实验二 经口急性毒性试验
经口急性毒性试验
经口急性毒性试验※<(一)目的>化学毒物经口急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。
奉实习的目的是学习急性毒性试验的实验设计原则，学会经口灌胃技术、随机分组方法，掌握主要的LD50计算方法和急性毒性分级标准。
※<(二)原理>选择健康的实验动物，根据体重按随机分组的方法，依据LD50计算的设计原则将动物分成数个染毒组。
一次或24h内多次给予受试物后，了解动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。
※<(三)内容>1．健康小鼠或大鼠的选择，性别的辨认。
2．称重、编号和随机分组方法。
3．受试化学物溶液的配制。
4．小鼠和大鼠经口灌胃操作技术．5．毒性体征的观察、LD50计算和毒性分级※<(四)材料和试剂>1.实验动物健康成年小鼠或大鼠若干只。
2.器材灌胃针(大鼠、小鼠适用)、注射器(0.25，1.2，5m1)、吸管(0. 1，0.2，0.5，1，2，10ml)、容量瓶(10，25，50ml)、烧杯(10，25，50ml)、滴管、电子天平(感应量1／10000g)、动物体重秤、外科剪刀、镊子。
3.试剂受试物(由指导教师自定)，苦味醒酒精饱和液，o．5％品红溶液或其他染色剂．※<(五)操作步骤>1．健康动物的选择。
2．性别辨认。
3.动物称重、编号和分组；(1)称重；称量大、小鼠体重的秤，其感应量需在0.1g以下，并经过校正。
称量时注意轻抓轻放动物，避免激惹，等动物安静后记录体重读数，以g表示。
(2)编号：以染色法编号。
用苦味醒酒精饱和液为染料。
以黄色为个位数号码，红色为十位数号码。
一股以头部为1号，按顺时针依次右前肢为2号，右腰为2号，右后肢为4号，尾根部为5号，右后肢为s号，左腰为7号，左前肢为8号，后背为9号，10号为在头部染红色标记，11号在右前肢染红色和黄色标记各一，依次类推。
急性经口毒性试验
二、急性经口毒性试验Acute Oral Toxicity Test1 范围本规范规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料安全性毒理学检测。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 401, Feb. 1987 )USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines （Series 870.1100, Aug. 1998 )3 试验目的急性经口毒性试验是评估化妆品原料毒性特性的第一步，通过短时间经口染毒可提供对健康危害的信息。
试验结果可作为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其它毒理学试验剂量的依据。
4 定义4.1 急性经口毒性(Acute oral toxicity)：一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的健康损害效应。
4.2 经口LD50（半数致死量，Medium lethal dose）：经口一次给予受试物后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重接受受试物的重量(mg/kg或g/kg)来表示。
5 试验的基本原则以管饲法经口给予各试验组动物不同剂量的受试物，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。
染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。
试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行尸检。
本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但也可用于非啮齿类动物的研究。
6 试验方法6.1 受试物受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中，建议首选水，其次是植物油(如玉米油)，或考虑使用其它介质（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）。
对非水溶性介质，应了解其毒理特性，否则应在试验前先确定其毒性。
每次经口染毒液体的最大容量取决于实验动物的大小，对啮齿类动物所给液体容量一般为1mL/100g，水溶液可至2mL/100g。
通过调整受试物溶液浓度使各剂量组经口染毒的容量一致。
《食品毒理学》经口急性毒性试验
《食品毒理学》经口急性毒性试验一、实验目的和要求掌握给药方法；了解一次或24小时内多次给予受试化学物后，动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试动物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死量。
二、主要仪器设备实验动物：成年昆明系实验小鼠（SPF级别）。
器材：注射器（0.25，1，2，5ml）、吸管（0.1，0.2，0.5，1，2，10ml）、容量瓶（10，25，50ml）、烧杯（10，25，50ml）、滴管、灌胃针12号、动物体重秤、解剖剪刀、镊子、手术手套，口罩。
试剂：受试化合物（氯化钡溶液，20mg/mL）。
三、实验原理氯化钡是强电解质，可完全电离出钡离子，导致钡离子在小鼠血液内部引发急性低钾血症，故小鼠会出现肌无力和发作性软瘫，心肌应激性减低，各种心律失常和传导阻滞，由于肌无力，严重中毒的小鼠还会出现呼吸困难乃至死亡等症状。
四、实验内容1．健康动物的选择和性别鉴定。
2．实验动物称重、编号和随机分组。
3．受试化学物溶液的配制。
4．小鼠灌胃操作技术。
（1）预实验，取小白鼠、称重、随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液，摸索小鼠接近100%和0%死亡的剂量范围。
（2）小鼠随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液。
小鼠灌胃法：将钝头的12号注射针（适用于小鼠），安装在适当容积的注射器上，吸取所需的受试物溶液，左手抓住动物双耳后至背部的皮肤（小鼠仅抓住耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧），将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者。
注意使动物的上消化道固定成一直线。
右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。
若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。
如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免操作穿破食管，甚至误人气管，导致动物立即死亡。
经口急性毒性试验.
