病定义为“
凡是通过摄食而进入人体的病原体，使人 体患感染性或中毒性疾病，统称为食源性 疾病”
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定义
• 食物中毒 食物中毒是指人摄人了含有生物性、化学性有毒有
害物质后或把有毒有害物质当作食物摄入后所出现的而非 传染性的急性或亚急性疾病，属于食源性疾病的范畴。食 物中毒既不包括因暴饮暴食而引起的急性胃肠炎、食源性 肠道传染病(如伤寒)和寄生虫病(如囊虫病)，也不包括因 一次大量或者长期少量摄入某些有毒有害物质而引起的以 慢性毒性为主要特征(如致畸、致癌、致突变)的疾病。
1d
2-4h
1-2d
恶心 呕吐 腹痛 腹泻 发热38℃左右
食品 便
呕吐腹痛 腹泻水样 便或粘液便 发热 <39℃
便 食品
恶心 呕吐为主 腹痛 腹泻为主
食品 呕吐物
恶心 频繁剧烈呕吐 腹痛 腹泻
食品 呕吐物
肉、乳、蛋、 冷冻食品
5-10h
1-2d
恶心 呕吐 腹痛 腹泻
食品 呕吐物 粪便
罐头、腌制 品
1-7d