水中固定底物技术大肠菌群酶底物法检测系统
水中粪大肠菌群(耐热大肠菌群)两种检测方法的比较研究
水中粪大肠菌群(耐热大肠菌群)两种检测方法的比较研究摘要：本文采用固定底物酶底物法与传统多管发酵法对水中粪大肠菌群进行比对试验，比较两者检测结果的一致性。
结果表明，两种方法在结果一致性方面相关性好，无统计学意义上的显著性差异，与多管发酵法相比，酶底物法具有简便快速、结果准确、特异、实验过程污染的可能性低、无二次污染等优点。
关键词：固定底物酶底物法多管发酵法粪大肠菌群Comparative Study on Two Detection Methods of Fecal Coliform in Water (Thermotolerant Coliforms )Luo Yun Liuzhou Environmental Protection Monitoring Station, Guangxi 545001Abstract: This paper conducts a comparative test on fecal coliform in water with Defined Substrate Technology(DST) enzyme substrate technique and traditional Multiple-tube fermentation technique and compares the consistency of detection results. The result shows that both methods have a good correlation in the consistency of results and there is no significant difference in statistical sense. Compared to multiple-tube fermentation technique, enzyme substrate technique has such advantages as simplicity, rapidness, accurate result, specificity, low possibility of pollution in the experimental process and secondary pollution avoided.Key words: Defined Substrate Technology(DST) enzyme substrate technique; Multiple-tube fermentation technique; Fecal coliform粪大肠菌群（耐热大肠菌群）是水质污染的重要指标之一。
酶底物法检测水中粪大肠菌群方法验证
酶底物法检测水中粪大肠菌群方法验证摘要：本文对《水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法》HJ1001 -2018、《生活饮用水标准检验方法》GB/T5750-2006进行了方法验证，以评价该两种检测方法是否适用于水中粪大肠菌群的检测工作，以确保该方法能够满足水中粪大肠菌群的测定。
关键词：粪大肠菌群；质控样品。
引言：试样与固定底物酶底物法（DST）采用大肠菌群能产生β—半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄色的原理，来判断水样中是否含耐热大肠菌群，大肠菌群的培养温度是44.5℃。
1.测定方法与参数（注：方法为酶底物法法，参数为质控样品）2.仪器与设备2.1恒温培养箱2.2冰箱2.3高压蒸汽灭菌锅2.4烘箱2.5量筒2.6吸管2.7程控定量封口机2.8 51孔或97孔定量盘2.9无菌水样瓶（100mL）2.10阳性比色盘2.11干热灭菌器3培养基和试剂3.1无菌水3.2科立德（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基。
4.样品的采集和保存4.1采样前准备：4.1.1采样瓶：高压灭菌瓶。
4.2样品采样及注意事项4.2.1将已灭菌和封包好的采样瓶，无论在什么条件下采样时，均要小心开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶子颈部受杂菌污染。
4.2.2在采集江，河湖，库，地表水时，可握住瓶子底部直接将采样瓶插入水中，约距水面10-15厘米时，瓶口朝来水方向，使水样灌入瓶内。
如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直至充满水样为止。
采样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。
采样后，采样瓶内上不应留有一些空隙，一边检验前充分混匀水样。
4.2.3从自来水龙头采集样品时，不要选用漏水的水龙头，采水前可先将水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌或用75﹪酒精溶液消毒水龙头，然后将水龙头打开，放水数分钟后除去水管中的滞流杂质。
采水时控制水流速度小心接入瓶内。
4.2.4在同一采样点进行分层采样时，应自上向下进行，以免不同层次的干扰；同一采样点与理化检测项目同时采样时，应先采集细菌等检验样品，否则样品可能被污染，采样前，不得用水样刷洗采样瓶。