大小鼠标记方法（单色法n>10）
双 色 法
大小鼠标记方法（双色法n<10）
红色表示十位数： 头部染红色为10
左前肢为20
左腰部为30 黄色表示个位数。 大小鼠标记方法（双色法n>10）
其它标记方法
烙印编号法：
体内埋号编号法：
耳孔编号法：
挂牌编号法：
实验动物的随机分组
表1 动物随机分组表 动物号 随机数字 除6余数 分组 动物号 随机数字 除6余数 分组 1 97 1 A 16 27 3 C 2 74 2 B 17 7 1 A 3 24 0 F 18 36 0 F 4 67 1 A 19 7 1 A 5 62 2 B 20 51 3 C 6 42 0 F 21 24 0 F 7 81 3 C 22 51 3 C 8 14 2 B 23 79 1 A 9 57 3 C 24 89 5 E 10 26 2 B 25 73 1 A 11 42 0 F 26 16 4 D 12 53 5 E 27 76 4 D 13 32 2 B 28 62 2 B 14 37 1 A 29 27 3 C 15 32 2 B 30 66 0 F
组 别 A B C D 1 2 7 26 4 5 9 27 14 8 16 鼠 号 17 10 20 19 13 22 23 15 29 25 28
E
F
12
3
24
6 11 18 21 30
具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的现有动物数，即： 56/7(7为A组现动物数)整除，余数为0，将A组第7只动物(25号)调配给D组；下一 个：50/6(6为A组现有动物数)余2，将A组第2只动物(4号)调配给D组；接下来 26/6(6为C组现有动物数)余2，将C组第2只动物(9号)给D组。余类推，最后调整
急性经口毒性试验(二)
急性经口毒性试验（二）4.3.1.1 预实验按照受试物的性质和已知资料,选用下述办法：普通多采纳100mg/kg体重，1000mg/kg体重和10000mg/kg体重的剂量,各以2只～3只动物预试。
按照24h内死亡状况,估量LD50的可能范围，确定正式实验的剂量组。
也可容易地挺直采纳一个剂量，如215mg/kg体重,用5只动物预试。
观看2h内动物的中毒表现。
如中毒体征严峻,估量多数动物可能死亡，即可采纳低于215mg/kg体重的剂量系列进入正式实验;反之中毒体征较轻,则可采纳高于此剂量的剂量系列。
如有相应的文献资料时可不举行预试。
4.3.1.2 正式实验 4.3.1.2.1 动物数普通每组10只动物,雌雄各半。
4.3.1.2.2 常用剂量系列由于剂量间距较为小，所以结果较为精确。
普通实验时，可按照上述剂量系列设计5个组，即较本来的办法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组，这样在查表时简单得出结果。
4.3.1.2.3 观看观看期内记录动物死亡数、死亡时光及中毒表现等,按照每组死亡动物数和所采纳的剂量系列，查表求得LD50。
4.3.2 限量法(Iiinit test) 4.3.2.1 适用范围该办法适用于有关资料显示毒性微小的或未显示毒性的受试物,赋予动物一定剂量的受试物,仍不浮现死亡。
4.3.2.2 动物数普通选20只动物,雌雄各半。
4.3.2.3 剂量普通选用剂量起码应为10.0g/kg体重，如剂量达不到10.0g/kg体重，则赋予动物最大剂量(最大用法浓度和最大灌胃体积)。
4.3.2.4 观看赋予受试物后，观看期内无动物死亡,则认为受试物对某种动物的经口急性毒性耐受剂量大于某一数值,其LD50大于该数值。
假如动物浮现死亡应挑选其他办法。
4.3.3 上-下法(up-down procedure,UDP) 4.3.3.1 适用范围该办法主要适用于纯度较高、毒性较大、摄入量小且在赋予受试物后动物1d～2d内死亡的受试物,对预期赋予受试物后动物在5d及以后死亡的受试物不适用。
乙醇小鼠急性经口毒性评价
六、急性毒性分级和评价：
急性毒性试验求出LD50(LC50）值，通过LD50(LC50）值进行 急性毒性分级，评价化学物的急性毒性强弱，比较化学物的 急性毒性大小。 联合国世界卫生组织（WHO）推荐了一个5级标准。
表3-1
WHO急性毒性分级
我国2003年颁布实施的《食品安全性毒理学评价程序和方法》中 提出急性毒性分级的6级标准