水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌(酶底物法)分析原始记录
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
查表结果 （MPN/100mL）
检测结果 （MPN/L)
备注 XXXX-04-J071
分析人：
校核人：
审核人：
分析日期及时间：
XXXXXX 有限公司
2021 年 09 月 09 日颁布
水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌（酶底物法）分
析原始记录（续表）
培养温度℃培养时间 h 大肠埃希氏菌 黄色 无色
金黄色葡萄球菌 无色
培养温度℃培养时间 h 大肠埃希氏菌 黄色 无色
金黄色葡萄球菌 无色
培养温度℃培养时间 h 大肠埃希氏菌（耐热型） 黄色有荧光 无荧光
产气肠杆菌 无色
样品空白对照
样品编号
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
查表结果
（MPN/100mL）
检测结果
（MPN/L)
样品编号
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
查表结果
（MPN/100mL）
检测结果
（MPN/L)
样品编号
接种量 （mL）
阳性孔数（个） 大孔 小孔
接种量 （mL）
检出限
10MPN/L
采样日期
样品描述
液态色澄清浑浊
样品种类 分析步骤
地表水地下水工业废水 生活污水 其他
环境条件
温度℃；湿度 RH%
1. 样品稀释：根据样品污染程度确定接种量，接种量为 10mL 时，取 10mL 样品加入到盛有
酶底物法系统
西安立科环保科技有限公司水质大肠菌群酶底物法检测系统介绍一、检测用途：酶底物法测定用途：用于检测水中总大肠菌群粪大肠菌群（耐热大肠菌群）和大肠埃希氏菌。
可用于检测水的类型：饮用水、水源水、废水、食品水、地表水、地下水、海水、瓶装水、中水、二次供水、管网水、畜牧用水、医疗用水等。
二、检测原理：酶底物法采用ONPG 和MUG 两种营养指示剂，这两种试剂分别可以被大肠菌群的β-半乳糖苷酶和大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶分解代谢。
当大肠菌群在酶底物检测试剂中生长时，其使用β-半乳糖苷酶分解代谢ONPG，并使样品从无色变为黄色。
大肠杆菌使用β-葡糖醛酸酶分解代谢MUG 时，能够发出荧光。
三、优势特点：酶底物法为GB5750-2006收录的用于大肠杆菌检测标准方法，酶底物法是目前水中大肠杆菌检测的最先进方法，目前在发达国家水质大肠菌群检测分别占到95%和90%的市场，以其方便快捷，假阳性低，适用大量样品快速检测等优点正逐步被国内检测部门所认可。
相对于多管发酵和滤膜法，酶底物法检测步骤大大减少，而且对实验环境要求不高，检测时间可减少到24小时，在日常水样监测及应急监测中具有很好的应用前景，可及时检测，预防，最大限度的减少重大公共安全事故的发生几率。
以GB5750-2006中总大肠菌群测定为例，比较三种方法，如表所示。
表1 多管发酵法、滤膜法及酶底物法比较统计方法优势：1.无需在无菌室内操作。
2.手工操作时间小于1分钟。
3.无需培养基制备和大量玻璃器皿灭菌。
4.24小时即可完成定性定量分析，无需验证试验。
已经列入1.GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法》微生物指标。
产品特点：1.colitech酶底物法检测试剂，LK定量检测盘/定量孔板，LK定量瓶出厂前均已灭菌，客户可以直接放心使用。
2.colitech酶底物法检测试剂是我公司潜心研制并符合GB/T5750.12-2006的酶底物法培养基，假阳性和假阴性均优于传统方法。
固定底物技术酶底物法 技术参数
微生物固定底物技术酶底物法测定仪原理：科立得--DST酶底物法是可在24小时内快速定量和定性检测“总大肠菌群及大肠埃希氏菌及粪大肠菌群”，其原理是利用了MMO-MUG特异性培养基的呈色和荧光反应，该方法比传统的滤膜法和多管法的假阳性和假阴性发生率更低，培养时间更短。
技术特点：1、DST酶底物法试剂完全符合《生活饮用水标准检验方法》的MMO-MUG 培养基，采用固定底物技术（DST）酶底物法，Snap包装。
200个/包。
能够精确检出100ml水样中单个的活性总大肠菌群和大肠埃希氏菌，以及粪大肠菌群，假阴性率低。
每个单位试剂可抑制200万个异养细菌，假阳性率低。
能够消除传统方法中的主观判断影响，准确性高于滤膜法及多管发酵法。
2006年被列入到《生活饮用水标准检验方法》（GB/T5750.12-2006），是国标认可的MMO-MUG培养基；经美国环保署的认可作为24 小时检验出厂水与源水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群（粪大肠菌群）的方法；通过水与废水检验的标准方法分析化学工作者协会 (AOAC) 、国际瓶装水协会 (IBWA) 及欧洲瓶装水协会 (EBWA)认证；中国、美国、加拿大、英国、德国、法国、日本、韩国、阿根廷、巴西、澳大利亚、新西兰、南非等50多国家及地区的饮用水，地表水，污水等检验标准。