四、霍恩氏(Horn)法
原理：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Horn氏法，又叫平均移动法、剂量递增法，是利用剂 量对数与死亡率(反应率)的转换数(即机率单位)呈直线 关系而设计的方法。
100%
Mortality %
Probit Units
Cumulative distribution
Probit transformed
7 5
50
LD50
0
Log Dose
3
Straight line (easier to analyze)
Log Dose
设 计 原 则:
4个剂量组； 每组动物数相等； 每组5只； 剂量可选用两个剂量系列，其组距分别为2.15倍和3.16 倍。 查表求LD50及其95％可信限。
霍恩氏（Horn）法LD50值计算用表
用5个剂量时，
LDk的可信限= log-1(logLDk + 1.96 S ) (P=0.95) X ----为对数剂量； i-----为相邻两组剂量比值（以高剂量组为分子）的对数； y-----为死亡率相应的机率单位（查附表）； 1、2、3、4、5…为小剂量组到大剂量组的顺序。 yK----为LDk所相当的反应率的机率单位 W----为权重系数（查表）
0.0 0.2 0.5 0.7 0.9 1.59
经口急性毒性试验
实验动物编号标记方法
① ○ ⑧ ②
⑦ ⑨ ③
● ⑥ ⑤ ④
标记部位和对应 的号码
48号鼠标记方法 48号鼠标记方法 ●表示十位 ○表示个位
实 验 步 骤
实验动物 预实验
确定大致的 LD0和LD100
秤体重
编号
分组
组数和剂量 （随机数字表法） 随机数字表法）
灌胃操作
中毒症状观察和死亡纪录
计算LD 计算LD50
体重记录(g)
组 染毒剂量 动物编 性 体重 染毒 别 (mg/kg) 号 别 (g) 时间
……
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
计算LD 计算LD50
（寇氏法） 寇氏法）
lgLD50=1/2Σ(Xi + Xi+1)(Pi+1 - Pi) Σ(X i+1 i+1
式中: 式中:（Xi + Xi+1）为相邻两个试验组剂量之和 为相邻两组死亡率之差。 (Pi+1 - Pi)为相邻两组死亡率之差。
确定组距的方法 确定组距的方法
lgLD100 – lgLD0 d = n-1 式中： 式中： d：为组距 n：为设计时确定的剂量组数
急性毒性实验记录
受试物 名称： 提供单位： 动物种属品系： 动物来源： 相对湿度： 染毒剂量： mg/kg 合格证号：
症状 死亡 及出现时间 时间
染毒途径： 室温：
实验目的
1.掌握化学物毒性评价试验方法 1.掌握化学物毒性评价试验方法 2.掌握经口灌胃技术 2.掌握经口灌胃技术 3.学习中毒症状观察方法。 3.学习中毒症状观察方法。 学习中毒症状观察方法
材料和试剂
•实验动物：健康小鼠 实验动物： 实验动物 •器 器 材： 小鼠灌胃针、 小鼠灌胃针、电子天平 动物体重计、 动物体重计、外科剪刀和镊子 •试 试 剂：受试物
经口急性毒性试验
经口急性毒性试验经口急性毒性试验是一种广泛使用的实验室动物毒性试验，它通常用于评价新化合物、生物制品等物质的毒性，以及评估安全使用剂量的潜在结果。
这篇文章将介绍经口急性毒性试验的背景、方法、注意事项和限制。
背景方法经口急性毒性试验通常使用小鼠、大鼠、兔子或其他哺乳动物，动物必须年龄相似、体重相当且健康状态良好。
实验中使用不同剂量的测试物质来确定它们在动物体内的毒性。
通常，实验中使用的剂量量较低，但有时也会使用较高的剂量以便观察更加严重的毒性反应。
其实验流程如下：1.选取合适且健康的实验动物，检查其体内和体外健康状况；2.确定实验剂量，并将物质以食物、水、灌胃管等方式交予动物口服；3.观察动物的外观、行为和症状，记录观察结果；4.在一定时间后继续观察动物，在必要时应用适当的护理；5.按照实验协议的规则处理动物，以确保其安全。
注意事项在进行经口急性毒性试验时，需要注意以下几点：1.确定剂量：需要选择适当的实验剂量，以确保所测试的物质不会对动物造成过度毒性反应，且可以解释毒性的分级。
2.采取恰当的动物保护措施：对于实验过程可能造成疼痛或不适的情况，应采取适当的保护措施，例如提供充足的饮水、合适的饲料和温度环境。