年全球使用量超过数千万次，美国90%以上的实验室使用科立得试剂。
2、定量盘Quanti-tray或Quanti-tray 2000定量盘Quanti-tray（51孔定量盘），有50个标准孔格，1个大孔格。
无须稀释可检测200MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群Quanti-tray2000（97孔定量盘），有48个标准孔格，1个大孔格和48个小孔格，无须稀释可检测2419MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群3、无菌取样瓶含10%硫代硫酸钠10ml的无菌取样瓶，可定量100ml水样4、2009D程控定量封口机与符合《生活饮用水标准检验方法》固定底物技术（DST）酶底物法的MMO-MUG培养基配套使用的2009D程控定量封口机。
酶底物法测定水中耐热大肠菌群的方法验证
之 后 的定 量盘 取 出观 察 ，如果 孔 穴 内的水 样变 成黄 色 ，颜 色大 于 等 于 比色 盘颜 色 ，则表 示 该孔 穴 中含 有耐 热 大肠菌 群 。计 算有 黄
不能 对水 体 的卫生 学状 况 作 出快 速 评价 ，制 约其 应用 Ｉ１－２］。因此 ， 采用 快速 简 便的 检测 方法 十 分必 要 。与传 统方 法 相 比， 陶定酶 底
物法 可 以较 好的 弥补 传 统 疗法的 不足 ， 其具 有操 作简 便 易行 ，分 析速度 快 ， 高精 度 ，低 消耗 ，灵 活多 样 的特 点 ，适 用 于完 成大 批 量的 样 品分 析测 试工 作 ，可有 效 提高 水质 中 粪大肠 菌 群测 定 的准
热 大肠 菌群 的方 法 ｆ 。 酶底物 法 采用 ９７孔 定量 盘 ，此方 法是 一种 基于 ＭＰＮ 的方法 。
检 测所 需 水样 为 ｌｏｏ ｍＬ。用 １００ ｍＬ的无 菌取样 瓶量 取 １ｏ０ ｍＬ 水 样 ，加 入试 剂 ，混 摇 均 匀使 之 完全 溶 解 ，将 水 样 全部 倒 入 ９７ 孔 无 菌 定量盘 内， 以手抚 平 定量盘 背 面 以赶 除孔穴 内气泡 ，然 后
【中 图分 类号 】ＴＱ
［文 献标识 码］Ａ
【文 章编 １００７—１８６５（２０１７）１４·００８８—０２
Ｍ ｅｔｈｏｄ Ｖ＿ ｅｒｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｒｍ ｏｔｏｌｅｒａｎｔ Ｃｏｌｉｆｏｒｍ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｄ ｅｔｅｒｍ ｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ Ｗ ａｔｅｒ ｂｙ Ｅｎｚｙｍ ｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
浅述酶底物法快速测定地表水中总大肠菌群与大肠埃希氏菌
浅述酶底物法快速测定地表水中总大肠菌群与大肠埃希氏菌摘要：根据《生活饮用水卫生标准》中对微生物指示菌检测的方法要求，提出采取精确、快速、可靠的总大肠菌群及大肠埃希氏菌检测方法，通过试验方法对比、实际水样检测，比较酶底物法与多管发酵法、滤膜法用于生活饮用水地表水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测结果。
实验结果表明，酶底物法能够快速检测地表水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌，结果精确、快速、可靠，并认为在控制流行疾病的发生传播，从而保障公众健康安全有重要的预报价值和科学意义，同时鉴于我省大多数自来水公司的水质检测还没有增加此方法,建议今后该方法应得到普及和应用。
关键词：总大肠菌群；大肠埃希氏菌；酶底物法我国新的国家《生活饮用水卫生标准》（GB 5749-2006）中对生活饮用水、水源水、地表水等进行卫生评价时，总大肠菌群（Total coliforms）和大肠埃希氏菌（Escherichia coli）是判定水质是否被粪便污染的两个重要指标，尤其是大肠埃希氏菌是粪便污染最有意义的指示菌，已被世界上许多组织、国家和地区使用。
新的国家《生活饮用水卫生标准》中加入大肠埃希氏菌指标，限值为100mL 不得检出大肠埃希氏菌。
并注明：若检出总大肠菌群，必须进行耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌检测。
若水样中检出耐热大肠菌群或大肠埃希氏菌，则说明水质可能受到严重污染，必须采取相应措施。
目前，新国标中对总大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定有三种标准方法，多管发酵法、滤膜法和酶底物法，其中多管发酵法和滤膜法是目前常用的传统检测方法，这两种方法设备简单，试验步骤较为繁琐，对操作人员专业水平要求较高，不利于应急检测，和对水的卫生学状况做出快速评价。
酶底物法检测水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌具有操作方便、快速；干预性结果容易判断等特点，适用于水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的快速检测，对于及时准确的监测饮用水、地表水和水源水粪便污染状况，从而有效预报和控制流行疾病的发生与传播有重要意义。
固定酶底物法测定水中粪大肠菌群的优点及影响因素
环境科学导刊http: //hjkxdk. . cn 2017，36 (5)CN53 -1205/X ISSN1673 -9655固定酶底物法测定水中粪大肠菌群的优点及影响因素杨晓冉，朱超，张付海，胡雅琴，张敏(安徽省环境监测中心站，安徽合肥230061)摘要：使用酶底物法和多管发酵法检测水质中的粪大肠菌群，结果表明，两种方法在统计学上并无 显著差异。
酶底物法具有操作快速简便的优点，检测灵敏度也高于多管发酵法。
酶底物法可以采用成品的 培养基及试剂，操作方便，无需确认试验，20 h即可判断水样中粪大肠菌群的MPN值，实验环境是否无 菌对酶底物法测定水中粪大肠菌群的影响不大，但是培养温度对结果影响较大。
关键词：粪大肠菌群；环境监测；酶底物法；多管发酵法；快速检测；影响因素中图分类号：X83 文献标志码：A文章编号：16乃-9655 (2〇n)05-O O87-〇4粪大肠菌群（Fecalcoliform)主要来自粪便，它在44 ~ 44. 5°C的高温条件下仍可生长繁殖并发 酵乳糖产酸产气，其他特性均与总大肠菌群(Totalcoliform)相同。
因此，可用提高培养温度 的方法造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大 肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。
粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。
目前水中粪大肠杆菌群（耐热大肠菌群）的检测方法主要有传统的多管发酵法和滤膜法，并且 已经列入环保行业标准方法，此两种传统方法被国 内环境检测部门广泛采用。
传统方法实验操做需要 较多的试剂和器材，步骤繁琐，检测周期较长，培 养基保存时间短，阳性结果需验证试验，对实验环 境的无菌程度要求也比较高，不能对水的卫生学状 况做出快速评价，制约了其应用。
固定底物酶底物法利用大肠菌群细菌能产生P -半乳糖苷酶（P-D galactosidase)分解 ONPG (Ortho- nitrophenyl- p - D galactopyranoside)使培养液呈黄色，来判断水样中是否含有大肠菌群、粪大肠菌群（耐热大肠菌群）。
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水中固定底物技术大肠菌群酶底物法检测系统
一、产品技术参数
1.程控定量封口机
用于水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群,肠球菌的检测。
封口速度：51孔/97孔定量检测盘封口时间≤15秒/个
预热时间：≤30min
工作环境温度：-10℃—50℃
工作电压：AC 220V±10%,50Hz
无漏液，无破孔，符合水质大肠菌群酶底物法检测系统生产和销售的质量管理体系文件ISO9001，并要求在中国国家认证认可管理监督委员会中可以查找出。
2.手持式紫外分析仪带暗室（灯箱）
带254,366nm双波长，可手持使用，与暗箱配套方便观察大肠埃希氏菌检测荧光，通过观察孔来判断是否显荧光。
3.酶底物法检测试剂
为完全符合《生活饮用水标准检验方法》的培养基，包装上有可视窗口，便于观察试剂的物理性状判读在保质期内是否能正常使用，有切割口，便于打开而不会有粉末喷溅，每个试剂上有批号，到期时间，在有效使用期内具有可靠的稳定性。
4. 定量检测盘
无漏液，无破孔。
封好的孔格能够耐受一定的压力，不会由于定量盘叠加受力造成孔与孔之间的串连以及破损。
51孔定量检测盘无须稀释可检测200MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群，97孔定量检测盘无须稀释可检测2419MPN/100ml总大肠菌群和大肠埃希氏菌或粪大肠菌群，具有微生物定量检测盘的证明文件。
5. 100ml无菌定量瓶/取样瓶
内含硫代硫酸钠，可中和水中余氯，可定量100ml水样，溶解酶底物检测试剂。
瓶体通透性好，可判读阳性结果。
6. 51孔橡胶垫及97孔橡胶垫
定量检测盘封口时底托。
7. 阳性标准比色盘
每个阳性标准比色盘上都有到期日期、批号，有符合ISO9001质量合格体系的合格证书，用于辨别阳性结果，可以指示颜色变化或荧光变化的最低限。
8. 51孔及97孔定量盘MPN表
可根据定量检测盘阳性孔格数来查询总大肠菌群和大肠埃希氏菌，耐热大肠菌群MPN值，且有95%置信区间。
二、配置清单
1、程控定量封口机一台
2、双波长手持式紫外分析仪带暗室（灯箱）一套
3、酶底物法检测试剂一盒200个
4、51孔、97孔定量检测盘各1箱各100个
5、100ml定量取样瓶一箱200个
6、51孔橡胶垫及97孔橡胶垫各2个
7、51孔、97孔阳性标准比色盘各一个
8、51孔及97孔定量盘MPN表各一张
9、中文操作说明书、操作视频1份
三、售后服务说明
1、操作说明书、操作视频
2、技术服务和培训：卖方须到买方提供的现场免费安装、调试设备，进行操作试验，直至运行正常，为仪器操作人员提供免费的现场操作及维护培训
3、质量保证：测试验收合格后质保1年。