3.保证实验数据质量：为了确保实验数据质量，需要在实验过程中跟踪记录、分析数据，并确定实验的有效性以及物质毒性分级的准确性。
限制虽然经口急性毒性试验是一种有效的毒性评估方法，但它有一定的局限性。
经口急性毒性试验只能评估物质对动物的急性毒性反应，而对于慢性毒性、免疫毒性或生殖毒性等长期影响，它并不能提供完整的信息。
此外，每种动物特征不同，对物质的敏感程度也会不同，因此难以将实验结果适用于不同品种的动物和不同的物质评估。
因此，除经口急性毒性试验外，还需要完善其他的毒性评估方法以更准确地评估药物、化学物质和其他物质的毒性。
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毒理学实验二经口急性毒性试验
1、实验目的
1、掌握实验动物分组方法
2、测定LD50的试验设计原则
3、小鼠的经口灌胃技术
二、试剂和材料
1、实验动物：
（1）动物品种：健康成年ICR小鼠，体重18g～22g
（2）样品来源：首都医科大学实验动物部
2、器材：注射器（1ml）、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。
3、试剂：敌敌畏（1400mg/ml）、苦味酸染液（标记用）。
3、实验内容
1、健康实验动物的选择和性别鉴定
选择健康的雄性小鼠（健康标准：毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。
动物出现圆圈动作可能为中耳炎，废弃。
）
肛门与生殖孔距离：大者为雄性，小者为雌性
2、实验动物称重、编号和随机分组
选择体重在18-22 g的小鼠，采用随机分组的方法（动物按体重分为几个体重段，再从每个体重段分出各组动物），每组10只小鼠，用黄色的苦味酸饱和液标号1~9,10号小鼠不标记。
3、受试化学物溶液的配制
（1）确定灌胃量：0.1ml/10g
（2）确定最高给药量，计算溶液浓度，估计给药总体积
（3）药品称量及稀释
4、小鼠灌胃技术
左手固定，右手持灌胃器，插入动物口腔，沿咽后壁徐徐插入食道，深度为口腔至剑突的距离。
5、毒性体征的观察和LD50计算
（1）毒性体征的观察：
染毒后注意观察小鼠中毒的发生、发展过程及死亡数和死亡时间
按表格记录动物体征及出现时间，记录死亡情况及时间，观察期为30 min
（2） LD50的计算：
a、实验各组剂量的确定：设5组，每组雌雄动物各10只。
剂量组距 d 为：
d为相邻两个剂量组剂量对数之差
利用lgLD0依次加d，取反对数，即可得出各组剂量。
b、LD50的计算（见附件）：
C、求半数致死量的95%可信区间
4、实验过程
1、人员分工：本次实习同学分两个大组(A组和B组)，分别在不同实验室。
每大组分5个小组，分别处理雌雄动物，每小组10只动物。
集体活动：1、 2、 3、 4、5 组各1人，进行受试物配制。
各小组活动：
每小组1人（共4人），进行动物标记。
（1-10号）
每小组1人（共4人），进行体重记录。
（1-10号）
每小组1人（共4人），进行灌胃。
（1-10号）
每小组1人（共4人），根据体重吸取受试物（0.1ml/10g）
5、剂量设计及受试物配制表
见附件
六、实验结果
1、急性经口毒性试验原始记录（见附件）
2 、LD50计算表（见附件）
3、结果计算（按照ppt中所给的剂量设计及受试物配制表计算）
=(lg500-lg100)÷4=（0.6990-2）÷4=0.1747
=0.1747× =0.0316
=2.1747-
1/2×（（0+0.35）+（0.35+0.2）+（0.2+0.65）+（0.65+1））
=1.8777
即：65.4335~87.0162mg/Kg
7、实验结论与分析
1、毒性物质敌敌畏为中等毒性，体重在18~22g之间的雄性健康成年ICR 小鼠（来源于首都医科大学实验动物部）经口急性染毒的
为65.4335~87.0162mg/Kg。
2、毒性特征：小鼠在经口染毒后短时间内出现抽搐，躁动不安，麻痹，肌张力松弛，反应减弱，同时伴有呼吸加快，口吐白沫，鼻孔溢液，尿失禁，腹泻等症状，然后在10分钟左右死亡。
3、本组小鼠为径口染毒的最低剂量，没有出现死亡小鼠，观察过程中，6号小鼠出现亢奋，8号小鼠出现腹泻症状。
4、经过上述症状，可以看出敌敌畏急性毒性包括中枢神经系统与躯体感觉和运动系统毒性，呼吸系统毒性，消化系统毒性，泌尿毒性。